Abstract
La barrera epitelial es la primera defensa innata del tracto gastrointestinal y regula selectivamente el transporte desde el lumen a los compartimentos de tejido subyacente, lo que restringe el transporte de moléculas más pequeñas a través del epitelio y casi prohíbe completamente el transporte macromolecular epitelial. Esta selectividad se determina por la capa de gel mucoso, lo que limita el transporte de moléculas lipófilas y tanto los receptores apicales y apretado complejos de proteínas de unión del epitelio. Modelos in vitro de cultivo de células del epitelio son convenientes, pero como modelo, que carecen de la complejidad de las interacciones entre la microbiota, mucosa-gel, el epitelio y el sistema inmunológico. Por otra parte, la evaluación in vivo de la absorción intestinal o la permeabilidad se puede realizar, pero estos ensayos miden la absorción gastrointestinal en general, sin ninguna indicación de especificidad de sitio. Ex vivo usando ensayos de paso de "sacos intestinales"; son un método rápido y sensible de la medición de ya sea la integridad intestinal en general o el transporte comparativo de una molécula específica, con la ventaja adicional de especificidad de sitio intestinal. Aquí se describe la preparación de sacos intestinales para estudios de permeabilidad y el cálculo de la aparente permeabilidad (app P) de una molécula a través de la barrera intestinal. Esta técnica se puede utilizar como un método de evaluación de la absorción del fármaco, o para el examen disfunción de la barrera epitelial regional en modelos animales de la enfermedad gastrointestinal.
Introduction
La barrera epitelial intestinal del tracto gastrointestinal es un área de superficie de la mucosa se estima en 400 m 2 en el adulto humano. En consecuencia, se expone constantemente a desafiar a partir de microbios, fármacos ingeridos, nutrientes y toxinas bacterianas. El anfitrión no sólo debe distinguir entre las bacterias comensales tolerables y patógenos potenciales, pero debe evitar que estas especies y sus moléculas secretadas de atravesar la barrera epitelial, mientras que al mismo tiempo que permite la absorción de nutrientes. Por lo tanto, el papel del epitelio intestinal es actuar como una barrera selectiva a los contenidos luminales 1. Esto se consigue, en parte, por el sistema de defensa innata epitelial en la mucosa, que actúa a través de un sistema biológico sensible que consiste en mecanismos constitutivos e inducibles 2.
La pérdida de la función de la barrera epitelial es una patología que es característica de un número de enfermedades gastrointestinales. In vivoexamen de la función de barrera epitelial puede ser evaluada a través de una sonda nasogástrica de una molécula del marcador, y su posterior análisis del suero 3. Sin embargo, esta técnica no ofrece ninguna indicación en cuanto al sitio de la disfunción de la barrera. In vitro y ex vivo evaluación de la resistencia transepitelial utilizando sistemas Transwell 3 y cámaras Ussing 4,5 respectivamente, se emplean comúnmente como marcadores indirectos de la función de la barrera epitelial, pero carecen de la fisiología de la enfermedad contribuyendo de modelos animales 6. En este protocolo se describe un modelo de preparación de tejido ex vivo que permite la evaluación directa y localizada de la integridad intestinal y que puede utilizarse para evaluar la función barrera de la mucosa en un número de niveles. Es importante destacar que esta técnica puede aplicarse a modelos animales de enfermedad, o puede ser manipulado para permitir farmacológicamente en interrogatorio profundidad de disfunción de la barrera de la mucosa.
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Protocol
Todo el trabajo con animales en este protocolo se realiza con estricto apego a la Universidad de Newcastle Comité de Ética Animal procedimientos aprobados.
1. Preparación de los instrumentos, medios de cultivo y Platos
- Pre-caliente de medios 199 (TC199) o de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) medios de comunicación a 37 DO. Pre-oxigenar el medio por burbujeo con 95% de O2 / 5% de CO 2. Comprobar que el medio tiene un pH final de 7,3.
- Prepara sutura cortando dos secciones 5 cm para cada salida. Bucle de las suturas en un nudo sin cerrar.
2. La disección y preparación del Tracto Gastrointestinal
- Retirar el alimento sólido de 12 horas antes de la eutanasia. Si se desea, colocar los animales sobre los suplementos de gel de nutrientes durante este tiempo.
