Medicine

Sacs Ex Vivo המעיים להעריך חדירות ריריות מודלים של מחלות במערכת העיכול

Published: February 9, 2016 doi: 10.3791/53250

Sean W. Mateer¹, Jocelle Cardona¹, Ellen Marks¹, Bridie J. Goggin¹, Susan Hua¹, Simon Keely¹

¹School of Biomedical Science and Pharmacy, University of Newcastle

Abstract

המכשול אפיתל היא ההגנה מולדת הראשונה של מערכת העיכול באופן סלקטיבי מסדיר תחבורה מן לומן אל תאי הרקמה הבסיסית, הגבלת התחבורה של מולקולות קטנות יותר ברחבי האפיתל וכמעט לחלוטין האוסר תחבורה macromolecular אפיתל. סלקטיביות זו נקבעת ע"י שכבת ג'ל הרירי, אשר מגביל את התחבורה של מולקולות lipophilic ושניהם הקולטנים הפסגה ומכלולי חלבון junctional ההדוקים של האפיתל. במודלי תרבית תאים במבחנה של האפיתל הם נוחים, אבל כמודל, הם חסרים את המורכבות של האינטראקציות בין החיידקים, ג'ל רירי, האפיתל ואת המערכת החיסונית. מצד שני, in vivo הערכה של קליטה או חדירות מעי עשויה להתבצע, אבל אלה מבחנים למדוד כוללת קליטת עיכול, ללא ציון סגולי אתר. Ex vivo מבחני חדירות באמצעות "צקי מעיים"; הם שיטה מהירה ורגישה למדידת טוהר מידות מעיים הכלל או תחבורה השוואתית של מולקולה מסוימת, עם יתרון נוסף של סגוליות אתר מעיים. כאן אנו מתארים את הכנת שקי מעיים ללימודי חדירות והחישוב של חדירות לכאורה _{(אפליקציה} P) של מולקולה על פני מחסום המעי. טכניקה זו ניתן להשתמש כשיטה ספיגת תרופות בהערכת, או לבחון תפקוד מחסום האזורי אפיתל במודלים של בעלי חיים של מחלות במערכת העיכול.

Introduction

המכשול אפיתל במעי של מערכת העיכול הוא שטח הפנים הרירית מוערך ב -400 מ ^'2 ב המבוגר אדם. כתוצאה מכך, היא חשופה כל הזמן לאתגר מחיידקים, תרופות בליעה, חומרים מזינים רעלנים חיידקיים. המארח אסור להבדיל רק בין חיידקי commensal נסבלים פתוגנים פוטנציאליים, אבל חייב למנוע מינים אלה והמולקולות המופרשות שלהם לחצות את מחסום האפיתל, ואילו באותו הזמן המאפשר ספיגת מזון בגוף. לכן, את התפקיד של האפיתל במעי הוא לפעול כמחסום סלקטיבי לתכנים luminal ^1. זו המושגת, בין יתר, על ידי מערכת ביטחון אפיתל מולד בבית הרירי, אשר פועלת באמצעות מערכת ביולוגית תגובה המורכבת מנגנוני מכונן מושרים ^2.

אובדן תפקוד המחסום אפיתל היא פתולוגית אופיינית של מספר מחלות מערכת העיכול. בשנת vivoבחינת תפקוד המחסום אפיתל ניתן להעריך באמצעות gavage הפה של מולקולה נותב וניתוח בסרום לאחר ^3. עם זאת, הטכניקה הזו מציעה שום אינדיקציה לגבי האתר של תפקוד מחסום. במבחנה לשעבר vivo הערכת התנגדות transepithelial באמצעות מערכות Transwell ^{3 ו} Ussing תאי ^4,5 בהתאמה, מועסקים בכינויו סמנים פונדקאיים של תפקוד מחסום אפיתל, אך חסרים את פיזיולוגית המחלה התורמת של מודלים של בעלי חיים ^6. בפרוטוקול זה אנו מתארים מודל הכנת vivo לשעבר רקמות המאפשר הערכה ישירה ונקודות של שלמות מעיים אשר עשוי לשמש כדי להעריך תפקוד מחסום רירי בכמה רמות. חשוב לציין, טכניקה זו ניתן להחיל במודלים של בעלי חיים של מחלה, או עלולה להיות מניפולציות פרמקולוגית לאפשר בחקירה מעמיקה של תפקוד מחסום רירי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל עבודה חיה בפרוטוקול זה מבוצע תוך הקפדה אוניברסיטת ועדת האתיקה Animal ניוקאסל אישרה נהלים.

