Abstract
La capacità di secernere rapidamente citochine dopo stimolazione è una caratteristica funzionale del invariante natural killer T (iNKT) linea cellulare. iNKT cellule sono quindi caratterizzati da una popolazione di cellule T innata capace di attivare e sterzo adattivo risposte immunitarie. Lo sviluppo di tecniche migliorate per la coltura e l'espansione di cellule murine iNKT facilita lo studio della biologia cellulare iNKT in vitro ed in sistemi modello in vivo. Qui si descrive un procedimento ottimizzato per l'isolamento e l'espansione di cellule spleniche iNKT murine.
Milza di topi C57BL / 6 vengono rimossi, sezionati e tese e la sospensione cellulare risultante è stratificato su supporti gradiente di densità. Dopo la centrifugazione, le cellule mononucleate spleniche (MNC) sono raccolti e CD5 positivi (CD5 +) linfociti sono arricchiti per l'utilizzo di sfere magnetiche. cellule iNKT all'interno della frazione CD5 + sono successivamente colorate con ^5; GalCer-caricato CD1d tetramero e purificata mediante la fluorescenza delle cellule attivate (FACS). FACS ordinati cellule iNKT sono quindi inizialmente coltivate in vitro utilizzando una combinazione di citochine ricombinanti murine e recettore delle cellule T piastriforme bound (TCR) stimoli prima di essere espanso in presenza di IL-7 murina ricombinante. Utilizzando questa tecnica, di circa 10 8 cellule iNKT possono essere generati entro 18-20 giorni di coltura, dopo di che possono essere utilizzate per saggi funzionali in vitro o in vivo per esperimenti di trasferimento nei topi.
Introduction
Murino invarianti natural killer T (iNKT), le cellule sono una popolazione distinta di linfociti T innate selezionati nel timo by-CD1d esprimendo timociti corticali 1,2. iNKT cellule esprimono un recettore delle cellule T (TCR) costituito da una catena invariante Vα14-Jα18 TCR accoppiato con entrambi Vβ8, Vβ7 o Vβ2 TCR 3, che è in grado di riconoscere endogena così come antigeni estranei lipidi nel contesto CD1d. Per esempio, le cellule murine iNKT riconoscono e sono attivati da un antigene chiamato isoglobotrihexosylceramide lipidica endogena (iGb3) 4, nonché α-galactosylceramide (αGalCer) 5,6, un glicolipide isolato da spugne marine. TCR-dipendente attivazione delle cellule iNKT promuove il priming delle risposte immunitarie adattative, e come risultato, le cellule iNKT hanno dimostrato di essere funzionalmente coinvolti nel miglioramento o lo sviluppo di una serie di patologie comprese malattia reumatica 7 e cancro <sup> 8. Attualmente, ligandi di cellule iNKT sintetiche costituiscono promettenti nuovi coadiuvanti che possono essere in grado di regolare una serie di condizioni immunopatologiche.
È stato precedentemente dimostrato che le cellule iNKT possono essere generati in vitro dopo isolamento dal tessuto del mouse tuttavia; molti di questi studi impiegano l'uso di cellule primarie presentanti l'antigene (APC) e / o linee cellulari 9, Vα14 TCR transgenici (Tg) topi 10, timomi o per la generazione di cellule derivate iNKT ibridomi 11,12. Inoltre, un gran numero di topi, elevati volumi di reagenti, quali dimeri CD1d αGalCer-caricati, e tempi lunghi di cultura fanno alcuni protocolli pubblicati meno eticamente ed economicamente accattivante 9,13.
In questo rapporto si descrive un metodo adatto per l'isolamento e l'espansione delle cellule iNKT vitro da topo milza. Più specificamente, il protocollo descrive un metodoper arricchire le cellule iNKT da milza del mouse che riduce i topi, i reagenti e il tempo richiesto per l'ordinamento delle cellule FACS, e propone un approccio ottimizzato per espandere le cellule iNKT milza ordinati in vitro.
