Verwendung<em> Ex Vivo</em> Upright Droplet Kulturen von Whole Fetal Orgeln zu Entwicklungsprozessen während der Maus Organogenese Studieren
Summary
The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.
Abstract
Untersuchung der Organogenese in utero ist eine technisch anspruchsvolle Prozess in Plazentatiere aufgrund der Unzugänglichkeit der Reagenzien an Embryonen, die in der Gebärmutter entwickeln. Ein neu entwickeltes ex vivo aufrecht Tröpfchenkulturverfahren bietet eine attraktive Alternative zum Studium in utero durchgeführt. Die ex vivo Tröpfchen Kultur bietet die Möglichkeit, zu prüfen, und zelluläre Wechselwirkungen und diverse Signalwege durch Verwendung verschiedener Blockierungs- und aktivierende Verbindungen zu manipulieren; Zusätzlich können die Wirkungen der verschiedenen pharmakologischen Reagenzien auf die Entwicklung von spezifischen Organen ohne unerwünschte Nebenwirkungen der systemischen Arzneimittelabgabe in utero sucht werden. Im Vergleich zu anderen in vitro-Systemen, die Tropfenkultur ermöglicht nicht nur die Fähigkeit, dreidimensionale Morphogenese und Zell-Zell-Interaktionen zu studieren, die in Säugerzelllinien wiedergegeben werden kann, sondern auch deutlich weniger reagents als andere ex vivo und in vitro-Protokolle. Dieses Papier zeigt richtige Maus fetalen Organ Dissektion und aufrecht Tröpfchenkultur-Techniken, gefolgt von ganzen Organs Immunfluoreszenz, um die Wirksamkeit des Verfahrens zu demonstrieren. Die ex vivo Tröpfchenkulturverfahren ermöglicht die Bildung von Organarchitektur vergleichbar zu dem, was in vivo beobachtet und kann genutzt werden, um auf andere Weise schwierig zu Studienprozesse durch embryonale Letalität in vivo-Modellen untersucht werden. Als Modell-Anwendungssystem wird ein niedermolekularer Inhibitor verwendet werden, um die Rolle der Vaskularisation in testikulären Morphogenese sondieren. Diese ex vivo Tröpfchenkulturverfahren ist erweiterbar auf andere fetale Organsystemen wie Lungen und möglicherweise andere, obwohl jedes Organ müssen ausgiebig untersucht werden, um alle organspezifische Modifikationen des Protokolls zu bestimmen. Diese Organkultursystem bietet Flexibilität bei Experimenten mit fetalen Organen und führt obtained mit dieser Technik hilft Forschern Einblicke in die fetale Entwicklung.
Introduction
Organregeneration in vivo beim Menschen ist sehr begrenzt; daher, Tissue Engineering, die Entwicklung von Geweben und Organen aus einzelnen Zellen durch eine Vielzahl gespendet, wird immer eine attraktive potenzielle Therapie für Organersatz. Doch für diese therapeutische Strategie, um erfolgreich zu sein, Faktoren und zellulären Interaktionen in Morphogenese der Orgel beteiligt sind, müssen gründlich untersucht werden, und gut verstanden. Aufgrund der Unfähigkeit zur Entwicklung spezifischer Organe mit herkömmlichen Ansätzen zu untersuchen, haben die Forscher alternative gesamten Embryo oder ganze Organkulturen gedreht. Kalaskar et al. 1 haben, in utero Entwicklung gezeigt, dass ex vivo ganze Embryokultur liefert vergleichbare Ergebnisse (in 58% der kultivierten Embryonen), was darauf hindeutet, dass die Ex-vivo-Kulturverfahren sind eine praktikable Alternative zur Organstudien.
Eine individualisierte Organkultursystem, wie dieses ex vivo droplet Kultursystem ermöglicht eine ganze Organ Analyse unabhängig von systemischen Wirkungen, während eine Betätigung eines spezifischen Signalweg oder zellulären Wechselwirkungen durch Zugabe pharmakologische Reagenzien oder Antikörpern. Traditionell wurde die Untersuchung der fetalen Organentwicklung, transgene und Knockout-Maus Technologien beschränkt, die neben pharmakologische Reagenzien maternal geliefert. Allerdings gibt es technische Probleme im Zusammenhang mit diesen Techniken und Behandlungen in vivo; esten betrifft kreisen um die Effekte der Beeinflussung verschiedener Organe gleichzeitig, was oft in der embryonalen Letalität. Eine weitere Sorge der Studien manipulieren fetale Entwicklung pharmakologisch ist der mütterliche Einfluss von Drogen auf die embryonale Entwicklung in utero (zB mütterlichen Stoffwechsel des Medikaments, bevor sie den Embryo erreicht), und wenn eine solche Reagenzien können durch die plazentagängig ist.
