Abstract
היכולת להפריש ציטוקינים במהירות על גירוי היא מאפיין פונקציונלי של שושלת תא רוצח טבעי T (iNKT) בלתי משתנה. תאי iNKT לכן מאופיינים כאוכלוסיית תא מולדת T מסוגלת הפעלה והסתגלות היגוי תגובות חיסונית. הפיתוח של טכניקות משופרות לתרבות והרחבת תאי iNKT עכברי מאפשר המחקר של ביולוגיה של תא iNKT במבחנה ובמערכות מודל vivo. כאן אנו מתארים הליך מותאם לבידוד והרחבת תאי iNKT הטחול עכברי.
טחול מעכברי C57Bl / 6 יוסרו, גזור ומתוח וההשעיה הסלולרית וכתוצאה מכך היא שכבות על תקשורת שיפוע צפיפות. בעקבות צנטריפוגה, תאי הטחול mononuclear (MNCs) נאספים וימפוציטים CD5-חיוביים (CD5 +) מועשרים לשימוש בחרוזים מגנטיים. תאי iNKT בתוך שבריר CD5 + מוכתמים לאחר מכן עם ^עמוס GalCer tetramer CD1d ומטוהר על ידי תא הקרינה מיון מופעל (FACS); 5. FACS מיון תאי iNKT אז הם בתחילה בתרבית במבחנה באמצעות שילוב של ציטוקינים עכברי רקומביננטי וגירויים קולט תא T צלחת מאוגד (TCR) לפני שהרחיב בנוכחות של IL-7 רקומביננטי עכברי. שימוש בטכניקה זו, כ יכולים להיות שנוצרו 10 8 תאי iNKT בתוך 18-20 ימים של תרבות, לאחר שהם יכולים לשמש עבור מבחני פונקציונליים במבחנה, או לin vivo ניסויי העברה בעכברים.
Introduction
Murine T תאים (iNKT) רוצח טבעי משתנה הם אוכלוסייה מובחנת של לימפוציטים מסוג T המולדים נבחר בהתימוס ידי thymocytes קליפת המוח להביע CD1d 1,2. תאי iNKT לבטא קולט תא T (TCR) מורכבים משרשרת Vα14-Jα18 TCR משתנה יחד עם שני Vβ8, Vβ7 או Vβ2 TCRs 3, שהוא מסוגל להכיר אנדוגני כמו גם אנטיגנים שומנים זרים בהקשר של CD1d. לדוגמא, תאי iNKT עכברי להכיר ומופעלים על ידי isoglobotrihexosylceramide אנטיגן השומנים אנדוגני נקרא (iGb3) 4, כמו גם α-galactosylceramide (αGalCer) 5,6, גליקוליפיד מבודד מספוגים ימיים. TCR-תלויה הפעלת תאי iNKT מקדם תחול של תגובות חיסוניים אדפטיבית, וכתוצאה מכך, תאי iNKT הוכחו להיות מעורב מבחינה תפקודית בשיפור או פיתוח של מגוון רחב של פתולוגיות כוללים מחלת שיגרון 7 וסרטן <sup> 8. נכון לעכשיו, ligands תא iNKT הסינתטי מהווה adjuvants חיסון חדש ומבטיח שיכול להיות מסוגל ויסות מספר תנאי immunopathological.
זה בעבר כבר הוכיח כי יכולים להיות שנוצרו בתאים במבחנה iNKT הבאים בידוד מרקמת עכבר זאת; רבים מהמחקרים האלה להעסיק את השימוש של תאים ראשוניים הצגת אנטיגן (נגמ"שים) ו / או תא קווים 9, מהונדס Vα14 TCR (TG) עכברים 10, או thymomas לדור של hybridomas תאים שמקורם iNKT 11,12. יתר על כן, מספר גדול של עכברים, כמויות גדולות של חומרים כימיים כגון הדימרים טעונים αGalCer CD1d, ופעמים תרבות ארוכות לעשות כמה פרוטוקולים שפורסמו פחות מבחינה אתית וכלכלי מושך 9,13.
בדוח זה אנו מתארים שיטה מותאמת לבידוד ובהרחבת מבחנה של תאי iNKT מטחול עכבר. באופן ספציפי יותר, הפרוטוקול מתאר שיטהלהעשרת תאי iNKT מטחול עכבר אשר מפחית את העכברים, חומרים כימיים וזמן הנדרש למיון תא FACS, ומציע גישה מותאמת להרחבת תאי iNKT הטחול מיון במבחנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
במחקר זה, נקבה בוגרת (6-8 שבועות) C57Bl / 6 עכברים היו בשימוש. עכברים שוכנו וגדלו בהתאם להנחיות של ביבר אוניברסיטת גנט. נהלי כל החיה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים המוסדיים ואתיקה.
1. הכנת תאי mononuclear (MNCs) מטחול העכבר
- להקריב את העכבר על ידי נקע בצוואר הרחם.
- מניחים את העכבר במורד גב על הלוח לנתח ולתקן האחורי ורגליים קדמיות עם סיכות.
- לעקר את העור-פני השטח עם 70% אתנול / H (כרך / כרך) 2 O.
- חותך את העור לאורך קו האמצע הבטן לבית החזה ולחשוף את הטחול באמצעות מכשירי ניתוח סטרילי.
- לאחר זמירה רקמות שומן מסביב, למקם את הטחול לתוך צלחת 24 היטב המכילה 1 מיליליטר 1x ופר פוספט (PBS) ב RT.
- לנתח את הטחול באמצעות אזמל סטרילי ולהעביר את החתיכות לתוך מסנן ניילון 70 מיקרומטר ממוקם בתוך אמבטיה 50 מיליליטרדואר.
- שימוש בבוכנת מזרק 2 מיליליטר, בעדינות מועך את חתיכות הטחול דרך מסננת התא ולשטוף עם 5 מיליליטר 1x PBS.
- להוסיף 3 מיליליטר של Ficoll-Paque לצינור 15 מיליליטר וכיסוי בינוני שיפוע צפיפות עם ההשעיה הסלולרית 5 מיליליטר.
- צנטריפוגה ב 400 XG במשך 20 דקות ב RT ללא בלם.
- העבר הביניים לצינור 15 מיליליטר טרי, להוסיף 10 מיליליטר הקר 1x PBS ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- Resuspend התאים 2 מיליליטר 1x PBS המכיל 0.5% אלבומין בסרום שור (BSA) וחומצת 1 מ"מ ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (חיץ FACS). העברה 10 μl של ההשעיה תא צינור קטן, לערבב עם 10 μl של 0.4%
2. העשרה, באיתור ובטיהור של תאי העכבר iNKT
- העשרה של לימפוציטים הטחול עכבר CD5positive (CD5 +).
- (אופציונאלי) כתם 10 5 תאים עם FITC- מצומדות אנטי-CD5 (4 μl של 01:30 דילול / 10 6 תאים)למשך 30 דקות ב 4 ° C בחושך, לשטוף עם 200 μl FACS חיץ וגלול ב500 μl חיץ FACS. הכן פתרון עובד 20 מיקרומטר של 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ב 1x PBS, להוסיף 1 μl 10 5 תאים בחיץ FACS ולדגור על RT במשך 5 דקות. לרכוש 10 4 תאים מועשרים מראש על cytometer את הזרימה.
- שימוש FCS-H וFCS-W, אלקטרוני שער על תאי lo FSC-W להוציא כפילויות תא ואגרגטים (איור 1 א). אז + תאים אלקטרוניים שער החוצה DAPI (מתים) בתוך FSC-W lo האוכלוסייה (איור 1), ולהשתמש SSC-וFCS-כדי לבחור את אוכלוסיית הלימפוציטים אלקטרוני לפי גודל (איור 1 ג).
- שימוש בתאים בתוך שער הלימפוציטים, העלילה SSC-מול CD5 ואלקטרוני לימפוציטים השער CD5 + כפי שמוצג באיור 1D. לרכוש את יתרת המדגם מראש המועשר בcytometer את הזרימה.
- התאם ספירת תאים עד 10 7 תאים לכל 90 μl במאגר FACS ולהוסיף microbeads אנטי-CD5 10 μl.
- דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, לשטוף פעם אחת עם 4 FACS מיליליטר חיץ וגלול ב500 μl חיץ FACS קר. להעשיר לCD5 ימפוציטים + באמצעות הפרדת תא מגנטית (MACS) עמודות על פי המלצות יצרן.
- אופציונאלי) כתם 10 5 תאים עם אנטי-CD5 FITC- מצומדות (4 μl של 01:30 דילול / 10 6 תאים) וDAPI כמו ב2.1.1. לרכוש 10 4 ימפוציטים מועשרים בcytometer הזרימה ולוודא שהשערים האלקטרוניים שנוצרו ב2.1.1. בחר CD5 ימפוציטים + בשבריר הסלולרי המועשר. לרכוש 10 5 תאים על cytometer הזרימה ולנתח את אחוז CD5 + לימפוציטים הנוכחיים בשבריר המועשר כפי שמוצג באיור 1E - H.
- זיהוי ובידוד של ce iNKT עכברLLS ידי FACS.
- Resuspend + לימפוציטים CD5 מועשרים בריכוז של כ 10 6 תאים לכל 20 μl במאגר FACS המכיל אנטי-CD16 / CD32 (4 μl של 1:50 דילול / 10 6 תאים) וαGalCer PE-מצומדות / tetramer CD1d (1 מיקרוגרם / 10 6 תאים).
- דגירה של 30 דקות ב RT בחושך.
- לדלל נוגדני עכבר (בז) אנטי-CD3ε V500 (4 μl של 1:20 דילול / 10 6 תאים), E450 אנטי-CD19 (4 μl של 1:50 דילול / 10 6 תאים) ואנטי-CD8α E450 (4 μl של 01:50 דילול / 10 6 תאים) במאגר FACS, להוסיף לCD5 + לימפוציטים דגירה במשך 30 דקות ב 4 ° C בחושך.
- לשטוף את התאים עם FACS חיץ 1 מיליליטר על ידי צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס וגלולות ב 4 מיליליטר חיץ FACS בריכוז סופי של 10 7 תאים / מיליליטר.
- סנן את התאים דרך מסננת תא 30 מיקרומטר ולמקם את התאים על קרח.
- כייל את cytometer הזרימה לתא מיון לפי המלצות היצרן 14,15.
הערה: כיול של cytometer זרימה למיון תא דורש אימון ויכול להתבצע על ידי מפעיל מנוסה, או טכנאי מיומן. - הוסף 10 μl של פתרון עובד 20 מיקרומטר של DAPI לכל 10 6 תאים ולדגור על RT במשך 5 דקות. לרכוש כ 10 + 4 לימפוציטים CD5 מועשרים בcytometer את הזרימה. אלקטרוני שער על תאי lo FSC-W להוציא כפילויות תא ואגרגטים (איור 2 א). אז באופן אלקטרוני את שער DAPI + CD8 + CD19 + תאים (ערוץ מזבלה) בתוך FSC-W lo האוכלוסייה (איור 2), ולהשתמש SSC-וFCS-מנת לבחור באופן אלקטרוני לימפוציטים (איור 2 ג) כפי שמתואר ב2.1.1.1 .
- עלילת αGalCer / CD1d tetramer ידי CD3ε ואלקטרוני השער αGalCer / CD1dתאי tetramer + CD3ε + iNKT כפי שמוצג באיור 2 ד. לרכוש לא יותר מ 2 x 10 5 CD5 + לימפוציטים מועשרים כדי לקבוע את אחוז αGalCer / tetramer CD1d + CD3ε + iNKT תאים הנמצאים בחלק הסלולרי המועשר.
- שימוש בשערים האלקטרוניים שנוצרו ב2.2.7., תאי מין αGalCer / tetramer CD1d FACS + CD3ε + iNKT על cytometer את הזרימה ב 70 psi באמצעות זרבובית 70 מיקרומטר בקצב זרימה של '1.5'. איסוף תאים ממוינים iNKT בצינור FACS FCS המכיל 1 מיליליטר 100%. בהמשך לכך לשטוף תאי iNKT מסודרים מהצד של צינור FACS באמצעות 10 מיליליטר RMPI מדיום 1640 ו צנטריפוגות התאים XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- Resuspend מסודרים תאי iNKT ב 1 מיליליטר RPMI 1640 בינוניים ולרכוש 40 μl על cytometer זרימה להעריך את טוהר של תאים ממוינים iNKT. בחר FSC-W lo DAPI - הלימפוציטיםים כפי שמתואר ב2.2.7. (איור 2E - G) והשער אלקטרוני αGalCer / תאי tetramer + CD3ε + iNKT CD1d כפי שמוצג באיור 2H.
3. תרבות והרחבת תאי העכבר iNKT
יום 0
- מעיל צלחת עם תחתית שטוחה 96 גם עם אנטי-CD3ε המטוהר (3 מיקרוגרם / מיליליטר) לכל היטב במשך שעה 1 ב RT. לשטוף פעמיים עם 200 μl 1x PBS ופעם עם 200 μl בינוני שלם RPMI 1640 (10% FCS כרך / כרך, 100 U / פניצילין, סטרפטומיצין מיליליטר, 5.5 מיקרומטר β-mercaptoethanol).
- לספור את מספר תאי קיימא מסודרים iNKT (צעד 2.2.8) באמצעות 0.4% hemocytometer כמו ב1.11., צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס וגלולות בשעת 5 x 10 5 תאים / מיליליטר במדיום 1640 RPMI מלא המכיל 2-IL (/ מיליליטר 10 ng) רקומביננטי עכברי, IL-12 (1 ng / ml) עכברי רקומביננטי וCD28 אנטי עכבר (5 מיקרוגרם / מיליליטר) מסיס. צלחת שלorted תאי iNKT ב 10 5 תאים / גם בצלחות מצופים אנטי-CD3ε ולדגור על 37 מעלות צלזיוס חממת CO 2 עבור 2 ימים.
יום 2
- העברת התאים לצלחת טרי ללא ציפוי-תחתית שטוחה 96 גם ותרבות התאים בתנאי מנוחה במדיום RPMI 1640 שלם על 37 מעלות צלזיוס בחממה CO 2 עבור 2 ימים.
יום 4
- לסלק את התאים מהצלחת ידי pipetting העדין ולהעביר את תאי צינור 15 מיליליטר טרי. צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 ° C, גלול ב 5 x 10 5 תאים / מיליליטר בRPMI 1640 בינוני מלא המכיל 7-IL (מיליליטר / 5 ng) רקומביננטי עכברי, וצלחת 10 5 תאים / גם בשטוח תחתית 96 צלחת גם במשך 4 ימים על 37 מעלות צלזיוס בחממה CO 2.
יום 8
- לאסוף את התאים בצינור טרי, צנטריפוגות ב 300 xגרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס וגלולות בשעת 5 x 10 5 תאים / מיליליטר במדיום 1640 RPMI שלם המכילות אנטי CD28 המסיס (5 מיקרוגרם / מיליליטר).
- מעיל צלחת עם תחתית שטוחה 96 גם עם אנטי-CD3ε המטוהר (3 מיקרוגרם / מיליליטר) לכל היטב ולשטוף כמו ב3.1. צלחת 10 5 תאים / גם באנטי-CD3ε צלחות מצופים ולדגור על 37 מעלות צלזיוס חממת CO 2 עד יום 11.
יום 11-18
- חזור על שלבים 3.4-3.6.
יום 19-20
- להעביר את תאי צינור 15 מיליליטר טרי, צנטריפוגה XG ב 300 וגלולים בשעת 5 x 10 5 תאים / מיליליטר במדיום 1640 RPMI שלם.
- תאי צלחת ב 10 5 תאים / גם בצלחת גם עם תחתית שטוחה 96 ולאפשר לתאים לנוח 2 ימים על 37 מעלות צלזיוס בחממה CO 2 לפני השימוש בניסוי.
4. ציטוקין ייצור על ידי תאי iNKT עכבר באמצעות פלאט CD1dAssay הנכנס דואר
- מעיל צלחת עם תחתית שטוחה 96 גם עם של עכברי רקומביננטי CD1d 100 μl (10 מיקרוגרם / מיליליטר ב1x PBS) לכל היטב דגירה במשך השעה 1 ב 37 מעלות צלזיוס.
- לשטוף ארבע פעמים עם 200 μl 1x PBS, להוסיף 200 μl של FCS 2% ב1x PBS (פתרון חסימה) לכל היטב דגירה במשך שעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס.
- הסר את פתרון החסימה, להוסיף 200 μl של αGalCer (5 ng / μl) לכל היטב, ודגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך 16 שעות. [להכנת פתרון αGalCer, להוסיף 1,085 μ 1x PBS עד 55 מיקרוגרם של αGalCer מומס ברכב המכיל 96 מ"ג / מיליליטר סוכרוז, 10 מ"ג / מיליליטר נתרן deoxycholate ו5 מ"ג / מיליליטר tween 20].
- לאחר דגירה, לבטל את פתרון αGalCer ולשטוף היטב פעמיים עם 200 μl 1x PBS ואחריו 200 μl בינוני RPMI 1640 מלאים.
- לאסוף את התאים במבחנה iNKT מורחבים ביום 21, צנטריפוגה התאים XG ב 300 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס והגלולה בR המלאמדד מנהלי הרכש בינוני 1,640 בריכוז של 0.5 x 10 6 תאים / מיליליטר.
- הוסף 200 μl של resuspension תא iNKT בכל טוב והדגירה של 72 שעות על 37 מעלות צלזיוס בחממה CO 2.
- לאסוף את ציטוקינים supernatant ומידה של עניין על ידי assay צמוד אנזים immunosorbant (ELISA) על פי הפרוטוקול של היצרן.
- (אופציונאלי) כתם 10 5 תאים עם FITC- מצומדות אנטי-CD5 (4 μl של 01:30 דילול / 10 6 תאים)למשך 30 דקות ב 4 ° C בחושך, לשטוף עם 200 μl FACS חיץ וגלול ב500 μl חיץ FACS. הכן פתרון עובד 20 מיקרומטר של 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ב 1x PBS, להוסיף 1 μl 10 5 תאים בחיץ FACS ולדגור על RT במשך 5 דקות. לרכוש 10 4 תאים מועשרים מראש על cytometer את הזרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בידוד של תאי mononuclear הטחול באמצעות שיפוע צפיפות לוקח כ 1 שעה ומבטל את השימוש בחומרים כימיים הנדרשים לlyse תאי דם אדומים (RBCs). תשואה גבוהה של תאי קיימא מתקבלת בשיטה זו ופסולת הנוצרת במהלך המאמץ של האיבר מוסר. בדרך כלל, את התדירות של תאי iNKT בתוך בריכת הלימפוציטים הטחול נעה בין 1 ל 5% בסך הכל לימפוציטים מסוג T עם זאת, זה יכול להשתנות בהתאם למצב גיל, המין ובריאות של בעלי החיים המשמשים. כ ניתן לרכוש מהטחולים המשולבים של 3 עכברים ואת התשואה הגבוהה ביותר של תאי iNKT 10 6 תאי iNKT מתקבלים מטחולים של עכברים ישנים 6-8 שבוע.
השימוש בחרוזים מגנטיים העכבר אנטי-CD5 מעשירים באופן משמעותי לתאי iNKT בתוך שבריר MNC הטחול ו, מלבד אוכלוסייה קטנה של לימפוציטים מסוג B המבטא את האנטיגן CD5, רוב התאים מבודדים באמצעות הליך זה מהווה CD5 + lymphocytes. לדוגמא, 5-8% מMNCs מתקבל לאחר העשרת CD5 הם CD5-שלילי (איור 1H). לFACS תא iNKT מיון, שילוב αGalCer / tetramer CD1d ואנטי עכבר CD3ε מניב purities תא iNKT מעל 98% עם זאת, יש להשתמש בערוצי המזבלה FACS לB הטחול ותאי CD8 T לחסל אוכלוסיות 'דביקות' הלימפוציטים בסוג. בנוסף, שער מתוך כל כפילויות שאולי נוצרו במהלך שלב העשרת CD5. באמצעות התקנת FACS זה, השגנו purities תא iNKT פוסט-מין לפי הסדר של 99% (איור 2H).
גירוי 10 6 תאי iNKT מסודרים עם כריכת צלחת אנטי-CD3ε בנוכחות של IL-2, IL-12 ואנטי CD28 המסיס הביא התרחבות של פי 3 של מספרי iNKT הבאים 2 ימים של התרבות (איור 3). תאי iNKT ההתרחבות לאחר בנוכחות של IL-7 תוצאות ב3- 4-פי עלייה במספר תאי iNKT נוכחים ביום 4 בתרבות. Notably, חוזר תנאי culturing אלה יכולים להניב ממוצע של 7 x 10 7 תאי iNKT לאחר שני סבבים של הרחבה ללא כל אובדן של תאים גלויים בין שינויים בתקשורת והתרבות בימים שונים (איור 3). לפיכך, ניתן להרחיב תאי iNKT הטחול עכברי לפחות 70-לקפל באמצעות תנאים אלה ב -18 ימים.
אנחנו גם הערכנו את יכולת ייצור ציטוקינים של תאי iNKT הרחיבו על ידי גירוי עם עכברי רקומביננטי-מחויב צלחת CD1d עמוסה αGalCer. בפוסט 48 גירוי-HR, IL-2, IL-4, IFN-γ, TNF-α ו- IL-6 ניתן היה לזהות בקלות בsupernatants התרבות על ידי ELISA (איור 4). תאי iNKT מורחבים לכן לשמר את היכולת לייצר ציטוקינים Th1 וTh2 פוסט-הרחבה.
איור 1. העשרה לCD5 +לימפוציטים מMNCs הטחול העכבר. אסטרטגית gating לניתוח אחוז CD5 + לימפוציטים הנוכחיים בטרום מועשר (AD) והשעיות תא מגנטי מועשר הפרדת עכבר (EH) הטחול MNC. כפילויות תא (A, E) ותאים מתים (B, F) הורחקו באמצעות FSC-H לעומת FCS-W וDAPI לעומת מגרשי FSC-, בהתאמה. אחוז CD5 + תאים הנוכחיים בשער הלימפוציטים (C, G) לפני ואחרי ההעשרה מוצגים בD ו- H, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור יור 2. FACS מיון תאי iNKT מMNCs הטחול מועשר-CD5. אסטרטגית gating לניתוח αGalCer אחוז / תאי tetramer + CD3ε + iNKT CD1d הנוכחיים לפני (- D) ואחרי (E - H) FACS מיון. אסטרטגית gating מבטלת כפילויות תא (A, E), תאים מתים וCD8 + CD19 + לימפוציטים (B, F) מהניתוח על ידי התוויית FSC-H לעומת FCS-W וDAPI, CD8 וCD19 (ערוץ מזבלה) לעומת FSC- , בהתאמה. ΑGalCer אחוז / תאי tetramer + CD3ε + iNKT CD1d הנוכחיים בשער הלימפוציטים (C, G) לפני ואחרי מיון FACS מוצגים ב( ד) ו- (H), בהתאמה. CD1d-ט '., ΑGalCer / CD1d tetramer.תקבל = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. מספר מוחלט של תאי iNKT שנוצרו במבחנה. מקפלים עלייה במספר תאי iNKT בנקודות זמן המצוינת אחרי 3 שבועות של התרחבות במבחנה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. ציטוקין ייצור קיבולת של תאי iNKT הרחיבו במבחנה. יום 20 תאי iNKT מורחבים היו מגורה במבחנה עם CD1d הטעון αGalCer עכבר. לאחר 72 שעות supernatants נאסף ונותח לנוכחות שליFN-γ, IL-4, TNF-α, IL-2 ו- IL-6 על ידי ELISA. ברים לייצג פירוש SEM (n = 2). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צעדים קריטיים בפרוטוקול הנוכחי כוללים בידוד וההעשרה הבאה של CD5 + לימפוציטים (סעיף 1 ו -2), FACS (סעיף 3) מיון וציפוי הראשוני של תאי iNKT (סעיף 4). הצעדים שבוצעו בסעיף 1, זוכר שכבה בזהירות ההשעיה סלולרית הטחול על מדיום שיפוע הצפיפות כך שביניים סלולריים שונים נוצר בעקבות צנטריפוגה. ההעשרה לאחר מכן לCD5 + לימפוציטים ידי הפרדת תא מגנטית (סעיף 2) ממזערת את חומרים כימיים וזמן הנדרש לכתם ולתאי FACS iNKT סוג (סעיף 3), אשר מסייע תשואות תא iNKT עליית פוסט-מין. לבסוף, חשוב לזרע לא יותר מ 10 5 תאי iNKT לכל גם עבור 2 הימים הראשונים של התרבות (סעיף 4) כזריעת בארות עם מספרים גבוהים יותר של תאי iNKT יכול לגרום לאפופטוזיס הסלולרי.
מספר השיקולים חשובים בעת שינוי ו / או troubleshooטינג פרוטוקול זה: ראשית, גילם של בעלי החיים המשמשים הוא חשוב. בעלי חיים שהם או זקנים מדי, או שיש לי זיהומי אבזר, עלולים לפגוע ביכולת שלך לבודד, להבחין, וFACS סוג תאים מספיק מהטחול. שנית, כאשר צביעה עם tetramers αGalCer / CD1d, חשוב לשמור על הנפח של תאי resuspended ב PBS חיץ נמוך כגבוה מדי נפח מדלל את יעילות צביעת tetramer αGalCer / CD1d, אשר בתורו מפחית את האשכולות של tetramer + תאי iNKT ידי FACS. באופן אידיאלי, הנוכחות של תאי tetramer + iNKT αGalCer / CD1d התקבצו בחוזקה במהלך רכישת FACS מאפשרת לgating מדויק יותר על ידי FACS ומניבה iNKTs טוהר אחוז גבוה יותר במהלך ניתוח שלאחר-מין. זה חשוב כמו תשואות תא ממוינות iNKT נמוכות יגרמו לתוצאה של אוכלוסיות תאי T זיהום אחרות במהלך התרבות. שלישית, ברציפות לרענן בינוני שהופך צהוב במהלך התרבות והרחבת לסה"נ iNKTLLS. לדוגמא, להחליף 50% של מדיום מצהיב עם מדיום חדש המכיל ציטוקינים המתאימים, במיוחד בימים 8 ויום 11 של התרבות. יכולות להיות מוגדלת תשואות תא iNKT בדרך זו.
למיטב ידיעתנו זו היא פרוטוקול הרחבת iNKT הראשון כולל שיפוע צפיפות וצעד העשרת הלימפוציטים CD5 + לבידוד וההעשרה של תאי iNKT מטחול עכבר. מספר הגישות חלופיות נחקר להעשיר לתאי iNKT הטחול כוללים הדימרים αGalCer / CD1d 13, Vα14 TCR Tg עכברים 10 כמו גם דלדול של תאים הלא-T על ידי תא מגנטי הפרדה 9. עם זאת, למרות שניתן להרחיב תאי iNKT בהצלחה במבחנה תוך שימוש בגישות אלה, שיטות כגון דורשות גם כמויות גדולות של הדימרים αGalCer / CD1d להעשיר לiNKTs 13, רק לייצר תאים מהונדסים iNKT 10, או בו זמנית לגרום לכמה שורות תאים שאינם iNKT 9 < / Sup>. יתר על כן, השימוש בכריכת צלחת אנטי-CD3ε לשמור ולהרחיב את תאים ממוינים iNKT (סעיף 4) מונע דרישה לנגמ"שים הופעלו במהלך התרחבות iNKT במבחנה 9. בהקשר זה, יש פרוטוקול הרחבת iNKT ללא APC היתרון של אין צורך להפריד בין נגמ"שים מתאי iNKT הרחיבו לפני הזרקת in vivo. אנחנו צריכים אולם גם להוסיף כי הפרוטוקול המתואר הוא מוגבל על ידי העובדה שהחוקר דורש גישה קלה ל, כמו גם הכשרה הרלוונטית, לכייל ולפעול סדרן FACS. למרבה הצער ממייני FACS הם יקרים והם לא תמיד זמינים בכל מעבדה. עם זאת, למרות שהפרוטוקול הנוכחי כבר מותאם לבודד ותאי iNKT תרבות עכברית, יכולים לשמש גם צעדי ההעשרה המתוארים במסמך זה כדי לבודד וללמוד המהגרים iNKT האחרונים הרתי (RTEs) 16 וניתן להתאים להעשרה וללאפיין T הנדיר אחר אוכלוסיות תאים על ידי FACS.
"Jove_content"> ביחד, אנו מגדירים גישה מותאמת שיכול לשמש כדי ליצור את היעילות עד 10 8 תאי iNKT מהטחולים של שלושה עכברים תוך 3 שבועות. תאי iNKT שנוצרו באופן זה שומרים על היכולת להפריש ציטוקינים על גירוי, מה שהופך אותם שימושיים עבור ניסויי העברת מאמצת והמחקר של ביולוגיה של תא iNKT in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| recombinant murine IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| recombinant murine IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| recombinant murine IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purified anti-mouse CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purified anti-mouse CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ - free] |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipment | |||
| 96-well plate F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| 24-well plate | Greiner-bio one | 665-180 | |
| 6-well plate | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml falcon tube | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µm filter | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µm filter | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separator | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Water-jacketed CO2 incubator | VWR | ||
| Hemocytometer | VWR | ||
| Dissection Kit | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
References
- Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
- Kronenberg, M., Gapin, L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).
- Park, S. H., et al. The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families. J Exp Med. 193, 893-904 (2001).
- Zhou, D., et al. Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells. Science. 306, 1786-1789 (2004).
- Cardell, S., et al. CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice. J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).
- Kawano, T., et al. CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides. Science. 278, 1626-1629 (1997).
- Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma. Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis. Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).
- Molling, J. W., et al. Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity. J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128, 324-333 (2009).
- Gumperz, J. E., et al. Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids. Immunity. 12, 211-221 (2000).
- Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. Diverse TCRs recognize murine CD1. J Immunol. 162, 161-167 (1999).
- Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells. Nature protocols. 3, 70-78 (2008).
- Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).
- Osborne, G. W. A method of quantifying cell sorting yield in 'real time'. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).
- Drennan, M. B., et al. The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages. J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).