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Protocol
In questo studio, sono stati utilizzati per adulti (6-8 settimane) femmina C57BL / 6 topi. I topi sono stati ospitati e allevati secondo le linee guida del vivaio Università di Gand. Tutte le procedure di animali sono stati approvati dalla cura degli animali e Comitato Etico Istituzionale.
1. Preparazione di cellule mononucleate (MNC) da Spleen mouse
- Sacrifica il mouse per dislocazione cervicale.
- Posizionare il mouse verso il basso sul tavolo di dissezione e fissare la cerva e zampe anteriori con perni.
- Sterilizzare la pelle-superficie con il 70% (v / v) di etanolo / H 2 O.
- Tagliare la pelle lungo la linea mediana addominale al torace ed esporre la milza con strumenti chirurgici sterili.
- Dopo il taglio dei tessuti grassi circostanti, posizionare la milza in una piastra da 24 pozzetti contenenti 1 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS) a temperatura ambiente.
- Sezionare la milza con un bisturi sterile e trasferire i pezzi in un filtro di nylon 70 micron collocato all'interno di una vasca 50 mle.
- Usando una 2 ml stantuffo della siringa, schiacciare delicatamente i pezzi milza attraverso il filtro delle cellule e lavare con 5 ml di PBS 1X.
- Aggiungere 3 ml di Ficoll-Paque in una provetta da 15 ml e sovrapporre il mezzo gradiente di densità con la sospensione cellulare 5 ml.
- Centrifugare a 400 xg per 20 min a temperatura ambiente senza freno.
- Trasferire il interfase a un nuovo tubo da 15 ml, aggiungere 10 ml di freddo PBS 1X e centrifugare a 300 xg per 10 minuti a 4 ° C.
- Risospendere le cellule in 2 ml di PBS 1x contenente 0,5% di albumina di siero bovino (BSA) e 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (tampone FACS). Trasferire 10 ml di sospensione cellulare in un piccolo tubo, mescolare con 10 ml di 0,4%
2. Arricchimento, rilevamento e purificazione delle cellule del mouse iNKT
- Arricchimento di topo milza CD5positive (CD5 +) linfociti.
- (Opzionale) Stain 10 5 cellule con FITC-coniugato anti-CD5 (4 ml di 1:30 diluizione / 10 6 celle)per 30 minuti a 4 ° C al buio, lavare con 200 ml FACS buffer e risospendere in 500 microlitri di buffer FACS. Preparare una soluzione di lavoro 20 mM di 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) in PBS 1x, aggiungere 1 ml della stessa a 10 5 cellule in tampone FACS e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Acquisire 10 4 cellule pre-arricchito sul citofluorimetro.
- Utilizzando FCS-H e FCS-W, cancello elettronico su cellule Lo FSC W di escludere doppietti cellulari e aggregati (Figura 1A). Allora cancello elettronico fuori DAPI + (morti), le cellule all'interno del FSC W lo popolazione (Figura 1B), e utilizzano SSC-A e FCS-A per selezionare elettronicamente la popolazione linfocitaria per dimensione (Figura 1C).
- Utilizzando cellule all'interno del gate linfocitario, tracciare SSC-A contro CD5 e elettronicamente cancello CD5 + linfociti come mostrato nella Figura 1D. Acquisire il resto del campione pre-arricchito sul citometro a flusso.
- Regolare conta delle cellule a 10 7 cellule per 90 microlitri di buffer di FACS e aggiungere 10 microlitri anti-CD5 microsfere.
- Incubare a 4 ° C per 15 minuti, lavare una volta con 4 ml FACS tampone e risospendere in 500 microlitri di buffer FACS freddo. Arricchisci per CD5 + linfociti con separazione delle cellule magnetico (MACS) colonne secondo le raccomandazioni del fabbricante.
- Opzionale) Macchia 10 5 cellule con FITC-coniugato anti-CD5 (4 l di diluizione 1:30 / 10 6 celle) e DAPI come in 2.1.1. Acquisire 10 4 linfociti arricchite sul citofluorimetro e verificare che i varchi elettronici creati al punto 2.1.1. selezionare CD5 + linfociti nel frazione cellulare arricchito. Acquisire 10 5 cellule sul citometro a flusso e analizzare la percentuale CD5 + linfociti presenti nella frazione arricchita come mostrato nella Figura 1E - H.
- Rilevamento e isolamento di topo iNKT cells di FACS.
- Risospendere CD5 + linfociti arricchiti ad una concentrazione di circa 10 6 cellule per 20 microlitri tampone FACS contenente in anti-CD16 / CD32 (4 ml di diluizione 1:50 / 10 6 cellule) e αGalCer PE-coniugato / CD1d tetramero (1 mg / 10 6 cellule).
- Incubare per 30 minuti a RT al buio.
- Diluire anticorpi murini (mAbs) anti-CD3ε V500 (4 ml di 1:20 diluizione / 10 6 celle), anti-CD19 E450 (4 l di diluizione 1:50 / 10 6 celle) e anti-CD8α E450 (4 ml di 1:50 / 10 6 cellule) in tampone FACS, aggiungi CD5 + linfociti e incubare per 30 min a 4 ° C al buio.
- Lavare le cellule con 1 ml tampone FACS per centrifugazione a 300 xg per 10 min a 4 ° C e risospendere in 4 ml di tampone FACS ad una concentrazione finale di 10 7 cellule / ml.
- Filtrare le cellule attraverso un colino cella 30 micron e posizionare le cellule in ghiaccio.
- Calibrare il citofluorimetro per la cella di smistamento secondo le raccomandazioni del costruttore 14,15.
Nota: Calibrazione di un citometro di flusso per l'ordinamento delle cellule richiede una formazione e può essere eseguita da un operatore esperto, o un tecnico specializzato. - Aggiungere 10 ml di una soluzione di lavoro 20 pM di DAPI per 10 6 cellule e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Acquisire circa 10 4 CD5 + linfociti arricchito sul citofluorimetro. Elettronicamente cancello cellule Lo FSC-W escludere doppietti cellulari e aggregati (Figura 2A). Allora cancello elettronico fuori DAPI + CD8 + CD19 + cellule (canale di scarico) all'interno del FSC W lo popolazione (Figura 2B), e utilizzare SSC-A e FCS-A per selezionare elettronicamente linfociti (Figura 2C), come descritto nella 2.1.1.1 .
- Trama αGalCer / CD1d tetramero da CD3ε ed elettronicamente cancello αGalCer / CD1dcellule tetramero + CD3ε + iNKT come mostrato nella Figura 2D. Cellule presenti nella frazione cellulare arricchita acquistare più del 2 x 10 5 CD5 + linfociti arricchiti per determinare la percentuale αGalCer / CD1d tetramero + CD3ε + iNKT.
- Utilizzando i varchi elettronici creati in 2.2.7., Le cellule FACS sorta αGalCer / CD1d tetramero + CD3ε + iNKT sul citofluorimetro a 70 psi utilizzando un ugello di 70 micron ad un flusso di '1.5'. Raccogliere le cellule iNKT ordinati in una provetta contenente 1 ml FACS 100% FCS. Successivamente lavare cellule iNKT filtrate dal lato del tubo FACS utilizzando 10 ml RMPI 1640 e centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min a 4 ° C.
- Risospendere allineati cellule iNKT in 1 ml RPMI 1640 medium e acquisire 40 microlitri dello stesso su un citofluorimetro per valutare la purezza delle cellule iNKT ordinati. Selezionare FSC-W lo DAPI - linfocitis come descritto in 2.2.7. (Figura 2E - G) ed elettronicamente cancello αGalCer / CD1d cellule tetramero + CD3ε + iNKT come mostrato nella Figura 2H.
3. Cultura ed espansione di cellule iNKT mouse
Giorno 0
- Cappotto una piastra da 96 pozzetti a fondo piatto con purificata anti-CD3ε (3 mg / ml) per pozzetto per 1 ora a temperatura ambiente. Lavare due volte con 200 microlitri di PBS 1x e una volta con 200 microlitri completa terreno RPMI 1640 (10% vol / vol FCS, 100 U / ml di penicillina-streptomicina, 5.5 mM β-mercaptoetanolo).
- Contare il numero di cellule vitali filtrate iNKT (fase 2.2.8) utilizzando un emocitometro 0,4% come 1.11., Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C e risospendere a 5 x 10 5 cellule / ml in RPMI completo 1640 contenente ricombinante IL-2 murino (10 ng / ml), ricombinante murino IL-12 (1 ng / ml) e solubile CD28 anti-topo (5 mg / ml). Piastreorted cellule iNKT a 10 5 cellule / pozzetto in piastre rivestite anti-CD3ε e incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 per 2 giorni.
Giorno 2
- Trasferire le cellule ad una non rivestito 96 pozzetti a fondo piatto fresco e coltura delle cellule in condizioni di riposo in completo RPMI 1640 medium a 37 ° C in un incubatore CO 2 per 2 giorni.
Giorno 4
- Rimuovere le cellule dalla piastra delicatamente pipettando e trasferire le cellule a una nuova provetta da 15 ml. Centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C, risospendere a 5 x 10 5 cellule / ml in RPMI completo 1640 medium contenente ricombinante IL-7 murina (5 ng / ml), e la piastra 10 5 cellule / pozzetto in una piatta fondo 96 pozzetti per 4 giorni a 37 ° C in un incubatore CO 2.
Giorno 8
- Raccogliere le cellule in una nuova provetta, centrifugare a 300 xg per 10 min a 4 ° C e risospendere a 5 x 10 5 cellule / ml in RPMI completo 1640 medium contenente solubile anti-CD28 (5 mg / ml).
- Cappotto una piastra da 96 pozzetti a fondo piatto con purificata anti-CD3ε (3 mg / ml) per bene e lavare come in 3.1. Piatto 10 5 cellule / pozzetto in piastre anti-CD3ε rivestiti e incubare a 37 ° C in un incubatore CO 2 fino al giorno 11.
Giorno 11-18
- Ripetere i passaggi 3,4-3,6.
Giorno 19-20
- Trasferire le cellule ad un nuovo tubo 15 ml, centrifugare a 300 xg e risospendere a 5 x 10 5 cellule / ml in RPMI 1640 medium completo.
- Cellule piastra a 10 5 cellule / pozzetto in una piastra da 96 pozzetti a fondo piatto e permettere alle cellule di riposare per 2 giorni a 37 ° C in un incubatore CO 2 prima dell'uso in un esperimento.
4. citochine da parte delle cellule iNKT mouse usando una CD1d Plate-bound Assay
- Cappotto una piastra da 96 pozzetti a fondo piatto con 100 ml di murino ricombinante CD1d (10 mg / ml in PBS 1x) per pozzetto e incubare per 1 ora a 37 ° C.
- Lavare quattro volte con 200 microlitri di PBS 1x, aggiungere 200 ml di 2% FCS in PBS 1x (soluzione bloccante) per pozzetto ed incubare per 2 ore a 37 ° C.
- Rimuovere la soluzione di saturazione, aggiungere 200 ml di αGalCer (5 ng / mL) per ogni bene, e incubare la piastra a 37 ° C per 16 ore. [Per la preparazione della soluzione αGalCer, aggiungere 1.085 μ 1x PBS a 55 mg di αGalCer sciolto in mezzo contenente 96 mg / ml di saccarosio, 10 mg / ml di sodio desossicolato e 5 mg / ml di Tween 20].
- Dopo l'incubazione, scartare la soluzione αGalCer e lavare il ben due volte con 200 microlitri PBS 1x seguito da 200 ml completo RPMI 1640 medie.
- Raccogliere le cellule iNKT espanse in vitro a giorno 21, centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min a 4 ° C e risospendere in completa RPMI 1640 ad una concentrazione di 0,5 x 10 6 cellule / ml.
- Aggiungere 200 ml di risospensione delle cellule iNKT per pozzetto e incubare per 72 ore a 37 ° C in un incubatore CO 2.
- Raccogliere il surnatante e misura citochine di interesse da parte di immunoassorbimento enzyme-linked assay (ELISA) secondo il protocollo del produttore.
- (Opzionale) Stain 10 5 cellule con FITC-coniugato anti-CD5 (4 ml di 1:30 diluizione / 10 6 celle)per 30 minuti a 4 ° C al buio, lavare con 200 ml FACS buffer e risospendere in 500 microlitri di buffer FACS. Preparare una soluzione di lavoro 20 mM di 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) in PBS 1x, aggiungere 1 ml della stessa a 10 5 cellule in tampone FACS e incubare a temperatura ambiente per 5 min. Acquisire 10 4 cellule pre-arricchito sul citofluorimetro.
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Representative Results
L'isolamento delle cellule mononucleari spleniche mediante gradiente di densità richiede circa 1 ora ed elimina l'uso di reagenti necessari per la lisi dei globuli rossi (RBC). Un alto rendimento di cellule vitali è ottenuto utilizzando questo metodo e detriti generati durante sforzare dell'organo viene rimosso. Tipicamente, la frequenza di cellule iNKT nel pool di linfociti splenici compresa tra 1 e 5% del totale di linfociti T tuttavia, questo può variare a seconda dello stato età, il sesso e la salute degli animali utilizzati. Circa 10 6 cellule iNKT possono essere acquistati dalle milze combinati di 3 topi e il più alto rendimento di cellule iNKT sono ottenuti da milze di 6-8 settimane di età topi.
L'uso di topo anti-CD5 sfere magnetiche arricchisce sostanzialmente per le cellule iNKT all'interno della frazione MNC splenica e, a parte una frazione minore dei linfociti B che esprimono l'antigene CD5, la maggioranza delle cellule isolato utilizzando questa procedura costituisce CD5 + linfociti. Ad esempio, il 5-8% delle multinazionali ottenuti dopo CD5 arricchimento sono CD5-negativi (Figura 1 H). Per FACS di cellule iNKT di smistamento, che conciliano αGalCer / CD1d tetramero e anti-topo CD3ε produce purezze cellule iNKT sopra il 98% però, FACS canali discarica per splenica B e cellule T CD8 dovrebbero essere utilizzati per eliminare le popolazioni "collose" linfociti durante l'ordinamento. Inoltre, cancello eventuali doppietti che possono formarsi durante la fase di arricchimento CD5. Usando questa configurazione FACS, abbiamo ottenuto purezze cellule iNKT post-genere nell'ordine del 99% (Figura 2H).
Stimolare 10 6 cellule iNKT filtrate con piastra-bound anti-CD3ε in presenza di IL-2, IL-12 e anti-CD28 solubile determinato una espansione 3 volte di numeri iNKT seguenti 2 giorni di coltura (Figura 3). Successivi cellule espansione iNKT in presenza di IL-7 risultati in un 3 a 4 volte aumento del numero di cellule presenti al giorno 4 in coltura iNKT. Notably, ripetendo queste condizioni di coltura può produrre una media di 7 x 10 7 cellule iNKT dopo due turni di espansione, senza alcuna perdita visibile di cellule tra l'evoluzione cultura dei media in giorni diversi (Figura 3). Così, le cellule iNKT milza murine possono essere estese almeno 70 volte utilizzando queste condizioni in 18 giorni.
Abbiamo anche valutato la citochina producendo capacità delle cellule iNKT espanse dalla stimolazione con piastra-bound murino ricombinante CD1d caricato con αGalCer. A 48 ore post-stimolazione, IL-2, IL-4, IFN-γ, TNF-α e IL-6 potrebbe essere facilmente rilevato in sovranatanti di coltura mediante ELISA (Figura 4). Cellule iNKT Expanded mantengono quindi la capacità di produrre citochine Th1 e Th2 post-espansione.
Figura 1. Arricchimento per CD5 +linfociti da topo multinazionali della milza. Strategia di gating per l'analisi della percentuale di CD5 + linfociti presenti in pre-arricchito (AD) e cellule magnetico separazione arricchiti (EH) del mouse sospensioni MNC della milza. Doppietti cellulari (A, E) e le cellule morte (B, F) sono stati esclusi con FSC-H contro FCS-W e DAPI contro trame FSC-A, rispettivamente. La percentuale CD5 + cellule presenti all'interno del cancello di linfociti (C, G) sia prima che dopo arricchimento sono mostrati in D e H, rispettivamente. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Fico ure 2. FACS ordinamento cellule iNKT da MNC milza CD5-arricchiti. Strategia di gating per l'analisi della percentuale αGalCer / CD1d cellule presenti prima tetramero + CD3ε + iNKT (A - D) e dopo (E - H) FACS ordinamento. La strategia di gating elimina doppietti cellule (A, E), le cellule morte e CD8 + CD19 + linfociti (B, F) dall'analisi tracciando FSC H contro FCS-W e DAPI, CD8 e CD19 (canale discarica) contro FSC A, rispettivamente. La percentuale αGalCer / CD1d cellule presenti nel gate linfocitario (C, G) prima e dopo FACS ordinamento tetramero + CD3ε + iNKT sono mostrati in (D) e (H), rispettivamente. CD1d-Tet., ΑGalCer / CD1d Tetramero.ottenere = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Numero assoluto di cellule iNKT generati in vitro. Piegare aumento del numero di cellule iNKT nei punti di tempo indicato dopo 3 settimane di espansione in vitro. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. citochine capacità delle cellule iNKT espanse in vitro la produzione. Giorno 20 cellule iNKT espanse sono state stimolate in vitro con il mouse αGalCer-caricato CD1d. Dopo 72 hr surnatanti sono stati raccolti e analizzati per la presenza di IFN-γ, IL-4, TNF-α, IL-2 e IL-6 mediante ELISA. Barre rappresentano significa SEM (n = 2). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Passaggi critici nel protocollo corrente comprendono l'isolamento e successivo arricchimento di linfociti CD5 + (Sezione 1 e 2), FACS ordinamento (sezione 3) e il fasciame iniziale di cellule iNKT (sezione 4). Dei provvedimenti nella Sezione 1, ricordarsi di strato con attenzione la sospensione cellulare milza nel medio gradiente di densità tale che un interfasica cellulare distinta viene generato dopo la centrifugazione. La successiva arricchimento per CD5 + linfociti di separazione cellulare magnetica (sezione 2) riduce al minimo i reagenti e il tempo necessari per colorare e FACS le cellule sorta iNKT (Sezione 3), che aiuta le rese di cellule iNKT incremento post-tipo. Infine, è importante sementi non più di 10 5 cellule per pozzetto iNKT per i primi 2 giorni di coltura (sezione 4) come semina pozzetti con numeri elevati di cellule iNKT può causare apoptosi cellulare.
Un certo numero di considerazioni sono importanti quando si modifica e / o isoluting questo protocollo: in primo luogo, l'età degli animali utilizzati è importante. Gli animali che sono troppo vecchio, o che hanno infezioni accessori, possono ostacolare la capacità di isolare, di distinguere, e FACS ordinamento cellule sufficiente dalla milza. In secondo luogo, quando la colorazione con tetrameri αGalCer / CD1d, è importante mantenere il volume di cellule risospese in tampone PBS partire da un volume troppo alto diluisce l'efficienza colorazione del tetramero αGalCer / CD1d, che a sua volta riduce il raggruppamento di tetramero + cellule iNKT da FACS. Idealmente, la presenza di tetramero + iNKT cellule αGalCer / CD1d strettamente cluster durante l'acquisizione FACS permette di gating più accurata da FACS e rendimenti più elevati percentuali iNKTs purezza durante l'analisi post-tipo. Questo è importante perché i rendimenti di cellule iNKT ordinati inferiori comporterà la conseguenza di altre popolazioni di cellule T contaminanti durante la coltura. In terzo luogo, continuamente aggiornare medio che diventa giallo durante la cultura e l'espansione di iNKT cells. Ad esempio, sostituire il 50% delle medie ingiallita dal nuovo mezzo contenente le citochine appropriate, in particolare durante i giorni 8 e 11 giorni di cultura. i rendimenti cellule iNKT possono essere massimizzati in questo modo.
A nostra conoscenza questo è il primo protocollo di espansione iNKT per includere un gradiente di densità e CD5 + passo linfociti di arricchimento per l'isolamento e l'arricchimento di cellule iNKT da topo milza. Un certo numero di approcci alternativi sono stati esplorati per arricchire le cellule iNKT milza compresa dimeri αGalCer / CD1d 13, Vα14 TCR Tg topi 10, così come la deplezione di cellule non-T per la separazione delle cellule magnetica 9. Tuttavia, anche se le cellule iNKT può essere ampliato con successo in vitro utilizzando questi approcci, tali metodi richiedono né grandi quantità di dimeri αGalCer / CD1d per arricchire per iNKTs 13, solo generare cellule iNKT transgeniche 10, o contemporaneamente dare luogo ad alcune linee di cellule non iNKT 9 </ sup>. Inoltre, l'uso della piastra-bound anti-CD3ε per mantenere ed espandere cellule iNKT ordinati (sezione 4) esclude un requisito per APC attivate durante l'espansione in vitro iNKT 9. In questo contesto, un protocollo di espansione iNKT senza APC ha il vantaggio di non dover separare APC da cellule iNKT espanse prima dell'iniezione in vivo. Bisogna però anche aggiungere che il protocollo descritto è limitata dal fatto che il ricercatore richiede un facile accesso a, nonché la relativa formazione, per calibrare e gestire un sorter FACS. Purtroppo selezionatrici FACS sono costosi e non sono sempre disponibili in ogni laboratorio. Tuttavia, anche se l'attuale protocollo è stato ottimizzato per isolare e cultura murine cellule iNKT, le fasi di arricchimento qui descritti possono essere utilizzati per isolare e studiare iNKT recenti emigranti timici (Rtes) 16 e possono essere adattati per arricchire e caratterizzare altri rari T popolazioni di cellule di FACS.
8 cellule iNKT dalle milze di tre topi entro 3 settimane. cellule iNKT generate in questo modo mantengono la capacità di secernere citochine dopo la stimolazione, che li rende utili per esperimenti di trasferimento adottivi e lo studio della biologia delle cellule iNKT in vivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material | |||
| recombinant murine IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| recombinant murine IL-12 | eBiosciences | 39-8122-65 | |
| recombinant murine IL-7 | eBiosciences | 14-8071 | |
| purified anti-mouse CD3e (145-2C11) | eBiosciences | 16-0032-86 | |
| purified anti-mouse CD28 (37.51) | eBiosciences | 16-0281-85 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD19 (eBio1D3) | eBiosciences | 48-0193-82 | |
| e450-conjugated anti-mouse CD8α (53-6.7) | eBiosciences | 48-0081-82 | |
| FITC-conjugated anti-mouse CD5 (53-7.3) | eBiosciences | 11-0051-81 | |
| V500-conjugated anti-mouse CD3ε (500A2) | BD biosciences | 560771 | |
| anti-mouse CD5 (Ly-1) microbeads | Macs Miltenyi Biotec | 130-049-301 | |
| purified anti-mouse CD16/32 (2.4G2) | Macs Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| MACS MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Trypan Blue, 0.4% (wt/vol) | Gibco | 15250-061 | |
| RPMI 1640 medium | Gibco | 12633-020 | |
| 1x PBS | Gibco | 10010-056 | [Ca2+/Mg2+ - free] |
| Fetal calf serum | Gibco | 10270 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-123 | |
| Penicillin-streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100MG | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | |
| Ficoll-Paque plus | GE Healthcare | 71-7167-00 AF | |
| Equipment | |||
| 96-well plate F-bottom | Greiner-bio one | 657-160 | |
| 24-well plate | Greiner-bio one | 665-180 | |
| 6-well plate | Greiner-bio one | 655-180 | |
| 15 ml falcon tube | Greiner-bio one | 188-271 | |
| 50 ml falcon tube | Greiner-bio one | 227-261 | |
| 70 µm filter | Greiner-bio one | 542-070 | |
| 30 µm filter | Millipore | SVGP01050 | |
| MiniMACS separator | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS Columns | Macs Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Water-jacketed CO2 incubator | VWR | ||
| Hemocytometer | VWR | ||
| Dissection Kit | VWR | ||
| BD FACSAria III | BD Biosciences |
References
- Bendelac, A., Rivera, M. N., Park, S. H., Roark, J. H. Mouse CD1-specific NK1 T cells: development, specificity, and function. Annu Rev Immunol. 15, 535-562 (1997).
- Kronenberg, M., Gapin, L. The unconventional lifestyle of NKT cells. Nat Rev Immuno. 2, 557-568 (2002).
- Park, S. H., et al. The mouse CD1d-restricted repertoire is dominated by a few autoreactive T cell receptor families. J Exp Med. 193, 893-904 (2001).
- Zhou, D., et al. Lysosomal glycosphingolipid recognition by NKT cells. Science. 306, 1786-1789 (2004).
- Cardell, S., et al. CD1-restricted CD4+ T cells in major histocompatibility complex class II-deficient mice. J Exp Med. 182, 993-1004 (1995).
- Kawano, T., et al. CD1d-restricted and TCR-mediated activation of valpha14 NKT cells by glycosylceramides. Science. 278, 1626-1629 (1997).
- Drennan, M. B., Aspeslagh, S., Elewaut, D. Invariant natural killer T cells in rheumatic disease: a joint dilemma. Nat Rev Rheumatol. 6, 90-98 (2010).
- Terabe, M., Berzofsky, J. A. NKT cells in immunoregulation of tumor immunity: a new immunoregulatory axis. Trends Immunol. 28, 491-496 (2007).
- Molling, J. W., et al. Generation and sustained expansion of mouse spleen invariant NKT cell lines with preserved cytokine releasing capacity. J Immunol Methods. 322, 70-81 (2007).
- Chiba, A., et al. Rapid and reliable generation of invariant natural killer T-cell lines in vitro. Immunology. 128, 324-333 (2009).
- Gumperz, J. E., et al. Murine CD1d-restricted T cell recognition of cellular lipids. Immunity. 12, 211-221 (2000).
- Behar, S. M., Podrebarac, T. A., Roy, C. J., Wang, C. R., Brenner, M. B. Diverse TCRs recognize murine CD1. J Immunol. 162, 161-167 (1999).
- Watarai, H., Nakagawa, R., Omori-Miyake, M., Dashtsoodol, N., Taniguchi, M. Methods for detection, isolation and culture of mouse and human invariant NKT cells. Nature protocols. 3, 70-78 (2008).
- Houtz, B., Trotter, J., Sasaki, D. BD FACService TECHNOTES. 9 (4), (2004).
- Osborne, G. W. A method of quantifying cell sorting yield in 'real time'. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 77, 983-989 (2010).
- Drennan, M. B., et al. The thymic microenvironment differentially regulates development and trafficking of invariant NKT cell sublineages. J Immunol. 193, 5960-5972 (2014).
