We present an automated modular high-throughput-method for the identification and characterization of microbial exopolysaccharides in small scale. This method combines a fast preselection to analyze the total amount of secreted polysaccharides with a detailed carbohydrate fingerprint to enable the fast screening of newly isolated bacterial strains or entire strain collections.
कई सूक्ष्मजीवों उत्पादन और exopolysaccharides (ईपीएस) है, जो चिकित्सा क्षेत्र, खाद्य अनुप्रयोगों में या पेट्रो-रसायन आधारित के प्रतिस्थापन में महत्वपूर्ण प्रभाव है स्रावित करने में सक्षम हैं। हम एक तरल हैंडलिंग प्रणाली है कि प्रकार और सूक्ष्मजीवों द्वारा उत्पादित ईपीएस की राशि का तेज और विश्वसनीय विश्लेषण की अनुमति देता है पर स्वचालित किया जा करने के लिए एक विश्लेषणात्मक मंच का वर्णन है। यह उपयोगकर्ता के उपन्यास प्राकृतिक माइक्रोबियल exopolysaccharide उत्पादकों की पहचान करने और उच्च throughput (हिंदुस्तान टाइम्स) में एक दिन के भीतर इसी पॉलिमर के कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट का विश्लेषण करने के लिए सक्षम बनाता है। इस मंच का उपयोग करना, तनाव संग्रह के रूप में अच्छी तरह से तनाव वेरिएंट की पुस्तकालयों कि इंजीनियरिंग दृष्टिकोण में प्राप्त किया जा सकता है की जांच की जा सकती है। मंच के एक मॉड्यूलर सेटअप है, जो दो प्रमुख भागों में प्रोटोकॉल के एक जुदाई की अनुमति देता है। सबसे पहले, वहाँ एक स्वचालित स्क्रीनिंग प्रणाली है, जो अलग-अलग polysaccharide का पता लगाने के मॉड्यूल को जोड़ती है: viscosit की एक अर्द्ध मात्रात्मक विश्लेषणएक centrifugation कदम, शराब वर्षा के माध्यम से बहुलक गठन के एक विश्लेषण और एक फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड परिवर्तन के माध्यम से कुल कार्बोहाइड्रेट सामग्री के निर्धारण के माध्यम से y गठन। यहाँ, यह रन प्रति 384 उपभेदों अप करने के लिए स्क्रीन करने के लिए संभव है। दूसरे भाग में दो अनिवार्य मॉड्यूल के संयोजन से पहले भाग में पहचान की सभी चयनित ईपीएस उत्पादकों के लिए एक विस्तृत विश्लेषण प्रदान करता है मोनोसैकराइड: अति उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से पूरा मोनोमर संरचना के विश्लेषण अल्ट्रा वायलेट और electrospray आयनीकरण आयन जाल का पता लगाने (के साथ युग्मित UHPLC-यूवी ईएसआई एमएस) और एक बहुलक substituent (पाइरूवेट ketal की उपस्थिति) एंजाइमी ऑक्सीकरण के माध्यम से है कि एक रंग के गठन के लिए युग्मित है के रूप में पाइरूवेट का निर्धारण। सभी इस स्क्रीनिंग मंच के विश्लेषणात्मक मॉड्यूल अलग अलग तरीकों से जोड़ा और व्यक्तिगत आवश्यकताओं के लिए समायोजित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, वे सब मैन्युअल संभाला या एक तरल हैंडलिंग प्रणाली के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है। इस प्रकार, स्क्रीनिंग पीएलएtform आदेश विभिन्न ईपीएस की पहचान करने में एक बड़ा लचीलापन सक्षम बनाता है।
माइक्रोबियल exopolysaccharides (ईपीएस) पॉलिमर कि विभिन्न जैविक कार्यों को पूरा करने के लिए एक संरचनात्मक रूप से अत्यधिक विविध समूह हैं। वे आम तौर पर जटिल दोहराने इकाइयों, जो monomers के विभिन्न प्रकार (चीनी, चीनी डेरिवेटिव, चीनी एसिड), इन monomers और उनके प्रतिस्थापन के बीच बांड द्वारा प्रतिष्ठित हैं के लिए बनाया जाता है। माइक्रोबियल polysaccharides के संरचनात्मक विविधता इस अणु वर्ग है, जो खाद्य 1 की तरह अलग अलग क्षेत्रों में अपने आवेदन की अनुमति देता है, सौंदर्य प्रसाधन 2,3, निर्माण रसायन शास्त्र 4 या 5 जल उपचार के सदस्यों को नहीं बल्कि अलग विशेषताओं प्रदान करता है। आगे इन जैव आधारित है और इस तरह के स्थायी पॉलिमर उपन्यास प्राकृतिक माइक्रोबियल polysaccharides की पहचान के रूप में अच्छी तरह के रूप में संरचनात्मक वेरिएंट की इंजीनियरिंग आशाजनक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है के आवेदन के क्षेत्र का विस्तार। बहरहाल, एक तेजी से स्क्रीनिंग विधि जल्दी से उनके व्यापार के लिए माइक्रोबियल उपभेदों की एक बड़ी संख्या को स्कैन करने की आवश्यकता हैआर polysaccharide गठन, और उनके उत्पादों का विश्लेषण करने के लिए। इसलिए, हम हाल ही में प्राकृतिक वियोजन या इंजीनियर तनाव वेरिएंट कि monomeric रचना 6 की पहचान शामिल है, से माइक्रोबियल polysaccharide उत्पादन के विश्लेषण के लिए एक 96 अच्छी तरह से हिंदुस्तान स्क्रीनिंग मंच विकसित किया है।
~ 500 प्राकृतिक वियोजन की पहली स्क्रीनिंग दौर के लिए इस मंच को लागू करने के लिए हमें ईपीएस उत्पादन करने में सक्षम होने के रूप में के बारे में केवल 10 अलग नस्लों के 20% करने के लिए की पहचान करने की अनुमति दी (डेटा) नहीं दिखाया। इसका मतलब यह है कि विश्लेषण किया स्ट्रेन के 80-90% की शर्तों के तहत आवेदन किया ईपीएस उत्पादन नहीं किया था, और इसलिए, विस्तृत कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट का एक और विश्लेषण आवश्यक नहीं था। monomeric रचना के इस अत्यधिक परिष्कृत पहचान के रूप में एक समय लेने वाली प्रक्रिया है, विशेष रूप से डेटा विश्लेषण के लिए, एक तेजी से पूर्व स्क्रीनिंग विधि उपभेदों ईपीएस उत्पादन में सकारात्मक पहचान करने के लिए काफी दक्षता में वृद्धि होती है। इसके अलावा, अभिकर्मकों,UHPLC-यूवी ईएसआई एमएस में उपभोग्य और माप समय कम हो जाएगा। इसके अतिरिक्त, विभिन्न विश्लेषणात्मक मॉड्यूल, जबकि एक हाथ पर विधि अत्यंत विश्वसनीय बनाने, दूसरे हाथ समानांतर में दो से अधिक 96 अच्छी तरह से प्लेटों के मैनुअल हैंडलिंग उलझी पर हैं, और इस तरह के रूप में विधि की पूरी क्षमता को सीमित। इन कारणों के लिए, हम एक स्वचालित स्क्रीनिंग प्लेटफार्म विकसित करने का निर्णय लिया। इसलिए, हम absorbance के माप के आधार पर कुल चीनी सामग्री की एक पूरी तरह से स्वचालित तेजी से पता लगाने की विधि के साथ मौजूदा कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट तकनीक की मॉड्यूलर प्रारूप संयुक्त।
फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड पद्धति अभी भी बैक्टीरियल और संयंत्र polysaccharides 7.8 की कुल कार्बोहाइड्रेट सामग्री की तेजी निर्धारण के लिए पसंद की विधि का प्रतिनिधित्व करता है। इस विधि के पहले 96 अच्छी तरह प्लेटें 10,11 में भी छोटे पैमाने के लिए, ड्यूविस एट अल। 9 से वर्णित है और विभिन्न अनुप्रयोगों और नमूना आकार के लिए अनुकूलित किया गया था। PheNol-सल्फ्यूरिक एसिड विधि, एक मूल्य द्वारा कुल कार्बोहाइड्रेट सामग्री के उपाय सभी monomeric, oligomeric और नमूनों की बहुलक कार्बोहाइड्रेट summating।
खाते में इन पहलुओं को लेते हुए एक उपयुक्त खेती मध्यम की पसंद इस पद्धति लागू करने के लिए आवश्यक है। जटिल मीडिया oligomeric या खमीर निकालने की तरह बहुलक कार्बोहाइड्रेट युक्त यौगिकों एक बदल बहुलक सामग्री के लिए नेतृत्व कर सकते हैं और इसलिए, सख्ती से बचा जाना चाहिए। इसके अलावा, शर्करा की उच्च मात्रा उपभेदों की खेती के लिए सी-स्रोत के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। खेती की प्रक्रिया से शेष कार्बोहाइड्रेट के उच्च स्तर पर नकारात्मक ईपीएस सामग्री की माप के साथ हस्तक्षेप कर सकता है।
इसलिए, परिभाषित और शुद्ध शर्करा के उपयोग की सलाह दी है। हमारे प्रयोगों में हम कोशिकाओं की खेती के लिए ग्लूकोज का इस्तेमाल किया। खेती के बाद शेष ग्लूकोज एक जेल निस्पंदन के माध्यम से कम और एक ग्लूकोज-परख के माध्यम से निर्धारित किया गया था। अंत में, ग्लूकोज बराबरpolysaccharides के रों कि फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड विधि के साथ पाया गया था कुल कार्बोहाइड्रेट सामग्री से जेल छानने के बाद शेष ग्लूकोज घटाकर द्वारा गणना की गई। जेल निस्पंदन और फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड विधि के साथ संयोजन में ग्लूकोज-परख विश्वसनीय परिणाम सुनिश्चित करने और हमारे पहले, पूरी तरह से स्वचालित पहचान प्रणाली से किया जा रहा करने में सक्षम हैं।
वर्षा और चिपचिपाहट में वृद्धि का अवलोकन: दो नई विश्लेषणात्मक मॉड्यूल ईपीएस-पहचान प्रणाली से जानकारी की मात्रा में वृद्धि करने के लिए स्वचालित स्क्रीनिंग मंच में शामिल थे।
कई अलग अलग ईपीएस – जैसे succinoglycan, जिंक और colonic एसिड 12 – पर चीनी पदों सी 4 और C6 एक गैर कार्बोहाइड्रेट पाइरूवेट ketal के साथ संशोधित होने की सूचना है। उन पाइरूवेट ketals (बस के रूप में succinyl आधा एस्टर और uronic एसिड) polyanionic प्रकृति के लिए योगदान करते हैं और इसलिए, शारीरिक prope के लिएद्विसंयोजक केशन पुलों 13 के माध्यम से बातचीत से बहुलक का rties। आदेश में उन विशेष पॉलिमर की पहचान करने में पाइरूवेट के निर्धारण के लिए एक और अतिरिक्त विश्लेषणात्मक मॉड्यूल के रूप में स्थापित किया गया था। यह polysaccharide substituents और उनके संभावित स्थूल संपत्तियों के बारे में जानकारी बढ़ जाती है।
सभी मॉड्यूल के संयोजन अलग ईपीएस की पहचान के रूप में अच्छी तरह से ईपीएस उत्पादकों में से एक तेज और कुशल दृढ़ संकल्प सक्षम बनाता है। उस दृष्टिकोण से स्क्रीनिंग मंच के दो प्रमुख भागों (चित्रा 1) में विभाजित किया जा सकता है। स्वचालित स्क्रीनिंग (भाग मैं) कार्यप्रवाह पूरी तरह से स्वचालित होता है के भीतर (तालिका 1) जल्दी से उपभेदों उत्पादन ईपीएस पहिले से चयन करने के लिए। कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट विश्लेषण (भाग द्वितीय) मात्रात्मक चुने हुए उपभेदों द्वारा उत्पादित ईपीएस की मोनोमर संरचना निर्धारित करता है। इस प्रकार, डेटा विश्लेषण के क्रम में बड़े तनाव संग्रह की स्क्रीनिंग का अनुकूलन करने में कम से कम किया गया था। इसएक ही स्वचालित स्क्रीनिंग समय में और दो रन है कि प्रति दिन प्रति 768 नस्लों के दिन संभव हो रहे हैं साथ 384 उपभेदों का विश्लेषण करने की संभावना प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट विश्लेषण सभी की पहचान की ईपीएस का एक भी अधिक विस्तृत सिंहावलोकन देता है। यह निर्देश दिया विश्लेषण और ईपीएस की पहले से ही वर्णित रासायनिक संरचना की तुलना में केवल थोड़ा भिन्न ईपीएस वेरिएंट या पूरी तरह से नए लोगों की पहचान के लिए सक्षम बनाता है।
फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड विधि के साथ Polysaccharide का पता लगाने: विभिन्न monosaccharides विभिन्न अवशोषण Maxima और इस विधि के प्रयोग से 9 दाढ़ विलुप्त होने के गुणांक दिखा। इस पॉलिमर, जो अलग अलग मात्रा में कई शर्करा को नियंत्रित के विभिन्न अवशोषण Maxima में यह परिणाम है। 16 विभिन्न व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पॉलिमर के लिए अवशोषण Maxima के विभिन्न तरंग दैर्ध्य DDH 2 हे में 5 तालिका में दिया जाता है। पॉलिमर भंग कर रहे थे (1 जी / एल), हड़कंप मच गया (150 आरपीएम) रातोंरात और फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड-विधि के साथ मापा जाता । Diutan गम 470 एनएम और scleroglucan और hyaluronic एसिड 484 एनएम पर उच्चतम में सबसे कम अवशोषण Maxima दिखाया। इन परिणामों के आधार पर 480 एनएम इस स्क्रीनिंग मंच के लिए चुना गया था। पॉलिमर के सापेक्ष absorbance absorbance 1 जी / एल ग्लूकोज (100% के रूप में सेट) के साथ प्राप्त के आधार पर गणना की गई। सबसे कम परिणाम 92% के साथ scleroglucan और succinoglycan, दोनों के साथ प्राप्त किया गया। इस ऍक्स्प थाected क्योंकि scleroglucan केवल ग्लूकोज होता है और succinoglycan 7 के अनुपात में ग्लूकोज और गैलेक्टोज शामिल हैं: 1। दोनों वाणिज्यिक पॉलिमर सुखाने और विभिन्न राख सामग्री के विभिन्न नुकसान है, इस कारण ~ 110% की सैद्धांतिक मूल्य तक पहुँच नहीं किया गया है। Xylan 311% के साथ उच्चतम रिश्तेदार absorbance दिखाया। इस का कारण यह और अधिक प्रभावी furanose फार्म के कारण उच्च दाढ़ विलुप्त होने के गुणांक सिलोज़ से हासिल की है। 0.1 ग्राम / एल ग्लूकोज के स्तर पर मात्रा का ठहराव अंत तक पहुँच गया था, साथ ही एक एकाग्रता <0.05 g / एल पर सीमा का पता लगाने। हालांकि, स्क्रीनिंग में सकारात्मक उपभेदों के लिए सीमा का पता लगाने की तुलना में अधिक 0.7 ग्राम / एल है और इसलिए, परख एक अच्छा प्रदर्शन दिखाया। आदेश विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए, जेल-छानने के बाद शेष ग्लूकोज एक ग्लूकोज-परख के साथ निर्धारित किया गया था और यह मान फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड विधि से मूल्य से घटाया गया था।
स्वचालित ग्लूकोज-परख कमजोर पड़ने प्रदर्शनखेती (कमजोर पड़ने 1: 100) के बाद ग्लूकोज निर्धारण की जांच की गई। इस के लिए, सतह पर तैरनेवाला के 10 μl एक गहरी अच्छी तरह से थाली में DDH 2 हे के 990 μl को हस्तांतरित और दस बार श्वास और इस कमजोर पड़ने से बाहर 180 μl वितरण के माध्यम से मिलाया गया। दूसरा महत्वपूर्ण कदम जेल छानने के बाद ग्लूकोज-परख से 1:10 कमजोर पड़ने के लिए केवल 5 μl विभाज्य का सही pipetting था। आदेश DDH 2 हे के कमजोर पड़ने के 25 μl उत्पन्न करने के लिए एक 50 μl की नोक के साथ पहली बार स्थानांतरित कर दिया गया, DDH 2 हे और 5 μl जेल छानना के बाद में 20 μl एक साथ aspirated थे। इस टिप में से 5 μl विभाज्य का एक बेहतर हटाने सुनिश्चित करता है। दोनों कमजोर पड़ने कदम एक ग्लूकोज-परख के माध्यम से विभिन्न ग्लूकोज मानकों के साथ सत्यापित कर रहे थे। ग्लूकोज सामग्री का निर्धारण करने के लिए 100 कमजोर पड़ने के बाद खेती एक CV & # के साथ दोनों मानकों के लिए उच्च परिशुद्धता दिखाया: दो अनुकरणीय सांद्रता के लिए परिणाम तालिका 6 में दिए गए हैं 1।60; 1.2%। इसी समय, उच्च मानक के लिए सटीकता 11.6 (% त्रुटि) तक गया था। हालांकि, इस नगण्य रूप में ग्लूकोज दृढ़ संकल्प की खेती के बाद ही शेष ग्लूकोज सामग्री का प्रतिनिधित्व करता है और इसलिए, बहुलक का पता लगाने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है। जेल छानने के बाद शेष ग्लूकोज के लिए 1:10 कमजोर पड़ने एक CV <1.4% और एक सटीकता <2.1% त्रुटि के साथ बहुत विश्वसनीय नतीजे बताते हैं।
वाष्पीकरण के विचार: स्क्रीनिंग पहले ग्लूकोज-परख करने के लिए पहला कदम से 3.5 मानव संसाधन की आवश्यकता है। आदेश में इस समय सीमा के नवोदित एमटीपी भंडारण पर एक प्रभाव है कि क्या पता लगाने के लिए, में, ग्लूकोज-परख अंशांकन मानकों के 50 μl के साथ और रोबोट हिंडोला में 3.5 घंटे के लिए कवर के बिना संग्रहीत किया गया। अंशांकन रेंज (45 करने के लिए 4.5 मिलीग्राम / एल) में नमूना एकाग्रता शायद ही वृद्धि हुई है। वृद्धि हुई है – वाष्पीकरण की वजह से – 2.1% नीचे और केवल दो सबसे कम सांद्रता (1.8 और 0.9 मिलीग्राम / एल) यह 12.4% तक पहुँच (लिए किया गया था <strओंग> टेबल 7)।
जेल निस्पंदन: गैर metabolized ग्लूकोज की उच्च मात्रा में hydrolyzed बहुलक से ग्लूकोज की मात्रात्मक का पता लगाने परेशान। इसलिए, एक जेल निस्पंदन कदम खेती के बाद शेष ग्लूकोज को दूर करने के लिए आवश्यक था। इसके अतिरिक्त, जेल निस्पंदन लवण और monomeric कार्बोहाइड्रेट यौगिकों, ग्लूकोज की तुलना दूसरों से सतह पर तैरनेवाला युक्त बहुलक शुद्ध, मोनोमर विश्लेषण में विश्लेषणात्मक पृष्ठभूमि कम से कम। जेल निस्पंदन कदम पर छानना के 35 μl अच्छी तरह से केंद्र में रखा गया था। स्वचालित प्रणाली में जेल निस्पंदन की मजबूती के सत्यापन के लिए, 0.045 से आठ अंशांकन मानकों 9 ग्राम / एल ग्लूकोज के लिए ऊपर filtrated थे (एन = 8)। हर एकाग्रता की ग्लूकोज हमेशा प्रारंभिक मूल्य (तालिका 8) के 95% से अधिक की कमी थी। ऐसा करने में, जेल निस्पंदन ग्लूकोज के विभिन्न सांद्रता के लिए बहुत अच्छा परिणाम दिखाया। इसके अतिरिक्त, शेष ग्लूकोज के बाद जेल-एफiltration भी एक ग्लूकोज-परख के साथ चुना गया और hydrolyzed बहुलक के लिए ग्लूकोज बराबर की सही मात्रा में प्राप्त करने के लिए फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड दृढ़ संकल्प से घटाया गया था।
पाइरूवेट-परख: सबसे पहले, यह जांच की गई निष्प्रभावी और पतला (1:10) हाइड्रोलिसिस कदम से टीएफए मैट्रिक्स enzymatic प्रतिक्रिया के साथ हस्तक्षेप है। इसलिए, पूरी परख दो बार मैट्रिक्स के बिना के साथ एक बार और एक बार प्रदर्शन किया, और विश्वसनीय परिणामों से पता चला था। अंत में, 16 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पॉलिमर के पाइरूवेट सामग्री सफलतापूर्वक मापा गया था और 3 चित्र में दिखाया गया है। यह आम तौर पर जाना जाता है कि उन 16 पॉलिमर के बाहर केवल succinoglycan और जिंक स्वाभाविक रूप से पाइरूवेट होते हैं। हमारे पाइरूवेट-परख के साथ पॉलिमर के इन दोनों को सही ढंग से पहचान की गई। scleroglucan में, welan गम और xylan पाइरूवेट भी काफी मात्रा में पाया गया था। कुल मिलाकर, दृष्टिकोण की क्षमता मान्य किया गया था और पाइरूवेट-परख रोंएक उच्च प्रदर्शन howed। यह हाइड्रोलिसिस के बाद विभिन्न पॉलिमर में पाइरूवेट पता लगाने में सक्षम साबित हुई।
कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट: स्वचालित स्क्रीनिंग में सभी विश्लेषणात्मक मॉड्यूल प्रदर्शन के बाद, संभावित ईपीएस उत्पादकों कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट विश्लेषण के लिए चयन किया गया था। इसके लिए कई मानदंड लागू किया गया है: 1) चिपचिपापन के सकारात्मक अवलोकन centrifugation के बाद और / या छानने के बाद। 2) वर्षा से पहले और छानने के बाद। मनाया फाइबर और गुच्छे सकारात्मक रूप में मूल्यांकन किया गया। 3) फिनोल-सल्फ्यूरिक एसिड विधि से ग्लूकोज बराबर मूल्य। मान> 700 मिलीग्राम / एल सकारात्मक रूप में मूल्यांकन किया गया था और 300 और 700 मिलीग्राम / एल के बीच मूल्यों ख्यात ईपीएस उत्पादकों के रूप में मूल्यांकन किया गया। दो या तीन मानदंडों सकारात्मक रूप में मूल्यांकन किया गया है, उपभेदों आगे कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट विश्लेषण के लिए चयन किया गया था। मानदंड ईपीएस स्क्रीनिंग (जैसे कम चिपचिपापन ईपीएस) के अलग-अलग उद्देश्य के प्रति अनुकूलित किया जा सकता है। हमारा दृष्टिकोण effici खोजने के उद्देश्य सेईएनटी उत्पादकों EPS। जब उपभेदों कि केवल ईपीएस की छोटी मात्रा में उत्पादन के लिए खोज ग्लूकोज बराबर के मूल्यांकन लिमिट कम किया जाना चाहिए।
तकनीकी लाभ और भविष्य के आवेदन: इस प्रोटोकॉल का एक दिलचस्प सुविधा कदम और विभिन्न विश्लेषणात्मक मॉड्यूल की मॉड्यूलर चरित्र है। वे अलग अलग तरीकों से जोड़ा जा सकता है व्यक्तिगत आवश्यकताओं के लिए निकाला जाता है और उपन्यास मॉड्यूल को आसानी से लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए इसके अलावा, विश्लेषणात्मक मॉड्यूल, अलग से इस्तेमाल किया जा सकता एचटी-पीएमपी-derivatization मॉड्यूल के साथ संयोजन में हाइड्रोलिसिस मॉड्यूल 96 अच्छी तरह प्रारूप में अलग बहुलक समाधान (1 जी / एल) से एक मोनोमेरिक संरचना विश्लेषण प्रदर्शन करने में सक्षम है। एक तरल हैंडलिंग प्रणाली पूरा स्क्रीनिंग pipetting योजना में किसी भी बदलाव के बिना मैन्युअल नियंत्रित किया जा सकता करने के लिए उपयोग किए बिना प्रयोगशालाओं के लिए। हालांकि, एक तरल से निपटने प्रणाली का उपयोग करने के लिए ऊपर 768 उपभेदों (के बजाय 192 उपभेदों यदि screene को throughput बढ़ जाती हैप्रति दिन मैन्युअल डी)। प्रोटोकॉल है कि यहाँ वर्णित है अलग पीढ़ी के लिए एक स्क्रीनिंग में सक्षम है और इसलिए, बड़े तनाव संग्रह उपन्यास ईपीएस उत्पादकों की पहचान करने और एक दृष्टिकोण (चित्रा 4) में उनके कार्बोहाइड्रेट फिंगरप्रिंट का विश्लेषण करने की स्क्रीनिंग के लिए। इसके अलावा, fucose की तरह दुर्लभ शर्करा, uronic एसिड या यहां तक कि अज्ञात शर्करा युक्त polysaccharides के लिए एक लक्षित स्क्रीनिंग विस्तृत मोनोसैकराइड विश्लेषण के माध्यम से किया जा सकता है। इसके अलावा, परिभाषित अनुपात में विभिन्न चीनी संयोजन का पता लगाया जा सकता है। यह पहले से ही ज्ञात ईपीएस या उपन्यास ईपीएस के संरचनात्मक रूप से संबंधित वेरिएंट की सरल पहचान सक्षम बनाता है।
The authors have nothing to disclose.
We sincerely thank Thomas Howe and Jörg Carsten for the programming and technical support with the liquid handling systems.
96 well deep well plate 2.0 mL (DWP) | Greiner Bio-One | 780271 | Main-culture (CP 1-1 to 1-4), equilibration plates for gel-filtration (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7), 1:100 dilution for the glucose assay (CP 4-1 to 4-4) containing 990µl of ddH2O |
Breathable Sealing Film | Axygen | BF-400-S | Incubation film for pre- and main-culture DWP |
Aluminum Sealing Film | Axygen | PCR-AS-200 | -80 °C storage film for glycerol-stock plates |
MCA96 Nested Disposable Tips 200 µl | TECAN | 30038619 | Worktable position (WTP 2-1 to 2-4) |
A/B glass-filter-plate 1µm | Pall Corporation | PN 8031 | Stored on collector plate (CP 2-1 to 2-4) |
96-well micro titer plate V-Bottom | Greiner Bio-One | 651201 | Collector plate for filtration plate (CP 2-1 to 2-4) |
96-well SpinColumn G-25 | Harvard Apparatus | 74-5612 | Stored on washing DWP (CP 1-6, 1-7, 2-6 and 2-7) |
96-well micro titer plate V-Bottom | Nunc | 249944 | Collector plate for gel-filtration plate (CP 3-1 to 3-4) |
Nested Disposable Tips SBS 50 µl tips | TECAN | 30038609 | Carousel position (CP 4-6, 4-7 and 5-1 to 5-6) |
Trough 250 ml | Axygen | Res-SW96-HP | Water WTP 1-1, Glucose assay reagent-mix WPT 1-2, ammonium-acetat buffer pH 5.6 (CP 5-7) |
96-well micro titer plate F-Bottom (MTP) | Greiner Bio-One | 655101 | precipitation 1 (CP 6-1 to 6-4), pH-value (CP 7-1 to 7-4), precipitation 2 (CP 8-1 to 8-4), phenol-sulfuric-acid method (CP 8-5 to 8-8), glucose-assay (CP 9-1 to 9-9), dummy plates (WTP 3-1, 3-2) |
96-well silicon cap mat | Whatmann | 7704-0105 | Cover mat for MTP |
200 µl pipette tips | Sarstedt | 70.760.002 | For manually handling |
1000 µl pipette tips | Sarstedt | 70.762 | For manually handling |
96-well-PCR micro titer plate | Brand | 781350 | Hydrolysis, PMP-derivatisation |
TPE (thermoplastic elastomer) cap mat | Brand | 781405 | Hydrolysis, PMP-derivatisation |
Filter plate 0.2 µm Supor, | Pall Corporation | PN 8019 | Filtration of samples for UHPLC-ESI-MS analysis with a MTP collector plate |
Pipette Tips LHS 5-300 µl | Brand | 732150 | Brand LHS system |
ABTS (2.2-azino‑bis-(3‑ethylbenzthiazoline)-6-sulfonic acid) | Sigma-Aldrich | A1888 | Glucose-assay |
Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | Glucose-assay |
Horseradish peroxidase | Sigma-Aldrich | P6782 | Glucose-assay, pyruvat-assay |
DA-64 (N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4.4'-bis(dimethylamino)-diphenylamine sodium salt) | Wako Chemicals GmbH | 043-22351 | Pyruvat-assay |
Pyruvate oxidase | Sigma-Aldrich | P4591 | Pyruvat-assay |
Potassium phosphate dibasic | Carl-Roth | P749.3 | Pyruvat- and glucose-assay |
Potassium phosphate monobasic | Carl-Roth | 3904.3 | Pyruvat- and glucose-assay |
Thiamine pyrophosphate | Sigma-Aldrich | C8754 | Pyruvat-assay |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 31413 | Pyruvat-assay |
2-Propanol | VWR | 20922.466 | Precipitation |
Phenol | VWR | 20599.231 | Phenol-sulfuric-acid method |
Sulfuric acid | Carl-Roth | 4623.4 | Phenol-sulfuric-acid method |
Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | Hydrolysis |
Ammonium solution | Carl-Roth | P093.1 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
Ethanol absolut | VWR | 20821.321 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
Phenol red | Alfa Aesar | B21710 | Hydrolysis, PMP-derivatization |
1-Phenyl-3-methyl-5-pyrazolone | Sigma-Aldrich | M70800 | PMP-derivatization |
Methanol LC-MS | VWR | 83638.320 | PMP-derivatization |
Acetonitril LC-MS | VWR | 83040.320 | PMP-derivatization |
Acetic acid | Sigma-Aldrich | 338826 | PMP-derivatization, |
Ethanol absolut | VWR | 20821.321 | PMP-derivatization |
Methyl red | Alfa Aesar | 36667 | pH-value |
Robotic liquid handling system | Tecan | Freedom EVO | Worktable setup in Figure 2 |
Liquid handling station LHS | Brand | 709400 | Worktable setup in Figure 2 |
Tip-Adapter | Brand | 709434 | Worktable setup in Figure 2 |
Liquid Ends MC 20-300µL | Brand | 709416 | Worktable setup in Figure 2 |
Adapter 60mm | Brand | 709430 | Worktable setup in Figure 2 |