- La eutanasia a los ratones mediante una sobredosis de pentobarbital sódico ([200 mg / Kg], inyección intraperitoneal), seguido por dislocación cervical de acuerdo con la ética proto institucionalcols y rocían 70% de etanol en el abdomen y el tórax.
- Usando unas tijeras, hacer una incisión horizontal en el centro del abdomen y exponer el peritoneo.
- Proceder para separar y eliminar el tracto gastrointestinal por el corte de la parte superior del intestino desde el estómago en el esfínter pilórico y cortar el intestino grueso en el margen anal. Utilice unas pinzas para eliminar cuidadosamente el mesenterio. Coloque el tracto intestinal en pre-calentado, medio oxigenado.
- Identificar la sección del intestino que deben evaluarse para la permeabilidad (Figura 1) y se corta esta sección libre del resto del tracto intestinal.
- Con el fin de mantener la coherencia entre los animales, medir secciones de duodeno y el yeyuno en relación con el estómago, y medir secciones del colon y el íleon en relación con el ciego.
- Al seleccionar segmentos de tejido, tenga en cuenta la presencia de los tejidos linfoides asociados a mucosas, tales como placas de Peyer. Estos pueden ser identificados como pequeño guiñoEGLAS en el lado serosal de la luz.
- Usando una jeringa de 1 ml, lavar suavemente el contenido luminal del segmento intestinal en una placa Petri con PBS pre-calentado (37 ° C). Estos contenidos fecales pueden ser descartados o se almacenaron a -80 ° C para el análisis futuro si lo deseas.
3. Preparación de Intestinal Sacs
- Preparar una jeringa de 1 ml con un volumen de 300 l de compuesto de ensayo o molécula. Por integridad de la mucosa, una solución de 1 mg / ml de FITC-dextrano M.Wt. 4400 puede ser utilizado. Las sondas que van de 4,400-70,000 Da de tamaño se pueden usar para una mayor sensibilidad. encajar de forma segura un pequeño catéter vascular de los animales en la jeringa.
- Medida 5 cm de la apertura del segmento intestinal y atar el segmento de seguridad cierran con una sutura de lazo en este punto. Con cuidado, coloque un pre-atado de sutura de lazo alrededor de la abertura del intestino e inserta el catéter despuntada. Tirar de la soga cerrado, así como para asegurar el segmento intestinaly liberar el volumen de 300 l de la jeringa en el intestino, asegurando que se inyecta toda la solución.
- Retire con cuidado el catéter accionando al mismo tiempo el lazo de sutura para asegurar el cierre del saco intestinal. Cortar el saco intestinal suelto en el intestino y colocar en un tubo cónico de 50 ml lleno con 20 ml de medio oxigenado, precalentado a 37 a DO.
4. Medición de la Permeabilidad
- Colocar los tubos cónicos que contienen los sacos intestinales en un baño de agua de calefacción ajustada a 37 DO. A 0, 30, 60, 90 y 120 puntos de tiempo min, tomar una muestra de 100 l desde el tubo cónico y la transferencia a una placa de 96 pocillos, en sustitución del volumen con 100 l de medio fresco en cada caso.
- Después de que se haya tomado la muestra final, cortar sacos abiertos en el punto de sutura y abajo de la longitud del segmento, la exposición de la superficie de la mucosa.
- Medir la longitud y la anchura de cada segmento intestinal. Si desirojo, broche congelar los segmentos y almacenar a -80 ° C para la proteína o el análisis bioquímico, o, alternativamente, almacenar en solución de estabilización de ARN para análisis moleculares.
- Construir una curva estándar de diluciones de registro de moléculas marcadas con FITC van de 1 a 1 x 10 -6.
- medir las muestras y estándares para FITC en un lector de placas de fluorescencia, FITC excitación / emisión: 495 nm / 519 nm.
5. Cálculo de la permeabilidad aparente para cada individuo intestinal Sac
- Convertir unidades de tiempo de segundos.
- Para cada punto de tiempo, calcular la concentración acumulativa, Q
Q t = (C * t V r) + (Q t suma * V s), Donde:
Q t = concentración acumulativa en el tiempo t
C t = concentración en el tiempo t
V r = Volumen en el lado del receptor
Q t = suma Suma de todos los Q anterior t
= V svolumen muestreado - Parcela Q en función del tiempo (T) y calcular la pendiente: δQ / dt
- Se calcula la permeabilidad aparente (P app)
P = aplicación (δQ / dt) / (A * Co), donde:
A = área de tejido
C 0 = concentración inicial
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Representative Results
Este protocolo puede ser usado para examinar los cambios regionales en función de la barrera intestinal en modelos animales de enfermedad gastrointestinal. Al medir el flujo de una sonda paracelular a través de la superficie de la mucosa a diferentes áreas del tracto gastrointestinal 7, la integridad de las uniones estrechas epiteliales se puede evaluar. Además, mediante la variación de la naturaleza de la sonda paracelular por tamaño (Figura 2) o hidrofobicidad (Figura 3), el grado de perturbación epitelial, o la integridad de la capa de gel mucoso, también puede ser medido. El empleo de marcadores más grandes de peso molecular permite una interrogación más sensible de la permeabilidad paracelular de la mucosa, la detección de cambios discretos, que pueden no ser evidentes por mediciones electrofisiológicas tales como resistencia eléctrica transepitelial (TEER), pero que sea suficiente para permitir el transporte paracelular (Figura 2). mucosal inflamación puede conducir a una pérdida de células caliciformes y reducción del gel mucoso protector que normalmente recubre y protege la interfaz epitelial. El uso de sondas hidrofóbicas, la integridad de la capa de gel mucoso intestinal también puede ser examinado (Figura 3). Además, integridad de la barrera regional puede ser examinado a través de la preparación específica de los sacos intestinales de diferentes áreas intestinales. Los cambios regionales en la función de barrera varían dentro de los diferentes modelos animales de la enfermedad y, por tanto, el uso de sacos intestinales permite una evaluación localizada de la función de barrera intestinal (Figura 4), en comparación con una sonda oral de sondas y el ensayo de suero posterior.
Figura 1. Esquema del tracto gastrointestinal murino. Un diagrama esquemático del tracto gastrointestinal de un ratón C57BL / 6, desde el estómago hasta tél ano. Las pequeñas uniones intestinales no pueden diferenciarse fácilmente macroscópicamente y muestreo consistente ayuda a minimizar el ratón a la variación del ratón. A los efectos de la creación de sacos intestinales, a 5 cm del segmento distal al esfínter pilórico abarcará el duodeno. Una sección de 10 cm que se extiende proximalmente desde el ciego abarcará el íleon. El pequeño tejido intestinal restante representa yeyuno. El recto se encuentra a 2 cm proximal al ano, con el intestino grueso restante, que se extiende hasta el ciego que representa el colon 8. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Transporte paracelular dependiente del tamaño de las moléculas de FITC-dextrano a pesar de la mucosa epitelial en el control y la colitis DSS ánimals. sacos intestinales se prepararon a partir de los dos puntos de ratones DSS 10 días en el curso de la enfermedad. Sacs se cargaron con medidas durante 120 min 1 mg / ml de solución de FD-4 (MW 4400 Da), FD-20 (MW 20.000 Da) o FD-70 (70.000 Da) y el flujo del marcador de permeabilidad FITC-dextrano. Edad emparejado animales sanos se utilizaron como controles. N = 5, 2 repeticiones técnica por N. ** p <0,01, prueba t de Student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. La influencia de la capa mucosa-gel sobre la integridad de barrera para compuestos hidrófobos. Sacos intestinales se prepararon a partir de los dos puntos de ratones DSS 10 días en el curso de la enfermedad. Edad emparejado animales sanos se utilizaron como controles. Para el control de mucosa-gel negativo, los intestinosse cargaron con 10 mM N-acetil cisteína (NAC) (300 l por volumen de 5 cm de intestino) y se incubaron a 37 ° C durante 15 min y se lavó abundantemente con medio fresco antes se prepararon sacos. Sacs se cargaron con solución de 1 mg / ml de FD-4 (MW 4400 Da) y el flujo medido durante 120 min. N = 3, 2 repeticiones técnica por N. * p <0,05, ** p <0,01, prueba t de Student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. La permeabilidad regional del intestino para FD-4 en modelos murinos de inflamación intestinal. Intestinal sacos se prepararon a partir del yeyuno, íleon o colon de animales sanos, animales DSS o animales (AID) disbiosis inducida por antibióticos. Sacs se cargaron con 1 mg / ml de solución de FD-4 (MW 4400 Da) y flux mide durante 120 min. N = 3, 2 repeticiones técnica por N. * p <0,05, ** p <0,01, prueba t de Student. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aquí, hemos detallado el aislamiento y la preparación de los sacos intestinales para evaluar la función barrera de la mucosa ex vivo. preparaciones saco intestinal principalmente se han utilizado en la investigación farmacéutica, el examen de la absorción de los fármacos candidatos a través del intestino. Sin embargo, este ensayo es igualmente bien adecuada para el estudio de la enfermedad intestinal. la permeabilidad intestinal puede variar considerablemente según la región y la evaluación específica del sitio de la permeabilidad permite una mejor comprensión de la importancia regional de la integridad de la mucosa en las enfermedades digestivas. El ensayo es robusto y bajo las condiciones fisiológicas correctas, tejidos aislados permanecen viables durante un máximo de 6 horas post mortem. Después de la eutanasia, la velocidad de la preparación del tejido es importante y el intestino se debe lavar de su contenido transferido a un medio oxigenado lo más rápidamente posible. Con el fin de garantizar la coherencia entre los animales, es esencial que las regiones intestinales son correctos identified (Figura 1). Se aconseja que los segmentos del colon e íleon se miden desde el ciego, mientras que los segmentos de duodeno y el yeyuno se miden desde el estómago. Debido a que diferentes cepas, modelos o animales transgénicos pueden ser más grandes, y tienen GITS más largos, vale la pena la caracterización de la longitud media o cada segmento intestinal en el modelo antes de participar en los ensayos de permeabilidad.
Además de la consistencia regional, es importante para garantizar que cada saco intestinal se corta a la misma longitud y el saco se llena con el volumen correcto de fluido. La inconsistencia en estos factores resultará en desigual distensión de la mucosa entre ensayos. Sub-distensión del segmento intestinal no sólo reduce la exposición de los contenidos luminales a la superficie mucosa, pero también aumenta el espesor del tejido a través del cual debe viajar el marcador. El exceso de distensión del segmento puede dañar el tejido o activar de estrés-respuesta en el tejido, lo que podría confounding resultados. Cabe señalar, que para el cálculo de P aplicación no tiene en cuenta el área de superficie de la estructura de las vellosidades. Mientras que esto conduce a un error en el cálculo de la permeabilidad aparente real del tejido, que no afecta a los resultados comparativos entre los modelos, como el área de superficie se calcula como una constante. Cualquier cambio en la superficie debido a la enfermedad se ven compensados por la pérdida de la integridad epitelial y el protocolo es suficientemente robusto para identificar cambios en la permeabilidad con la progresión de la enfermedad 6.
Se recomienda el uso de medio de cultivo tisular. En estudios realizados por Barthe et al. Se encontró el uso de TC199 para aumentar significativamente la longevidad de viabilidad epitelial y la arquitectura histológica de tejido, en comparación con los tampones de sal simple 9. En nuestros estudios tanto DMEM y medio TC199 mantuvo a 37 ° C, siempre que las condiciones óptimas para la supervivencia del tejido 5,6,10. Los medios de comunicación correctasuministra el epitelio con los nutrientes necesarios para mantener la integridad del tejido, mientras se mantiene la temperatura durante el ensayo asegura el metabolismo del tejido que es óptima la integridad de la unión apretada esencial y ensayos que implican el transporte activo a través de vías transcelular. Temperaturas por debajo de 37 ° C provocan la pérdida de la viabilidad del tejido, aumentar el transporte paracelular y disminuyendo el transporte transcelular 11. Por lo tanto, la prolongación de la viabilidad del tejido con condiciones óptimas es esencial y, al hacerlo, el ensayo puede ser utilizado no sólo para examinar integridad de la barrera y regional, sino también para examinar los estudios de intervención y las respuestas fisiológicas y transcripcionales.
Aunque se usa principalmente para estudios de absorción de drogas, las técnicas para examinar la permeabilidad aparente (P aplicación) de una molécula marcadora a través de una barrera epitelial son una medida altamente sensible de la integridad intestinal 12-15. En contraste con subrogarse ex vivo MeasureMents de la función de barrera, tales como TEER, P aplicación es una medición directa y altamente sensible de la barrera intestinal 4. Vale la pena señalar que las mediciones de TEER y permeabilidad, medida por la aplicación P de moléculas marcadoras no siempre se correlacionan. Mediciones de TEER abarcan tanto la resistencia de las uniones estrechas y resistencias en paralelo transcellular 16. Por lo tanto TEER es una medida de la resistencia combinada ofrecido por uniones estrechas y las propias células. Si las asociaciones célula-célula son débiles (es decir, las uniones estrechas son leaky) a continuación, esta contribución a la resistencia global de una monocapa será bajo. Por lo tanto los pequeños cambios en las resistencias de unión apretados para epitelio con fugas se convierten en cambios insignificantes a las resistencias del epitelio como un todo. En contraste, los ensayos de aplicación P miden la capacidad de una molécula para cruzar la barrera de la mucosa 17 y, de hecho, la sensibilidad de las mediciones P aplicación puede ser alcados a través de la selección de diferentes moléculas marcadoras de tamaño (Figura 1). La consideración de marcador de tamaño es importante en relación con el modelo de la enfermedad intestinal que se examina. Modelos de alergia o enfermedad funcional 18,19, donde la pérdida de la integridad es de leve a moderada, puede ser más adecuado para los marcadores de peso molecular más bajo, lo que permitirá la identificación de los cambios sutiles en la función de barrera intestinal. Por el contrario, con modelos como colitis DSS, que consiste en despojar del epitelio intestinal, marcadores más grandes pueden ser más apropiados para evaluar la cicatrización de la mucosa, como se resaltarán aumentos relativamente pequeños de integridad de la barrera.
Mientras sacos intestinales ofrecen un modelo fisiológicamente relevante de la función barrera de GI, hay algunas limitaciones con respecto a la variabilidad de los modelos animales que necesitan ser considerados. Por ejemplo, el estado secretor o el epitelio pueden influir tanto en el transporte paracelular a través de las INTEStine 20 y la integridad de la capa de gel mucoso 5. Si bien ex vivo ensayos que incorporan mediciones electrofisiológicas, tales como preparaciones cámara de Ussing, puede dar cuenta de esto, sacos intestinales no lo hacen. En segundo lugar, en la preparación de los investigadores sacos intestinales debe dar cuenta de estructuras linfoides, tales como las placas de Peyer, en preparaciones de salida, ya que pueden influir en la permeabilidad del tejido 21. A pesar de estas consideraciones, a diferencia de muchos modelos de cultivo celular, que se utiliza para evaluar la integridad epitelial, los sacos intestinales ofrecen la contribución tanto de una capa de gel mucoso y una lámina propia subyacente. La contribución de la capa de gel mucoso, en particular, puede ser evaluada mediante el uso de agentes mucolíticos, como la N-acetil cisteína, o moléculas trazadoras hidrófobos, tales como dexametasona 5,17. Esto puede ser particularmente importante en la evaluación de la permeabilidad intestinal en modelos de terapia de cáncer o enfermedad inflamatoria del intestino, waquí la pérdida de la barrera mucosa puede ser una patología temprano en la inflamación de la mucosa 22,23. Del mismo modo, en modelos de enfermedad diarreica, enfermedad gastrointestinal funcional o disbiosis, producción de moco intestinal y la integridad general de gel mucosas pueden alterarse en sitios regionales 5,19,24. Sonda oral de los marcadores de permeabilidad y toma de muestras de suero posterior es otra opción para la evaluación de la permeabilidad intestinal in vivo. Si bien este método tiene una mínima manipulación del tejido, que es una medida compuesta de la función de barrera intestinal y no evaluar las contribuciones regionales a la barrera general. Diferentes modelos de enfermedad gastrointestinal es probable que tengan diferentes lugares de importancia relativa, que no se explica por enfoques sonda oral. El uso de sacos intestinales, por lo tanto es un ensayo rápido, sensible y fisiológicamente relevante que puede ser utilizado para examinar la integridad de la mucosa intestinal regional en pequeños modelos animales de enfermedad.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dekantel Non-absorbable Silk suture | Braintree Scientific | SUT-S 116 | |
| Media 199 (TC199) | Life Technologies | 11043-023 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 21063-045 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | Use at 10 mM in media | |
| Small animal vascular cathether: Physiocath | Data Sciences International | 277-1-002 | |
| FITC-Dextran 4,400 MW | Sigma Aldrich | FD-4 | |
| FITC-Dextran 20,000 MW | Sigma Aldrich | FD-20 | |
| FITC-Dextran 70,000 MW | Sigma Aldrich | FD-70 |
References
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