Utilizzando<em> Ex Vivo</em> Upright Droplet Culture di interi organi fetali per studiare i processi evolutivi durante mouse Organogenesi
Summary
The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.
Abstract
Indagare organogenesis in utero è un processo tecnicamente impegnativo in mammiferi placentati a causa dell'inaccessibilità di reagenti di embrioni che si sviluppano all'interno dell'utero. Un metodo di coltura delle gocce di nuova concezione ex vivo verticale fornisce una valida alternativa a studi effettuati in utero. L'ex vivo cultura gocciolina offre la possibilità di esaminare e manipolare interazioni cellulari e vie di segnalazione diverse attraverso l'uso di vari composti di blocco e attivazione; Inoltre, gli effetti di vari reagenti farmacologiche sullo sviluppo di organi specifici possono essere studiati senza effetti collaterali indesiderati di somministrazione di farmaci sistemici in utero. Rispetto ad altri sistemi in vitro, la cultura gocciolina consente non solo la capacità di studiare le interazioni tridimensionale morfogenesi e cellula-cellula, che non può essere riprodotto in linee cellulari di mammifero, ma richiede anche molto meno reagents di altri ex vivo e in vitro. protocolli Questo documento dimostra mouse corretta fetale dissezione organo e verticali tecniche di coltura gocciolina, seguito da tutta immunofluorescenza organo per dimostrare l'efficacia del metodo. La gocciolina metodo di coltura ex vivo permette la formazione di architettura organo paragonabile a quello osservato in vivo e può essere utilizzato per studiare processi altrimenti difficili da studio causa letalità embrionale in modelli in vivo. Come sistema domanda di modello, un inibitore piccola molecola sarà utilizzato per sondare il ruolo della vascolarizzazione nella morfogenesi testicolare. Questo droplet metodo di coltura ex vivo è espandibile fino a altri organi fetali, come polmone e potenzialmente altri, anche se ogni organo deve essere ampiamente studiata per determinare eventuali modifiche organo-specifiche al protocollo. Questo sistema di coltura di organi fornisce la flessibilità nella sperimentazione con organi fetali, e risultati richiederlod utilizzando questa tecnica aiuterà i ricercatori Acquisire conoscenze in sviluppo del feto.
Introduction
La rigenerazione di organi in vivo nell'uomo è molto limitata; di conseguenza, l'ingegneria dei tessuti, lo sviluppo di tessuti e organi da cellule individuali donati da un host, sta diventando una terapia potenziale interessante per la sostituzione degli organi. Tuttavia, per questa strategia terapeutica per avere successo, i fattori e le interazioni cellulari coinvolti nella morfogenesi dell'organo devono essere accuratamente studiati e ben compresi. A causa della incapacità di studiare lo sviluppo di organi specifici con approcci tradizionali, i ricercatori si sono rivolti a embrione intero alternativa o intere culture d'organo. Kalaskar et al. 1 hanno dimostrato che ex vivo cultura tutto l'embriogenesi produce risultati comparabili (nel 58% degli embrioni coltivati) per lo sviluppo nell'utero, suggerendo che ex vivo metodi di coltura sono un'alternativa fattibile per gli studi dell'organogenesi.
Un sistema di coltura organo individualizzato, come questo ex vivo droplet sistema di coltura, consente intera analisi organo indipendente dagli effetti sistemici, pur consentendo manipolazione di un percorso di segnalazione specifica o interazioni cellulari tramite aggiunta di reagenti farmacologici o anticorpi. Tradizionalmente, lo studio di sviluppo degli organi fetali è stata limitata alle tecnologie transgeniche e di topi knockout, in aggiunta ai reagenti farmacologici consegnati materna. Tuttavia, ci sono questioni tecniche che coinvolgono queste tecniche e trattamenti in vivo; la maggior parte delle preoccupazioni ruotano attorno gli effetti di influenzare vari organi contemporaneamente che spesso si traduce in letalità embrionale. Un ulteriore problema degli studi di manipolare sviluppo fetale farmacologicamente è l'effetto materno di farmaci in sviluppo embrionale in utero (ad esempio, il metabolismo materno della droga prima che raggiunga l'embrione) e se tali reagenti possono passare attraverso la barriera placentare.
La tecnica di tutta la cultura organo descrittaqui è stato adattato da un primo protocollo descritto da Maatouk et al. 2, in cui interi gonadi fetali sono incubati in ex vivo culture gocciolina verticali. Un vantaggio significativo di coltura gonadi fetali è che gli inibitori piccole molecole possono facilmente accedere tutto l'organo per semplice diffusione. . DeFalco et al hanno dimostrato che utilizzando questo metodo ex vivo gocciolina cultura in combinazione con inibitori di piccole molecole può essere usato per studiare processi e interazioni che avvengono durante lo sviluppo delle gonadi 3 segnalazione; questi processi sarebbe difficile per esaminare in vivo a causa di problemi tecnici (ad esempio, il passaggio dei farmaci attraverso la placenta o letalità di incidere più organi che utilizzano approcci genetici e farmacologici).
