Abstract
上皮屏障是胃肠道的第一先天防御和选择性地调节传输从所述内腔到底层组织区室，限制横跨上皮更小的分子和几乎完全禁止上皮大分子转运的运输。此选择性通过粘膜凝胶层，这限制了亲脂性分子和两个心尖受体和上皮的紧交界蛋白质复合物的运输来确定。 体外细胞培养的上皮的模型是方便的，但作为一种模式，它们缺乏的微生物群，粘液凝胶，上皮细胞和免疫系统之间的相互作用的复杂性。另一方面，可使用“肠囊”进行体内肠吸收或渗透性的评价，但是这些测定法测量总胃肠道吸收，与没有指示点特异性的。 体外通透性测定;是测量任一整体肠完整性或特定分子的比较运输，与肠部位特异性的附加优点的快速和灵敏的方法。在这里，我们描述了肠囊的渗透性编写研究报告和表观渗透率（P 程序 ）的计算 横跨肠屏障的分子。这种技术可以用作评估药物吸收的方法，或审查胃肠疾病的动物模型的区域的上皮屏障功能障碍。
Introduction
胃肠道的肠上皮屏障是在人成年估计在400 米 2的粘膜表面积。因此，不断地暴露从微生物，摄入药物，营养物和细菌毒素挑战。主机必须不仅容许的共生菌和潜在病原体区分，但必须防止从穿越上皮屏障这些物种和它们的分泌的分子，而在同一时间，允许营养物质的吸收。因此，肠上皮细胞的作用是充当选择性屏障的管腔内容1。做到这一点，在部分地通过在粘膜先天性上皮防御系统，它通过包括组成型和诱导机制2响应生物系统的作用。
上皮屏障功能的丧失是病理学是一个数肠胃疾病的特性，在体内上皮屏障功能的检查可通过示踪剂分子的经口管饲，并随后血清分析3进行评估。然而，该技术提供了没有说明的屏障功能障碍的部位。在体外和使用Transwell小系统3分别尤斯灌流室4,5跨上皮电阻体外评估，通常作为上皮屏障功能的替代指标，但缺乏动物模型6的贡献疾病生理学。在这个协议中，我们描述一个离体组织制剂模型，它允许肠道的完整性和可用于在多个级别来评估黏膜屏障功能的直接的和局部的评估。重要的是，这种技术可应用于疾病的动物模型，或可以药理学上操纵以允许的粘膜屏障功能障碍深度询问。
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Protocol
在本协议中所有的动物工作是严格遵守纽卡斯尔动物伦理委员会的大学完成批准程序。
1，仪器，文化传媒和菜品的研制
- 预暖媒体199（TC199）或Dulbecco氏改良的Eagle培养基（DMEM）培养基至37 C。预含氧通过用95％ 的 O 2/5％CO 2鼓泡的介质。检查该介质具有7.3的最终pH。
- 通过削减25厘米部分每个囊准备缝合。环缝合成一个未关闭的结。
2.解剖和胃肠道的准备
- 安乐死之前撤回固体食物12小时。如果需要的话，将在营养凝胶补充剂的动物在这段时间。
- 安乐死由戊巴比妥钠过量小鼠（[200毫克/千克]，腹腔内注射），接着通过颈椎脱位按照机构伦理原议和喷70％的乙醇到腹部和胸部。
- 使用剪刀，使在腹部的中间水平切口和暴露腹膜。
- 进行分离和通过切割从幽门括约肌的胃小肠上部和切割大肠在肛门边缘的除去胃肠道。使用镊子轻轻取出肠系膜。放置在预热，氧化介质肠道。
- 确定肠的部分被评估为渗透率（ 图1）和切断从肠道的其余部分自由此部分。
- 为了维持动物之间的一致性，测量十二指肠和相对空肠段到胃，测量结肠和相对回肠部分，以盲肠。
- 当选择组织片段，注意粘膜相关淋巴组织，如淋巴集结的存在。这些可以被识别为小点头在管腔的浆膜侧ULES。
- 用1ml注射器，轻轻的肠段的管腔内容冲洗到培养皿用预先加热的PBS（37℃）。这些粪便内容可以被丢弃或者保存在-80 根据需要°℃，日后分析。
3.肠囊的制备
- 制备1ml注射器与测试化合物或分子的300微升体积。用于粘膜完整性，FITC-葡聚糖M.Wt.的1毫克/毫升溶液4400可被使用。探针从4,400-70,000大尺寸范围可用于提高灵敏度。安全适合小动物血管导管到注射器。
