This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.
In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and –sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.
Herbicideresistentie in onkruid vormt een ernstige bedreiging voor de wereldwijde productie van voedsel en vezels 1,2. Momenteel duizenden van resistente bevolking en biotypen van meer dan honderd wiet soorten wereldwijd zijn gedocumenteerd en onderzocht 3. Een belangrijk mechanisme dat herbicide resistentie in planten is de verandering van herbicide doel- ter genen en eiwitten, met inbegrip van genetische mutaties die herbicide-eiwit binding kinetiek of amplificatie van het target-gen ter 2 beïnvloeden. Metabole ontgifting via de verhoogde activiteiten van cytochroom P450 monooxygenase (P450) of glutathion S-transferase (GST) enzymen is een ander mechanisme dat herbicideresistentie in onkruid, dat verschilt op verschillende manieren van target-locatie-gebaseerde mechanismen 2 verleent. -Metabolische gebaseerde verzet heeft belangrijke gevolgen voor de vraag of planten fitness kosten (aka fitness sancties) kan het gevolg zijn van het herbicide-resistentie mechanism, alsmede over de mogelijkheden voor een enkele detoxificatie mechanisme om cross- of meerdere herbicideresistentie in onkruidpopulaties 1,2,4 verlenen. In het algemeen, kunnen herbicide metabolisme in planten worden onderverdeeld in drie fasen 5. Fase I omvat herbicide conversie of activering zoals P450-gemedieerde hydroxylering van aromatische ringen of alkylgroepen of door N – of O- dealkylering reacties, wat leidt tot verhoogde polariteit en gedeeltelijke herbicide ontgifting 5,6. Nieuw geïntroduceerde functionele groepen in Fase I koppeling plaatsen voor conjugatie kunnen bieden aan gereduceerd glutathion met GST of glucose door UDP-afhankelijke glycosyltransferases in Fase II 5,7. Bijvoorbeeld, grote initiële metaboliet van primisulfuron-methyl in maïs hydroxy-primisulfuron-methyl 8, die verder kan worden omgezet in hydroxyl-primisulfuron-glucoside (fase II) en vervolgens getransporteerd naar de vacuole voor langdurige opslag of verdere metabolische proverwerking 5,6 (Fase III).
Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) is moeilijk te control, tweezaadlobbige jaarlijkse onkruidsoorten die de productie van maïs (Zea mays), sojaboon (Glycine max), en katoen (Gossypium hirsutum) in de Verenigde Staten belemmert. De hoge mate van genetische diversiteit van waterhemp wordt vergemakkelijkt door zijn tweehuizig biologie en lange afstand wind bestuiving, en een vrouwelijke waterhemp plant kan produceren tot een miljoen zaden 9. Deze zaden zijn klein en gemakkelijk verspreid, wat natuurlijk begiftigen waterhemp een effectieve verspreiding mechanisme. Waterhemp toont continu kieming gedurende het groeiseizoen 9, en de zaden kunnen ontkiemen na enkele jaren van kiemrust. Waterhemp is een C 4 plant die een hoger groeipercentage dan de meeste breedbladige onkruiden in akkerbouw teeltsystemen 10 bezit. Daarnaast waren er talrijke waterhemp populatie resistent zijn tegen meerdere famIlies herbiciden 3.
Een populatie van waterhemp (aangeduid MCR) vanaf Illinois is tegen 4-hydroxy-fenylpyruvaat dioxygenase (HPPD) -inhibiting herbiciden 11, zoals mesotrione, alsmede atrazine en acetolactaatsynthase (ALS) -inhibiting herbiciden, waaronder primisulfuron-methyl , als gevolg van niet-target-site op basis mechanismen 12,13. Een andere populatie waterhemp aangewezen ACR 14, die primisulfuron-methyl-bestand (als gevolg van een mutatie in het ALS-gen) en atrazine-resistent maar gevoelig voor mesotrione en een waterhemp populatie aangewezen WCS 14 die gevoelig is voor primisulfuron-methyl, mesotrione en atrazine werden vergeleken met MCR in ons eerder onderzoek 12 en actuele experimenten (samengevat in tabel 1). Eerste studies niet veranderingen in de HPPD gensequentie of expressie niveaus, of verminderde opname mesotrione detecteren, in de MCRpopulatie vergelijking met mesotrione-gevoelige populaties 12. Echter, het metabolisme studies met hele planten aangetoond aanzienlijk lagere niveaus van de ouder mesotrion herbicide in MCR vergelijking met ACR en WCS, die gecorreleerd zijn met eerdere fenotypische reacties op Mesotrione 11,12.