La cultura gocciolina non è solo un miglioramento in alcuni aspetti oltre in utero sperimentazione, ma anche che è un miglioramento rispetto in vitro ed ex visistemi vo pure. L'uso di linee cellulari per studiare morfogenesi è estremamente difficile perché mancano i tipi cellulari diversi, mancano matrice extracellulare (ECM) componenti critici che permettano la formazione di architettura organo, e può esibire effetti in cascate di segnalazione. Anche se l'ingegneria dei tessuti ha introdotto notevoli miglioramenti nella creazione di ponteggi che simulano ECM, la mancanza di conoscenza per quanto riguarda i segnali che sono richieste da ogni tipo di cellula durante l'organogenesi rende difficile costruire un sistema di organi in vitro. Altri sistemi ex vivo sono stati precedentemente stabiliti per studiare organogenesi, o più specificamente morfogenesi, e hanno avuto molto successo per l'imaging dal vivo di organi fetali in agar 4, transwells 5, filtri 6 e altre matrici ponteggio 7,8. Il vantaggio del sistema di coltura goccia è che permette lo studio della morfogenesi, fornendo la capacità di utilizzare meno reattivi, che sono oFten costoso, ma dando anche la tensione superficiale organo, che è importante per la crescita e di segnalazione capacità 9.
Nel topo, del testicolo morfogenesi iniziale si svolge tra embrionale (E) mette in scena E11.5 e E13.5; queste fasi comprendono la finestra temporale ottimale per l'esame i fattori che influenzano la differenziazione sesso-specifici. Tra i processi critici che si verificano durante la formazione del testicolo sono la generazione dell'architettura cavo testicolo e la formazione di una rete vascolare specifico testicolo. Utilizzando questo ex vivo tutto l'organo sistema di coltura gocciolina, si è in grado di alterare vascolarizzazione maschio-specifica e inibire testicolo morfogenesi attraverso l'uso di un inibitore piccola molecola che blocca l'attività dei recettori per il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF); VEGF-mediata rimodellamento vascolare è fondamentale per lo sviluppo del testicolo 10-12. Questa tecnica può essere applicata con successo ad altri organi e può bersagliare tempo specificofinestre di sviluppo. Whole-mount di imaging organo permette la visualizzazione di strutture vitali così come i cambiamenti strutturali e cellulari conseguenti alla somministrazione di vari inibitori. È importante sottolineare che questo sistema è vantaggioso in quanto il ricercatore può ignorare i potenziali effetti confondenti di somministrazione del farmaco materna o interruzione sistemico durante vivo strategie genetiche in mirate. Quindi, tutto questo organo ex vivo sistema di coltura delle gocce può migliorare significativamente la capacità di comprendere le interazioni e le segnalazioni che si verificano in particolare all'interno di particolari organi durante lo sviluppo fetale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo studio dimostra un intero metodo gocciolina organo ex vivo che ha molte potenziali applicazioni per lo studio dello sviluppo del feto. Questa tecnica può essere utilizzata per più organi, e permette al ricercatore di affrontare questioni biologiche che sono difficili da valutare in vivo utilizzando approcci a causa dell'inaccessibilità di embrioni e potenziale letalità embrionale. Questo metodo di coltura ha ulteriori vantaggi rispetto ad altri approcci in vitro come linee cellu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O’Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.
Materials
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible | Sally Hansen | N/A | |
| 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes & Detached Flat Caps | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2170 | |
| Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2176 | |
| 10 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1096FR | |
| 20 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1121 | |
| 200 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1122 | |
| 1000 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1126 | |
| 1 ml syringe with 27gauge needles | BD PrecisionGlide | 309623 | |
| 10 ml syringe | BD | 305559 | |
| 0.2 μM PES syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35mm Easy Grip Style Cell Culture Dish | Falcon/Corning | 353801 | |
| Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
| New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Biosafety Cabinet | Nuare | NU-425-400 | |
| Mini-centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel | Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 stereomicroscope | Nikon | SMZ445 | |
| MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software | Alpha Innotech Corporation | Discontinued | |
| Absolute 200 proof Ethanol | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Ambion Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| XY PCR Primer | IDT | N/A | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-500 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
| 1% Ethidium bromide solution | Fisher | BP1302-10 | Toxic |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Set, 100 mM Solutions | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | Toxic |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Hydrogen Chloride (HCl) | Fisher | A144212 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation | Bioexpress | 0332-100g | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100-nm filtered | Fisher | 03-600-511 | Heat-inactivate before using |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Use at 1:100 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II – CAS 269390-69-4 – Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Rabbit Anti-Sox9 Antibody | Millipore | AB5535 | Use at dilution: 1:4,000 |
| Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody | BD Pharmingen | 553370 | Use at dilution: 1:250 |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signaling | 9661S | Use at dilution: 1:250 |
| Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Use at dilution: 1:500 |
| Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen (Molecular Probes) | H1399 | Use at 2ug/ml |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A31572 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21206 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21208 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Life Technologies | A31573 | Use at dilution: 1:500 |
References
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