- 测量从肠道会议开幕式5厘米，配合段安全地与在这一点上缝合线闭环。轻轻地放在围绕肠的开口的预先打结的缝线环并插入钝导管。拉关闭绞索以便确保肠段并释放从注射器进入肠道的300微升体积，以确保所有的溶液注入。
- 轻轻地取出导管，同时拉动绞索缝合固定肠囊关闭。切开肠囊从肠松散，并放置到50毫升锥形管填充用20ml氧化介质中，预热到37 C。
4.透气率的测试
- 包含在恒温水浴的肠囊放置锥形管设置为37 C。在0，30，60，90和120分钟的时间点，采取从锥形管并转移到一个96孔板100微升样品，取代在每个实例100微升新鲜培养基的体积。
- 最终样品取后，剖开囊在缝合线的点的上下段的长度，露出粘膜表面。
- 测量每个肠段的长度和宽度。如果DESI红色，捕捉冻结段和储存在-80 °下，在用于分子分析的RNA的稳定溶液的蛋白质或生物化学分析，或可替代地，存储。
- 构造对数稀释的对FITC标记的分子范围从1到1×10 -6的标准曲线。
- 在荧光读板器测量样品和标准于FITC，FITC激发/发射：495纳米/ 519纳米。
5.计算表观渗透率的每一个人肠囊
- 转换时间单位秒。
- 对于每个时间点，计算累计的浓度，Q
Q T中=（C T * V R）+（Q T中之 * V S），其中：
Q T中= t时刻的累积浓度
（C T）=浓度在时间t
V R =在接收端音量
所有以前的Q T中的Q T中总和 = SUM
νs的=取样量 - PLOT Q随时间（T）和计算斜率：δQ/ΔT
- 计算表观渗透性（P 应用）
P = 应用程序 （δQ/ΔT）/（A * CO），其中：
组织A =面积
C 0 =初始浓度
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Representative Results
这个协议可以被用于检查在肠屏障功能中胃肠道疾病的动物模型中的区域的变化。通过测量跨过粘膜表面的细胞旁探针在胃肠道7的变化的区域的磁通，上皮紧密连接的完整性进行评估。另外，通过按大小改变旁探针的性质（图2）或疏水性（图3），上皮扰动的程度或粘膜的凝胶层的完整性，也可以测量。采用较 大分子量标记允许粘膜细胞旁渗透性的更灵敏的询问，检测谨慎的变化，这可能不是由电生理学测量诸如跨上皮电阻（TEER）可知，但是这将足以使细胞旁转运（图2）。粘膜SAL炎症可能导致杯状细胞在保护粘液凝胶通常覆盖并保护上皮界面的损失，减少。使用疏水性的探针，所述肠粘膜的凝胶层的完整性也可以检查（图3）。此外，区域屏障完整性可以通过从不同的肠区域肠囊的具体制剂进行检查。在屏障功能区域变化疾病的不同的动物模型内变化，因此，采用肠囊的允许肠屏障功能的一个局部的评估（图4）相比，探针的经口管饲，并随后血清测定时。
图1.图鼠胃肠道。一个C57B1 / 6老鼠的胃肠道的示意图，从胃到t他的肛门。小肠结不能容易地肉眼区分和一致的采样有助于减少鼠标鼠标变异。用于创建肠囊的目的，有5厘米的段远端幽门括约肌将包括十二指肠。从盲肠近端延伸将10cm部分将包括回肠。剩余的小肠组织代表空肠。直肠位于2厘米接近肛门，其余大肠，延伸到代表8结肠盲肠。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2。 大小依赖FITC葡聚糖分子的细胞旁转运尽管在控制和DSS结肠炎阿尼玛的黏膜上皮LS，肠囊从DSS小鼠的冒号10天，病程准备。囊中装有经120分钟测1毫克/ FD-4（MW 4400道尔顿）的毫升溶液中，FD-20（MW为20,000Da）或FD-70（70,000 DA）和通量FITC葡聚糖通透性标记。相匹配的健康动物年龄用作对照。 N = 5，每N. 2技术复制** P <0.01，学生t检验。