Waterhemp Bevolking | Afkorting | Fenotype Mesotrione | Mesotrione resistentiemechanisme | Fenotype primisulfuron | Primisulfuron resistentiemechanisme |
McLean County-Resistant | MCR | Resistente | Metabolisme * | Resistente | Metabolisme |
Adams County-Resistant | ACR | SENSITive | – | Resistente | Target-website mutatie in ALS 14 |
Wayne County-Sensitive | WCS | Gevoelig | – | Gevoelig | – |
* Niet-target-terrein resistentie mechanismen, anders dan verbeterde stofwisseling, kan ook verlenen mesotrione weerstand in de MCR bevolking 12.
Tabel 1: beschrijving waterhemp populaties van Illinois in deze studie.
Naast het bepalen van de tarieven van herbicide metabolisme in intacte waterhemp zaailingen, werd een verschillende experimentele benadering ontwikkeld en toegepast in lopende onderzoek metabolisme onderzoeken met behulp van een uitgesneden waterhemp bladassay 12 en verschillende P450 remmers (bijv tetcyclacis en malathion). Deze methode is specifiek aangepast voor waterhemp een Previlende onderzoek primisulfuron-methyl metabolisme in weggesneden maïs laat 15, omdat de weggesneden blad test nog niet gemeld voor het uitvoeren van herbicide metabolisme onderzoek in een tweezaadlobbige plant. De organophophosate insecticide malathion is vaak gebruikt voor in vivo en in vitro-metabolisme herbicide onderzoek P450 betrokkenheid 16 geven. Bijvoorbeeld, tolerantie en snelle metabolisme van mesotrione in maïs zijn te wijten aan P450-gekatalyseerde ring hydroxylering, die werd gecontroleerd toen malathion verhoogde gevoeligheid maïs mesotrione 17. Ook malathion remde het metabolisme van de ALS-remmer primisulfuron-methyl in weggesneden maïs laat 15. Een belangrijk voordeel van het uitgesneden blad techniek is dat gegevens die onafhankelijk zijn van gehele plant translocatie patronen, een belangrijke factor om te overwegen bij het beoordelen metabolisme van systemische herbiciden na het opkomen in planten. Derhalve maakt deze werkwijze kwantitatief enkwalitatieve metabole analyses te richten op één behandeld blad 12.
Een vegetatieve kloneringsstrategie, in combinatie met het uitgesneden blad protocol, is eerder gebruikt in waterhemp tot metabolismeonderzoeken 12 voeren. Vanwege de aard van uitkruising waterhemp (aparte mannelijke en vrouwelijke planten), en de grote mate van genetische diversiteit binnen tweehuizig Amaranthus soorten 9, dit protocol ervoor gezorgd dat genetisch identieke waterhemp zaailingen werden geanalyseerd binnen het tijdsverloop experimenten. Dit artikel toont de bruikbaarheid van het uitgesneden blad werkwijze voor het meten van snelheden van herbicide metabolisme in een dicotyl onkruid (waterhemp). De resterende hoeveelheid bovenliggende herbicide werd bepaald op elk tijdstip (figuur 1) door niet-lineaire kleinste kwadraten regressie-analyse, en werd geschikt met een eenvoudige eerste orde curve voor de schatting van de tijd tot 50% van de geabsorbeerde herbicide te breken ( DT 50). Vertegenwoordigerchromatogrammen van omgekeerde fase hoge prestatie vloeistofchromatografie (RP-HPLC) worden getoond voor ALS-bestendige -gevoelige waterhemp populaties, waarbij de verdwijning van bovenliggende herbicide en gelijktijdige vorming van polaire metabolieten (s) geven gedurende een tijdsverloop studie (figuur 2). De focus van het artikel is het beschrijven en demonstreren van de bruikbaarheid van het uitgesneden blad assay in combinatie met een vegetatieve klonen werkwijze voor het bepalen nauwkeurige en reproduceerbare snelheden van herbicide metabolisme in dicotyle planten, met behulp gelijkmatig ring gemerkt (URL- 14 C) herbiciden waterhemp drie populaties die verschillen in hun hele plant reacties op HPPD- en ALS-remmende herbiciden (tabel 1).
De uitgesneden blad hierin beschreven werkwijze is eerder gebruikt in onderzoeken primisulfuron metabolisme in maïs bladeren 15, maar onze resultaten tonen aan dat dit protocol ook doeltreffend, nauwkeurig en reproduceerbaar te meten herbicide metabolisme in een tweezaadlobbige onkruidsoorten 12. Een belangrijk voordeel van het uitgesneden blad techniek vergeleken met hele plant studies is dat een uitgesneden blad onafhankelijk is van de hele plant translocatie patronen postemergence, systemische …
The authors have nothing to disclose.
We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.
Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 mL tubes |
Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 mL tubes |
Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 mL, sterile |
Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |