This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.
In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and –sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.
Herbicidresistens i ukrudt udgør en alvorlig trussel mod den globale produktion af fødevarer og fibre 1,2. I øjeblikket tusindvis af resistente populationer og biotyper fra over hundrede ukrudtsarter verdensplan er blevet dokumenteret og studeret 3. En væsentlig mekanisme, der giver herbicidresistens i planter er ændringen af herbicid target-site gener og proteiner, herunder genetiske mutationer, der påvirker herbicid-proteinbindende kinetik eller amplifikation af target-site-gen 2. Metabolisk afgiftning via forhøjede aktiviteter af cytochrom P450 monooxygenase (P450) eller glutathion S transferase (GST) enzymer er en anden mekanisme, som giver herbicidresistens i ukrudt, som er forskellig på flere måder fra target-site-mekanismer 2. Metabolisk-baserede modstand har betydelige konsekvenser for, om planter fitness omkostninger (aka fitness sanktioner) kan resultere fra herbicid-resistens mechanism, samt om potentialet for en enkelt afgiftning mekanisme til at bibringe tvær- eller flere herbicidresistens i ukrudt populationer 1,2,4. Generelt kan herbicid metabolisme i planter opdeles i tre særskilte faser 5. Fase I involverer herbicid konvertering eller aktivering, såsom P450-medieret hydroxylering af aromatiske ringe eller alkylgrupper, eller ved N – eller O- dealkyleringsprodukter reaktioner, der fører til øget polaritet og delvis herbicid afgiftning 5,6. Nyligt indførte funktionelle grupper i fase I kan give sammenkædning websteder for konjugering til reduceret glutathion ved GST'er eller glucose ved UDP-afhængige glycosyltransferaser i fase II 5,7. For eksempel, de store oprindelige metabolit primisulfuronmethyl i majs er hydroxy-primisulfuronmethyl 8, som yderligere kan metaboliseres til hydroxy-primisulfuron-glucosid (fase II) og derefter transporteres til vacuolen til opbevaring langvarig eller yderligere metabolisk probejdning 5,6 (fase III).
Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) er en vanskelige at kontrol, tokimbladede årlige ukrudtsarter, der hindrer produktionen af majs (Zea mays), sojabønne (Glycine max), og bomuld (Gossypium hirsutum) i USA. Den høje grad af genetisk diversitet waterhemp lettes ved sin tvebo biologi og langdistance-vind bestøvning, og en enkelt kvindelig waterhemp plante kan producere op til en million frø 9. Disse frø er små og let spredes, hvilket naturligvis udstyre waterhemp med en effektiv spredningsmekanisme. Waterhemp viser løbende spiring hele vækstsæsonen 9, og dens frø er i stand til at spire efter flere års dvale. Waterhemp er en C4 plante, der har en højere vækstrate end de fleste bredbladet ukrudt i dyrkede dyrkningssystemer 10. Desuden har mange waterhemp populationer er resistente over for multiple families af herbicider 3.
En population af waterhemp (betegnet MCR) fra Illinois er resistent over for 4-hydroxy-phenylpyruvate dioxygenase (HPPD) hæmmende herbicider 11, såsom mesotrion, samt atrazin og acetolactatsyntase (ALS) hæmmende herbicider, herunder primisulfuronmethyl på grund af ikke-mål-site mekanismer 12,13. En anden population af waterhemp betegnet ACR 14, som er primisulfuronmethyl-resistente (som følge af en mutation i ALS-genet) og atrazin-resistente, men følsomt over for mesotrion, og en waterhemp population udpeget WCS 14, der er følsom over for primisulfuronmethyl, mesotrion, og atrazin blev anvendt i sammenligning med MCR i vores tidligere forskning 12 og aktuelle forsøg (opsummeret i tabel 1). Indledende undersøgelser ikke påvise ændringer i HPPD gen sekvens eller ekspressionsniveauerne eller reduceret mesotrion optagelse i MCRbefolkning sammenlignet med mesotrion følsomme befolkningsgrupper 12. Men metabolisme med hele planter viste signifikant lavere niveauer af forældre mesotrion herbicid i MCR i forhold til ACR og WCS, som korreleret med tidligere fænotypiske svar til mesotrion 11,12.
Waterhemp Befolkning | Forkortelse | Fænotype mesotrion | Mesotrion Resistance Mechanism | Fænotype primisulfuron | Primisulfuron Resistance Mechanism |
McLean County-Resistant | MCR | Resistent | Metabolisme * | Resistent | Metabolisme |
Adams County-Resistant | ACR | SenSitive | – | Resistent | Target-site mutation i ALS 14 |
Wayne County-Sensitive | WCS | Følsomme | – | Følsomme | – |
* Ikke-target-site resistensmekanismer, bortset forbedret stofskifte, kan også bibringe mesotrion modstand i MCR befolkning 12.
Tabel 1: Beskrivelse af waterhemp populationer fra Illinois anvendt i denne undersøgelse.
Ud over at bestemme satserne for herbicid metabolisme i intakte waterhemp kimplanter, blev en anden eksperimenterende tilgang udviklet og anvendt i vores tidligere forskning for at undersøge metabolisme ved hjælp af en udskåret waterhemp blad assay 12 samt forskellige P450-hæmmere (f.eks tetcyclacis og malathion). Denne fremgangsmåde blev tilpasset specielt til waterhemp fra en tidli-skellige undersøgelse af primisulfuronmethyl metabolisme i udskåret majs blade 15, da det udskårne blade assay endnu ikke var blevet rapporteret for udførelse herbicid metabolisme forskning i en tokimbladet plante. Den organophophosate insekticid malathion er ofte blevet brugt til in vivo og in vitro herbicid-metabolisme forskning for at angive P450 engagement 16. For eksempel, tolerance og hurtig metabolisme af mesotrion i majs skyldes P450-katalyseret ring hydroxylering, som blev kontrolleret, når malathion øget følsomhed over for majs mesotrion 17. Tilsvarende malathion hæmmede metabolisme af ALS-hæmmer primisulfuron-methyl i udtaget majs blade 15. En stor fordel ved den udskårne blade teknik er, at data, der genereres er uafhængige af hel-plante translokation mønstre, at en vigtig faktor at overveje ved vurderingen metabolisme af systemiske, postemergente herbicider i planter. Derfor er denne metode tillader kvantitativ ogkvalitative metaboliske analyser til at fokusere på en enkelt behandlet blad 12.
En vegetativ kloning strategi, i kombination med det udskårne blade protokollen, er tidligere anvendt i waterhemp at gennemføre metabolismeundersøgelser 12. På grund krydsningspotentiale natur waterhemp (separat mandlige og kvindelige planter), og høj grad af den genetiske mangfoldighed inden for tvebo Amaranthus arter 9, denne protokol sikres, at genetisk identiske waterhemp kimplanter blev analyseret inden for tidsforløbet eksperimenter. Denne artikel viser nytten af det udskårne blade metode til måling satser herbicid metabolisme i en tokimbladet ukrudt (waterhemp). Mængden af forælder herbicid resterende blev bestemt ved hvert tidspunkt (figur 1) ved ikke-lineær mindste kvadraters regressionsanalyse, og er udstyret med et simpelt første ordens kurve med henblik på at estimere tiden for 50% af det absorberede herbicid til at nedbryde ( DT 50). Repræsentantkromatogrammer fra omvendt fase højtydende væskekromatografi (RP-HPLC) vises for ALS-resistente og -følsom waterhemp populationer, der angiver forsvinden forælder herbicid og samtidig dannelse af polære metabolit (ter) i en tidsforløbet undersøgelse (figur 2). Fokus i vores artikel er at beskrive og demonstrere anvendeligheden af det udskårne blade analysen i kombination med en vegetativ kloning metode til bestemmelse præcise og reproducerbare satser for herbicid metabolisme i tokimbladede planter, ved hjælp af ensartet ring-mærket (URL- 14C) herbicider i tre waterhemp befolkninger, der adskiller sig i deres hel-plante reaktioner på HPPD- og ALS-hæmmende herbicider (tabel 1).
Den heri beskrevne udskåret-blad metode er blevet anvendt tidligere i forskning primisulfuron metabolisme i majs blade 15, men vores resultater viser, at denne protokol er også effektiv, nøjagtig og reproducerbar til måling herbicid metabolisme i en tokimbladede ukrudtsarter 12. En stor fordel ved den udskårne blade teknik i forhold til hel-plante undersøgelser er, at en udskåret blad er uafhængig af hel-plante translokation mønstre af postemergent, systemiske herbicider eller forskelle i …
The authors have nothing to disclose.
We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.
Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 mL tubes |
Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 mL tubes |
Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 mL, sterile |
Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |