The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.
Gransker organogenesen i utero er en teknisk krevende prosess i placenta pattedyr på grunn av utilgjengelighet av reagenser til embryoer som utvikler i livmoren. En nyutviklet ex vivo oppreist dråpe kultur metoden gir et attraktivt alternativ til studier utført i livmoren. Den ex vivo dråpe kultur gir mulighet til å undersøke og manipulere cellulære interaksjoner og ulike signalveier gjennom bruk av ulike blokkering og aktiverende forbindelser; i tillegg kan effekten av forskjellige farmakologiske reagenser om utvikling av spesifikke organer studeres uten uønskede bivirkninger av systemisk medikamentavgivelse in utero. I forhold til andre in vitro-systemer, dråpe kulturen ikke bare tillater muligheten til å studere tredimensjonale morfogenese og celle-celle-interaksjoner som ikke kan reproduseres i pattedyrcellelinjer, men også krever betydelig mindre reagents enn andre ex vivo og in vitro-protokoller. Dette dokumentet viser riktig musefoster organ disseksjon og stående dråpe kultur teknikker, etterfulgt av hele organet immunofluorescens for å demonstrere effektiviteten av fremgangsmåten. Den ex vivo dråpedyrkningsmetode som tillater dannelse av organ arkitektur kan sammenlignes med hva som er observert in vivo og kan anvendes for å studere ellers er vanskelige å studere fremgangsmåter på grunn av embryonisk dødelighet in in vivo-modeller. Som en modell søknadssystem, vil et lite molekyl-inhibitor anvendes for å undersøke rollen til vaskularisering i testiklene morfogenese. Denne eks vivo dråpedyrkningsmetode kan utvides til andre fosterorgansystemer, som for eksempel lunge- og potensielt andre, selv om hvert organ må være grundig studert for å bestemme eventuelle organspesifikke modifikasjoner i protokollen. Dette organet kultur system gir fleksibilitet i eksperimentering med føtale organer, og resultater som ble oppnåddd hjelp av denne teknikken vil hjelpe forskere få innsikt i fosterutviklingen.
Organ regenerering in vivo hos mennesker er svært begrenset; derfor, tissue engineering, utvikling av vev og organer fra enkeltceller donert av en vert, blir en attraktiv potensiell terapi for orgel erstatning. Men for denne terapeutisk strategi for å være vellykket, faktorer og cellulære reaksjoner som er involvert i morfogenesen av organet må være grundig studert og godt forstått. På grunn av manglende evne til å studere utvikling av spesifikke organer med tradisjonelle tilnærminger, har forskerne slått til alternative hele embryo eller hele organkulturer. Kalaskar et al. 1 har vist at ex vivo hele embryogenese kultur gir sammenlignbare resultater (i 58% av kultur embryo) til i utero utviklingen, noe som tyder på at ex vivo kultur metoder er et mulig alternativ for organ studier.
En individualisert organkultursystem, slik som denne ex vivo hydroPlet kultur system, åpner for helt organ analyse uavhengig av systemiske effekter, mens tillater manipulering av et bestemt signalveien eller cellulære interaksjoner via tilsetting av farmakologiske reagenser eller antistoffer. Tradisjonelt har studier av fosterets organutvikling vært begrenset til transgene og knockout mus teknologier, i tillegg til farmakologiske reagenser levert matern. Men det er tekniske problemer som involverer disse teknikkene og behandlinger i vivo; de fleste bekymringer dreie seg om virkningene av å påvirke ulike organer samtidig som ofte resulterer i embryonale dødelighet. En ekstra bekymring for studier manipulere fosterutvikling farmakologisk er mors effekten av narkotika på embryonal utvikling i livmoren (for eksempel mors metabolismen av stoffet før det når embryo) og hvis slike reagenser kan passere gjennom placenta.
Hele organ kultur teknikken beskrevether ble tilpasset fra en protokoll som først beskrevet av Maatouk et al. 2, hvor hele føtale gonader inkuberes i ex vivo oppreist dråpe kulturer. En vesentlig fordel med dyrking foster gonadene er at små-molekyl hemmere kan lett få tilgang til hele organet ved enkel diffusjon. . DeFalco et al har vist at bruk av denne ex vivo dråpedyrkningsmetode i forbindelse med små-molekyl-inhibitorer kan anvendes til å studere aliserte prosesser og interaksjoner som forekommer i løpet av gonade utvikling 3; Disse fremgangsmåter ville være vanskelig å undersøke in vivo på grunn av tekniske utfordringer (f.eks passasje av medikamenter gjennom placenta eller letalitet til å påvirke flere organer ved hjelp av genetiske eller farmakologiske metoder).
Dråpen kultur er ikke bare en forbedring i visse aspekter enn i utero eksperimentering, men også at det er en forbedring av in vitro og ex viVo systemer. Bruken av cellelinjer for å studere morphogenesis er meget vanskelig fordi de mangler de forskjellige celletypene, mangler kritiske ekstracellulære matriks (ECM) komponenter som tillater dannelse av organ-arkitektur, og kan fremvise gjenstander i signaleringskaskader. Selv tissue engineering har gjort betydelige forbedringer i å skape stillaser simulere ECM, gjør mangel på kunnskap med hensyn til hvilke signaler som kreves av hver celletype under organ det utfordrende å bygge et organ system in vitro. Andre ex vivo-systemer tidligere har blitt etablert for å studere organogenesen, eller mer spesifikt morphogenesis, og har vært svært vellykket for live avbildning av føtale organer i agar 4, transwells 5, filtre 6, og andre stillas matriser 7,8. Fordelen med dråpe kulturen system er at det tillater studiet av morfogenese ved å tilveiebringe evnen til å utnytte mindre reagenser, som er often kostbare, men også å gi organ overflatespenning, noe som er viktig for vekst og signaleringsfunksjoner 9.
I mus, tar innledende testis morphogenesis sted mellom embryonale (E) iscenesetter E11.5 og E13.5; disse trinn omfatter den optimale tidsvinduet for behandlingen av faktorer som påvirker kjønnsspesifikke differensiering. Blant de kritiske prosesser som oppstår under testis dannelse er generering av testis ledning arkitektur og dannelse av en testikkel-spesifikke vaskulære nettverk. Ved hjelp av denne ex vivo hele organet dråpekultursystem, er man i stand til å endre hann-spesifikke vaskularisering og hemme testis morphogenesis ved bruk av et lite molekyl-inhibitor som blokkerer aktiviteten av reseptorer for vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF); VEGF-mediert vaskulær remodellering er kritisk for utvikling testis 10-12. Denne teknikken kan med hell brukes til andre organer og kan målrette bestemt tidspunktvinduer med utvikling. Hel-mount organ bildebehandling tillater visualisering av vitale strukturer samt strukturelle og celleforandringer som følge av bruk av ulike hemmere. Viktigere, er dette systemet en fordel ved at forskeren kan omgå potensielle konfunderende effekter fra mors Drug Administration eller systemisk avbrudd under in vivo målrettede genet strategier. Dermed kan hele dette organet ex vivo dråpe kultur system betydelig forbedre evnen til å forstå samspillet og varslere som oppstår spesielt innenfor bestemte organer under fosterutviklingen.
Denne studien viser en ex vivo hele organ dråpe metode som har mange mulige bruksområder for å studere fosterutvikling. Denne teknikken kan brukes til flere organer, og tillater forskeren å løse biologiske spørsmål som er vanskelig å undersøke ved hjelp av in vivo nærmer grunnet utilgjengelighet av embryoer og potensial embryonale dødelighet. Denne kulturen metode har flere fordeler fremfor andre in vitro tilnærminger, slik som pattedyrcellelinjer: hele organer kan benytte…
The authors have nothing to disclose.
The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O’Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) | Fisherbrand | 12-541B | |
Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible | Sally Hansen | N/A | |
8-Strip 0.2 mL PCR Tubes & Detached Flat Caps | GeneMate | T3218-1 | |
Pipetman L P1000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2170 | |
Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2176 | |
10 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1096FR | |
20 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1121 | |
200 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1122 | |
1000 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1126 | |
1 ml syringe with 27gauge needles | BD PrecisionGlide | 309623 | |
10 ml syringe | BD | 305559 | |
0.2 μM PES syringe filter | VWR | 28145-501 | |
Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
Primaria 35mm Easy Grip Style Cell Culture Dish | Falcon/Corning | 353801 | |
Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
Biosafety Cabinet | Nuare | NU-425-400 | |
Mini-centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel | Eppendorf | 950040015 | |
SMZ445 stereomicroscope | Nikon | SMZ445 | |
MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software | Alpha Innotech Corporation | Discontinued | |
Absolute 200 proof Ethanol | Fisher | BP2818-500 | |
Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
Ambion Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
XY PCR Primer | IDT | N/A | |
Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-500 | |
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
1% Ethidium bromide solution | Fisher | BP1302-10 | Toxic |
Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
dNTP Set, 100 mM Solutions | Thermo Scientific | R0182 | |
DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer | Denville | CB-4050-3 | |
Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | Toxic |
FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
Hydrogen Chloride (HCl) | Fisher | A144212 | |
Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation | Bioexpress | 0332-100g | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100-nm filtered | Fisher | 03-600-511 | Heat-inactivate before using |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Use at 1:100 |
Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered | Sigma | D2650 | |
VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II – CAS 269390-69-4 – Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
Rabbit Anti-Sox9 Antibody | Millipore | AB5535 | Use at dilution: 1:4,000 |
Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody | BD Pharmingen | 553370 | Use at dilution: 1:250 |
Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signaling | 9661S | Use at dilution: 1:250 |
Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Use at dilution: 1:500 |
Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen (Molecular Probes) | H1399 | Use at 2ug/ml |
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Use at dilution: 1:500 |
Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Use at dilution: 1:500 |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A31572 | Use at dilution: 1:500 |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21206 | Use at dilution: 1:500 |
Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21208 | Use at dilution: 1:500 |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Life Technologies | A31573 | Use at dilution: 1:500 |