1. הכנת מכשירים, מדיה ותרבות ומנות

טרום חם Media 199 (TC199) או בינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) תקשורת ל -37 מעלות צלזיוס. טרום oxygenate המדיום ידי מבעבע עם 95% O _2/5% CO _2. בדוק כי מדיום יש pH סופי של 7.3.
כן תפר ידי חיתוך שני סעיפים 5 סנטימטרים לכל צק. Loop התפרים לתוך קשר לא סגור.

2. Dissection הכנה של מערכת העיכול

משיכת מזון 12 שעות מוצקות לפני המתת החסד. אם תרצה, למקם חיות על תוספי ג'ל מזינים במהלך הזמן הזה.
להרדים עכברים על ידי יתר נתרן pentobarbitone ([200 מ"ג / ק"ג], זריקה intraperitoneal) ואחריו נקע בצוואר הרחם בהתאם פרוטו האתיקה של המוסד הרפואיcols ולרסס 70% אתנול על הבטן ובית החזה.
בעזרת מספריים, לעשות חתך אופקי באמצע הבטן ולחשוף את הצפק.
המשך להפריד ואת להסיר את מערכת העיכול על ידי חיתוך במעי הדק העליון מהקיבה על סוגר השוער וחיתוך המעי גס על סף האנאלי. השתמש במלקחיים כדי להסיר לפדר בעדינות. מניחים את המעיים במדיום מראש חימם, מחומצן.
זהה את קטע המעי תוערך עבור חדירות (איור 1) וחותכים את החלק הזה בחינם משאר המעי.
1. על מנת לשמור על עקביות בין בעלי חיים, למדוד קטעי התריסריון ביחס מְעִי צָם אל הקיבה, ולמדוד קטעי המעי הגס ביחס מעי כדי cecum.
2. בעת בחירת קטעי רקמה, לציין את נוכחותו של רקמות הלימפה הקשורים ריריות כגון טלאים של Peyer. אלה יכולים להיות מזוהה הנהון קטןules בצד serosal של לומן.
3. באמצעות מזרק 1 מ"ל, לשטוף את התוכן luminal בעדינות של קטע המעי לתוך צלחת פטרי עם PBS מחומם מראש (37 ° C). תוכן צואתי אלה עשויים להיות מושלכים או לאחסן ב -80 ° C לניתוח בעתיד לפי הצורך.

3. הכנת המעיים Sacs

הכן מזרק 1 מ"ל עם נפח 300 μl של המתחם הבדיקה או מולקולה. עבור שלמות הרירית, פתרון 1 מ"ג / מ"ל של FITC-dextran M.Wt. 4,400 ניתן להשתמש. בדיקות החל 4,400-70,000 דה בגודל עשויות לשמש רגישות מוגברת. מאובטח להתאים קטטר וסקולרית חיה קטנה על המזרק.
מדוד 5 סנטימטרים מהפתח של קטע המעי ולקשור במגזר סגור היטב עם לולאת תפר בנקודה זו. בעדינות להניח לולאת תפר טרום קשורה סביב פתיחת המעי וכנס קטטר הקהה. משוך את החבל סגור כדי לאבטח את קטע המעיולשחרר את נפח 300 μl מן המזרק לתוך המעי, כדי להבטיח שכל הפתרון מוזרק.
בעדינות להסיר את הקטטר ובמקביל משיכת החבל תפר לאבטח סגירת שק מעיים. חותכים את שק מעיים רפויים מהמעי ומקום לתוך צינור 50 מ"ל חרוטי מלא 20 מ"ל של מדיום מחומצן, שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס.

4. מדידה של חדירות

צינורות חרוטי מקום המכיל את שקי מעיים באמבט מים חמים מוגדר 37 מעלות צלזיוס. ב 0, 30, 60, 90 ו -120 נקודות זמן דק, לקחת דגימת 100 μl מהצינור והעברת החרוטים לצלחת 96 באר, החלפת הנפח עם 100 μl של תקשורת טריה בכל מקרה לגופו.
אחרי המדגם הסופי נלקח, לחתוך צקים פתוחים בנקודת התפר לאורך אורכו של הקטע, חשיפת פני הרירית.
מדוד את האורך והרוחב של כל קטע מעי. אם desiאדום, צמד להקפיא את הפלחים ולאחסן ב -80 ° C עבור חלבון או לאנליזה ביוכימית, או לחלופין, חנות בתמיסת ייצוב RNA עבור מבחנים מולקולריים.
לבנות עקומת תקן של דילולי יומן עבור מולקולות מתויגות FITC בטווח שבין 1 ל 1 x ¹⁰ -6.
דגימות מדוד ותקנים FITC על הקורא צלחת ניאון, עירור FITC / פליטה: 495 ננומטר / 519 ננומטר.

5. חישוב חדירות לכאורה עבור כל שק הפרט מעיים

המרת יחידות זמן שני.
עבור כל נקודת זמן, לחשב את הריכוז מצטבר, Q

Q _{t =} (C _{* t} V _r) + _(סכום ש _t * V _ים), איפה:

_T Q = ריכוז מצטבר בזמן t
_{T C} = ריכוז בזמן t
V _r = נפח בצד המקבל
_{סכום t} Q = סכום של כל _t Q הקודם
_S = Vשנדגמו נפח
מגרש Q לעומת הזמן (T) ו לחשב את השיפוע: δQ / δt
חשבתי את החדירות לכאורה _{(אפליקצית} P)

P _{האפליקציה} = (δQ / δt) / (א Co *), איפה:

A = שטח של רקמה
C ₀ = ריכוז ראשוני

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבחון שינויים אזוריים בתפקוד מחסום המעי במודלים של בעלי חיים של מחלות במערכת העיכול. באמצעות מדידת השטף של חללית paracellular פני הרירית לעבר שטחים שונים של מערכת עיכול ^7, את היושרה של צומת ההדוקים אפיתל ניתן להעריך. בנוסף, על ידי שינוי האופי של חללית paracellular על פי גודלן (איור 2) או הידרופוביות (איור 3), מידת הפרעות אפיתל, או על שלמות שכבת ג'ל הרירית, ניתן למדוד גם. העסקת סמני משקל מולקולרי גדולים מאפשרת לחקירה רגישה יותר של חדירות paracellular של רירית, גילוי שינויים דיסקרטיים, כי לא יכול להיות ברור על ידי מדידות אלקטרו כגון התנגדות חשמלית transepithelial (TEER), אך אשר יהיה מספיק כדי לאפשר תחבורת paracellular (איור 2). Mucoסאל דלקת עלולה להוביל לאובדן של תאי גביע ולקיטון הג'ל מגן רירי שבדרך כלל overlies ומגן על הממשק אפיתל. באמצעות בדיקות הידרופובי, על שלמות שכבת ג'ל הרירית במעי יכול גם להיבחן (איור 3). בנוסף, שלמות מחסום אזורית יכולה להיבחן דרך להכנות של צקי מעי מאזורים מעיים שונים. לשינויים מקומיים תפקוד מחסום להשתנות בתוך במודלים של בעלי חיים שונים של מחלה וכך, שימוש צקי מעיים מאפשר הערכה מקומית של תפקוד מחסום מעיים (איור 4), בהשוואת gavage פה של בדיקות assay בסרום שלאחר מכן.

תרשים איור 1. של מערכת העיכול Murine. סכימטי של מערכת העיכול של עכבר C57Bl / 6, מהקיבה ל- tהוא פי הטבעת. צמתים המעי הדק לא ניתן להבדיל בקלות macroscopically ודגימה עקבי עוזר למזער בעכבר כדי וריאציה העכבר. למטרות יצירת צקי מעי, יכולים דיסטלי קטע 5 סנטימטר כדי סוגר השוער יקיף התריסריון. קטע 10 ס"מ הארכת proximally מן cecum יקיף את מעי. רקמת המעי הקטנה הנותרת מייצגת מְעִי צָם. פי הטבעת ממוקמת 2 הפרוקסימלי ס"מ אל פי הטבעת, עם המעי הגס הנותרים, שהשתרעה עד cecum המייצג את המעי הגס ^8. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. גודל תלוי תחבורת paracellular של מולקולות-Dextran FITC למרות רירית אפיתל מלא DSS קוליטיס אנימהls. צקי מעיים הוכנו מן הנקודות של עכברי DSS 10 ימים לאחר תחילת מהלך המחלה. צקים הועמסו עם 1 מ"ג / מיליליטר פתרון של FD-4 (MW 4,400 Da), FD-20 (20,000 מגוואט Da) או FD-70 (70,000 Da) ושטף של סמן החדיר FITC-dextran נמדד מעל 120 דקות. הגיל מתאים בעלי חיים בריאים שמש שולט. N = 5, 2 משכפל טכני לכל נ ** p <0.01, מבחן t. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3 :. השפעת השכבה הרירית-ג'ל על שלמות מחסום תרכובות הידרופוביות. צקי מעיים הוכנו מן הנקודות של עכברי DSS 10 ימים לאחר תחילת מהלך המחלה. הגיל מתאים בעלי חיים בריאים שמש שולט. לקבלת שליטה הרירית-ג'ל שלילי, מעייםהועמסו עם 10 מ"מ N-אצטיל ציסטאין (NAC) (300 נפח μl לכל 5 ס"מ של המעי) וטופחו על 37 ° C במשך 15 דקות וסמוקות מדיום חדש לפני הוכנו צקים. שקי הועמסו עם 1 מ"ג / מ"ל פתרון של FD-4 (MW 4,400 Da) ושטף בהסתכלות 120 דקות. N = 3, 2 משכפל טכני לכל p * נ <0.05, ** p <0.01, מבחן t. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. החדירות האזוריות של מעי כדי FD-4 במודלי Murine של דלקת מעיים. מעיים שקי הוכנו מן מְעִי צָם, המעי או נקודות של חיים בריאים, חיות DSS או אנטיביוטיקה נגרמת dysbiosis (AID) חיות. שקי הועמסו עם 1 מ"ג / מ"ל פתרון של FD-4 (MW 4,400 Da) ו- fלוקס בהסתכלות 120 דקות. N = 3, 2 משכפל טכני לכל p * נ <0.05, ** p <0.01, מבחן t. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הנה, יש לנו מפורטי הבידוד והכנה צקי מעיים להעריך תפקוד מחסום רירי vivo לשעבר. הכנות צק מעיים כבר נוצלו בעיקר במחקר של תרופות, בחינת ספיגת תרופות מועמד מעבר במעי. עם זאת, assay זה מתאים היטב באותה מידה לחקר מחלת מעיים. חדירות מעי עשוי להשתנות במידה רבה בהתאם לאזור והערכת אתר הספציפי של חדירות מאפשרות הבנה טובה יותר של החשיבות האזורית של שלמות רירית במחל עיכול. Assay הוא חזק בתנאים הפיסיולוגיים הנכונים, רקמות מבודדות נשארים קיימא עבור מורטם עד 6 שעות שלאחר. בעקבות המתת חסד, מהירות הכנת רקמות חשובה והמעי צריך להיות סמוק התכולה והועבר בינוני מחומצן במהירות אפשרית. על מנת להבטיח עקביות בין בעלי החיים, זה הכרחי כי באזורים הנכונים המעיים הם identified (איור 1). מומלץ כי חלקים במעי הגס, ileal נמדדות על פי cecum, בעוד מגזרי התריסריון והמעי הריק יתכן שרמת נמדדים מהקיבה. בגלל זנים שונים, מודלים או חיות טרנסגניות עשויים להיות גדולים יותר, ויש לי עוד gits, כדאי המאפיין את האורך הממוצע או כל קטע מעי במודל שלך לפני עוסקי מבחני חדירות.

בנוסף עקביות אזורית, חשוב להבטיח כי כל צק מעיים נחתכו שווה בהאורך ואת השק מלא את הנפח הנכון של נוזל. חוסר עקביות הגורמים הללו יגרום התנפחות שוויונית של הרירית בין מבחנים. תת התנפחות של קטע המעי לא רק מפחית את החשיפה של תוכן luminal אל פני שטח הרירי, אלא גם מגביר את עובי הרקמה שדרכו הסמן חייב לנסוע. יתר התנפחות של המגזר עלול לגרום נזק לרקמות או להפעיל-תגובות דחק בתוך הרקמה, פוטנציאל שיתוףתוצאות nfounding. יצוין, כי לצורך חישוב _{אפליקצית} P אינו לוקח בחשבון שטח פנים של מבנה villous. אמנם זה מוביל שגיאה בחישוב החדיר לכאורה בפועל של רקמה, זה לא ישפיע על תוצאות השוואה בין דגמים, כמו שטח פן מחושב קבוע. כל שינוי פני שטח בשל מחלה מקוזזת על ידי אובדן של שלמות אפיתל הפרוטוקול הוא חזק מספיק כדי לזהות שינויים בחדירות עם התקדמות מחלה ^6.

השימוש בינוני בתרבית רקמה מומלץ. במחקרים שבוצעו על ידי Barthe et al. שימוש TC199 נמצא להגדיל את תוחלת החיים באופן משמעותי של כדאיות אפיתל ואדריכלות היסטולוגית רקמות, בהשוואת מאגרי מלח פשוט ^9. במחקרים שלנו הוא DMEM בינונית ו TC199 על 37 ° C סיפק תנאים אופטימליים הישרדות רקמות ^5,6,10. התקשורת הנכונהמספק האפיתל עם חומרים מזינים דרושים כדי לקיים שלמויות רקמות, תוך שמירה על טמפרטורה במהלך assay מבטיח מטבוליזם רקמה האופטימלי המהווה שלמות junctional חזקה חיונית מבחנים של הובלה פעילה דרך שבילי transcellular. בטמפרטורות מתחת 37 לגרום לאובדן ° C של הכדאיות רקמות, הגדלת תחבורה paracellular ולהפחית תחבורה transcellular ^11. לפיכך, הארכת הכדאיות רקמות עם תנאים אופטימליים חיוני ותוך כדי כך, assay יכול לשמש לא רק לבחון שלמות מחסום האזורית אלא גם לבחון מחקרי התערבות ותגובות פיזיולוגיות תעתיק.

בעוד בעיקר בשימוש ללימודי ספיגת תרופות, טכניקות לבחון חדירות לכאורה _{(אפליקצית} P) של מולקולת סמן על מחסום האפיתל הם מדידה רגישה מאוד של שלמות מעי ^12-15. בניגוד פונדקאי vivo לשעבר measurements של תפקוד מחסום, כגון TEER, _{אפליקצית} P היא המדידה ישירה ורגיש מאוד של מכשול מעי ^4. ראוי לציין כי מדידות TEER וחדירות כפי שהיא נמדדת _על ידי אפליקציית P של מולקולות סמן לא תמיד לתאם. מדידות TEER להקיף את ההתנגדות של שני צמתים הדוקים נגדים במקביל transcellular ^16. לכן TEER היא מדידה של התנגדות בשילוב המוצעים על ידי צמתים הדוקים ואת התאים עצמם. אם עמותות תאי תאים חלשות (כלומר, צומת הדוקים הם דולף) ואז התרומה זו להתנגדות הכוללת של בשכבה תהיה נמוכה. לפיכך שינויים קטנים התנגדויות junctional חזקות עבור אפיתל דולף כשינויים זניחים ההתנגדויות של האפיתל בכללותה. בניגוד לכך, מבחני _{אפליקצית} P למדוד את היכולת של מולקולה לחצות את המחסום הרירי ¹⁷ ואכן, רגישות של מדידות _{אפליקצית} P עשוי להיות אלאפריקניות באמצעות בחירת מולקולות סמן בגדלים שונים (איור 1). התמורה של גודל סמן חשובה ביחס למודל של מחלת מעיים נבדקת. מודלים של מחלות אלרגיה או תפקודית ^18,19, שבו אובדן של שלמות היא קלה עד מתונה, עשוי להיות מתאים יותר כדי סמנים משקל מולקולרי נמוך, אשר יאפשר זיהוי של שינויים עדינים כדי תפקוד המחסום מעיים. לעומת זאת, עם דגמים כמו קוליטיס DSS, אשר כרוכות שהם מרוקנים של האפיתל במעי, סמנים גדולים עשויים להיות מתאימים יותר כדי להעריך ריפוי רירי, כפי עליות קטנות יחסית שלמות מחסום תודגשנה.

בעוד שקי מעיים להציע מודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של תפקוד המחסום GI, ישנן מספר מגבלות ביחס השתנות של מודלים של בעלי חיים אשר צריכים להילקח בחשבון. למשל, מדינת הפרשה או האפיתל יכולה להשפיע היא על תחבורת paracellular ברחבי intesשן ²⁰ ואת היושרה של שכבת ג'ל הרירית ^5. בעוד מבחני vivo לשעבר המאגדת מדידות אלקטרו, כגון הכנות תא Ussing, עשויים להסביר את זה, צקי מעיים לא. שנית, בהכנת החוקרים שקי מעיים צריך להסביר מבנים הלימפה, כגון טלאים של Peyer, בתוך ההכנות שק, מכיוון שהן עשויות להשפיע על חדירות של רקמות ^21. למרות שיקולים אלה, בניגוד לדגמי תרבית תאים רב, המשמש להערכת שלמות אפיתל, צקי המעיים להציע את התרומה הן של שכבת ג'ל רירית ו שכבת רירית מיוחדת בסיסית. התרומה של שכבת ג'ל רירי, בפרט, ניתן להעריך באמצעות סוכנים mucolytic, כגון ציסטאין N-אצטיל, או מולקולות נותב הידרופובי, כגון dexamethasone ^5,17. זו עשויה להיות חשובה במיוחד בהערכת חדירות המעי במודלים של טיפול בסרטן או מחלת מעיים דלקתית, wאובדן כאן המכשול הרירי יכול להיות פתולוגיה מוקדם הדלקת ברירית ^22,23. בדומה לכך, במודלים של מחלת שלשולים, מחלות במערכת העיכול תפקודית או dysbiosis, ייצור ריר המעי ויושרה ג'ל רירי הכוללת עשויים להשתנות באתרים אזוריים ^5,19,24. Gavage האוראלי של סמנים חדירים ודגימה בסרום לאחר אפשרות נוספת להערכת חדירות מעי in vivo. אמנם שיטה זו יש מניפולציה מינימאלית של רקמה, שמדובר במדד משולב של תפקוד מחסום מעיים וזה לא להעריך את התרומה האזורית המכשול הכולל. מודלים שונים של מחלת GI צפויים להיות אתרים שונים של חשיבות יחסית אשר לא להיות מוסבר על ידי גישות gavage פה. שימוש צקי מעיים, ולכן הוא assay מהיר, רגיש רלוונטי מבחינה הפיזיולוגית אשר עשוי לשמש כדי לבחון שלמות רירית אזורי מעי במודלים של בעלי חיים קטנים של מחלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dekantel Non-absorbable Silk suture	Braintree Scientific	SUT-S 116
Media 199 (TC199)	Life Technologies	11043-023	No phenol red as this interferes with fluorescence
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	21063-045	No phenol red as this interferes with fluorescence
N-acetylcysteine	Sigma Aldrich		Use at 10 mM in media
Small animal vascular cathether: Physiocath	Data Sciences International	277-1-002
FITC-Dextran 4,400 MW	Sigma Aldrich	FD-4
FITC-Dextran 20,000 MW	Sigma Aldrich	FD-20
FITC-Dextran 70,000 MW	Sigma Aldrich	FD-70