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：。粘液凝胶层对屏障完整性，疏水性化合物的影响。肠囊从DSS小鼠的冒号10天，病程准备。相匹配的健康动物年龄用作对照。对于负黏液凝胶控制，肠子装载用10mM N-乙酰半胱氨酸（NAC）（每5cm肠的300微升体积），并在37℃培养 °下进行15分钟，冲洗用新鲜培养基中制备囊之前。囊装载有FD-4的1毫克/毫升溶液（MW 4400道尔顿）和熔剂用120分钟进行测定。 N = 3，每N. * P <0.05 2技术复制，** P <0.01，学生t检验。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.肠道中肠道炎症的小鼠模型的区域渗透性的FD-4。肠囊从健康动物，DSS动物或抗生素诱发的生态失调（AID）的动物的空肠，回肠或结肠制备。囊装载用1mg的FD-4 / ml的溶液（MW 4400道尔顿）和f勒克斯超过120分钟测量。 N = 3，每N. * P <0.05 2技术复制，** P <0.01，学生t检验。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
这里，我们已经详细介绍了分离和制备肠囊的评估黏膜屏障功能体外 。肠囊的准备工作，主要被用于中医药研究，考察候选药物在整个肠道的吸收。然而，该测定是同样适合于肠道疾病的研究。肠道通透性可能因地区和渗透率的网站具体的评估相差很大，可以更好地了解粘膜完整性的消化系统疾病的区域重要性。该测定是健壮和正确的生理条件下，分离的组织保持存活时间长达6小时的验尸。以下安乐死，组织制剂的速度是重要的，肠应该刷新其内容，并转移到含氧介质尽可能迅速。为了确保动物之间的一致性，这是必要的正确的肠区域是identifiED（ 图1）。据表示，结肠和回肠段从盲肠衡量，而十二指肠和空肠段从胃测量。因为不同的菌株，模型或转基因动物可能较大，并有较长的控释片，这是值得渗透性试验之前从事表征模型中的平均长度或每个肠段。
除了区域的一致性，这是重要的，以确保每个肠囊被切成相等长度和囊填充有流体的正确的体积。不一致性这些因素都会导致不平等的扩张检测之间的粘膜。下扩张的肠段的不仅降低的管腔内容到粘膜表面曝光，而且也增加了标记必须通过其行进的组织的厚度。过度扩张的段中的组织可能会损坏的组织或激活应激反应，潜在地共同的nfounding结果。应当注意的是，对于p 应用的计算不占绒毛结构的表面积。而这将导致错误在计算的组织的实际表观渗透，它不会影响模型之间的比较结果，如表面积为常数计算。表面积由于疾病的任何变化是由上皮细胞完整性的丧失偏移和协议是足够强大，以确定与疾病进展6通透性的改变。
推荐使用组织培养基。在由巴尔特等人进行的研究。使用TC199被发现相比简单盐缓冲剂9时显著增加上皮活性和组织的组织学结构，的寿命。在我们的研究中都DMEM和TC199培养基保持在37 ℃，提供了组织生存5,6,10最佳条件。正确的媒体提供与维持组织的完整性所需的营养上皮细胞，而在试验过程中保持温度，确保最佳的组织代谢是必不可少的紧交界的完整性和涉及跨细胞经途径主动转运试验。低于37的温度 ℃，引起组织丧失活力，增加细胞间的运输，降低运输跨细胞11。因此，延长组织活力与最佳条件是必要的，在这样做时，该测定可以不仅用来检查区域屏障完整性和还要检查干预研究和生理和转录反应。
虽然主要用于药物吸收研究，技术来检查跨越上皮屏障标记分子的表观透过率（P 应用）是肠完整性12-15的一个高度敏感的测量。在对比代孕体外 measureme屏障功能的NTS，如TEER，P 程序是肠道屏障4的直接和高度敏感的测量。值得注意的是，作为由标志物分子中的P 应用测量TEER的测量和透气性并不总是相关。 TEER测量包括两个紧密连接和跨细胞并联电阻16的电阻。因此TEER是由紧密连接和细胞本身所提供的组合电阻的测量。如果细胞与细胞间的关联是弱（即，紧密连接是泄漏），然后到一个单层的整体电阻这一贡献将是低的。因此，在对泄漏上皮紧交界电阻小的变化成为对上皮作为一个整体的阻力可忽略不计的变化。与此相反，P 程式测定测量的分子穿过粘膜屏障17和确实的能力，P 应用测量的灵敏度可以是人通过选择不同大小的标记分子（图1）羊羔。标记大小的考虑是相对于肠道疾病的重要模式被检查。过敏或功能疾病18,19，其中，完整性的丧失是轻度至中度，模型可能更适合于较低的分子量标记，这将允许的微妙的变化，以肠屏障功能鉴定。相反，用模型，如DSS结肠炎，这涉及剥脱肠上皮的，较大的标记可能更适合于评估粘膜愈合，如在屏障完整性相对小的增加将突出显示。
而肠囊提供胃肠屏障功能的生理相关模型中，有相对于其中需要考虑动物模型的变异性有一些限制。例如，分泌的状态或上皮可以影响整个INTES两个细胞旁转运齿20和粘液凝胶层 5的完整性。而体外测定掺入电生理学测量，如尤斯灌流室制剂，可以解决这个问题，肠囊没有。其次，在制备肠囊研究者应占淋巴结构，如淋巴集结，囊制剂中，因为这些可能影响组织21的透气性。尽管有这些考虑，与许多细胞培养模型，用于评估上皮完整性，肠囊同时提供一个粘液凝胶层和下面的固有层的贡献。粘膜凝胶层的贡献，特别是可以通过使用粘液溶解剂，如N-乙酰半胱氨酸，或疏水示踪分子，如地塞米松5,17的评估。这可能是在评估癌症的治疗或炎症性肠病模型肠道通透性特别重要，W这里粘膜屏障的损失可以在粘膜炎症22,23的早期病理。同样，在腹泻病，功能性胃肠疾病或微生态失调，肠粘液生产和整体黏液凝胶完整性模型可以在区域网站5,19,24改变。渗透性标记和随后的血清取样的经口管饲是用于体内评价肠道通透性的另一种选择。虽然这种方法具有的组织的最小的操纵，它是肠屏障功能的复合量度，它不评估整体阻挡区域的贡献。胃肠道疾病的不同模型可能有的，不会通过口服管饲法的方法来解释的相对重要性不同的网站。使用肠囊的，因此是一种快速，灵敏，生理学相关的测定法，其可被用于检查在疾病的小动物模型的区域肠粘膜完整性。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的经济利益。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dekantel Non-absorbable Silk suture | Braintree Scientific | SUT-S 116 | |
| Media 199 (TC199) | Life Technologies | 11043-023 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 21063-045 | No phenol red as this interferes with fluorescence |
| N-acetylcysteine | Sigma Aldrich | Use at 10 mM in media | |
| Small animal vascular cathether: Physiocath | Data Sciences International | 277-1-002 | |
| FITC-Dextran 4,400 MW | Sigma Aldrich | FD-4 | |
| FITC-Dextran 20,000 MW | Sigma Aldrich | FD-20 | |
| FITC-Dextran 70,000 MW | Sigma Aldrich | FD-70 |
References
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