Die ganze Organkultur-Technik beschrieben,Hier wurde aus einem Protokoll zuerst durch Maatouk et al. 2, bei dem ganze fetalen Gonaden in ex vivo aufrecht Tröpfchenkulturen inkubiert angepasst. Ein wesentlicher Vorteil des Kultivierens fetalen Gonaden ist, dass niedermolekulare Inhibitoren können leicht Zugriff auf das ganze Organ durch einfache Diffusion. . DeFalco et al haben gezeigt, dass die Nutzung dieser ex vivo Tröpfchenkulturverfahren in Verbindung mit niedermolekularen Inhibitoren können verwendet werden, um zu studieren Signalprozessen und Interaktionen während Gonadenreifung 3 auftretende werden; Diese Verfahren würden aufgrund technischer Herausforderungen schwierig, in vivo zu untersuchen (zB Durchgang von Medikamenten durch die Plazenta oder Letalität, die mehrere Organe mit genetischen oder pharmakologischen Ansätzen).
Die Tropfenkultur ist nicht nur eine Verbesserung in bestimmten Aspekten auf die in utero Experimente, aber es ist auch eine Verbesserung gegenüber in vitro und ex vivo Systemen. Die Verwendung von Zelllinien zur Morphogenese zu studieren, ist äußerst schwierig, da sie nicht über die verschiedenen Zelltypen, nicht über eine kritische extrazellulären Matrix (ECM) Komponenten, die die Bildung von Organarchitektur zu ermöglichen, und kann Artefakte in Signalkaskaden aufweisen. Obwohl Tissue Engineering hat signifikante Verbesserungen bei der Schaffung von Gerüsten Simulation ECM gemacht, der Mangel an Wissen in Bezug auf die Signale von jedem Zelltyp während der Organogenese erforderlich macht es schwierig, ein Organsystem in vitro zu bauen. Andere ex vivo-Systeme wurden bereits eingerichtet worden, um die Organogenese zu studieren, oder genauer gesagt die Morphogenese und sehr erfolgreich für die Bildgebung von fötalen Organen in Agar 4 gewesen, Transwells 5, Filter 6 und anderen Gerüst Matrizen 7,8. Der Vorteil des Tröpfchens Kultursystems ist, dass es die Untersuchung der Morphogenese durch Bereitstellen der Fähigkeit, weniger Reagenzien, die o sind, zurückgegriffenften teuer, sondern auch was die Orgel Oberflächenspannung, die wichtig für das Wachstum und Signalisierungsfunktionen 9 ist.
Bei der Maus findet Anfangs Hoden Morphogenese zwischen embryonalen (E) inszeniert E11.5 und E13.5; diese Stufen umfassen die optimale Zeitfenster für die Prüfung Faktoren, die geschlechtsspezifische Differenzierung beeinflussen. Unter den kritischen Prozessen, die während testis Bildung auftreten, sind die Erzeugung von Testis Kabel Architektur und die Bildung einer Hoden-spezifische vaskuläre Netzwerk. Verwendung dieses ex vivo ganze Organ Tröpfchenkultursystem ist in der Lage, eine männlich-spezifische Vaskularisierung verändern und hemmen testis Morphogenese durch die Verwendung eines niedermolekularen Inhibitor blockiert die Aktivität der Rezeptoren für vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF); VEGF-vermittelte vaskuläre Remodeling ist entscheidend für die Hodenentwicklung 10-12. Diese Technik kann erfolgreich auf andere Organe angewendet werden und kann bestimmten ZeitzielFenstern der Entwicklung. Ganzkörper-Halterung Organ Bildgebung ermöglicht die Visualisierung von lebenswichtigen Strukturen sowie strukturelle und zelluläre Veränderungen nach der Verabreichung verschiedener Inhibitoren resultieren. Wichtig ist, dass dieses System den Vorteil, dass der Forscher können potentielle verwirrende Wirkungen von Arzneimittelverabreichung mütterlichen oder systemischen Störungen beim in vivo Zielgen Strategien umgehen. Somit kann diese ganzen Organs ex vivo Tröpfchenkultursystem die Fähigkeit, die Wechselwirkung und die Signalisierung, die spezifisch in bestimmte Organe während der fetalen Entwicklung auftreten Verständnis deutlich zu verbessern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Studie zeigt eine ex vivo ganze Organ Tröpfchenmethode, die viele mögliche Anwendungen für die Untersuchung der fetalen Entwicklung hat. Diese Technik kann für mehrere Organe der Forscher verwendet werden und erlaubt es, biologischer Fragestellungen, die schwierig zu prüfen unter Verwendung von in vivo-Vorgehensweisen, werden wegen Unzugänglichkeit von Embryonen und Potential embryonaler Letalität adressieren. Diese Kultur-Methode hat zusätzliche Vorteile gegenüber anderen I…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O’Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.
Materials
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible | Sally Hansen | N/A | |
| 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes & Detached Flat Caps | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2170 | |
| Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2176 | |
| 10 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1096FR | |
| 20 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1121 | |
| 200 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1122 | |
| 1000 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1126 | |
| 1 ml syringe with 27gauge needles | BD PrecisionGlide | 309623 | |
| 10 ml syringe | BD | 305559 | |
| 0.2 μM PES syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35mm Easy Grip Style Cell Culture Dish | Falcon/Corning | 353801 | |
| Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
| New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Biosafety Cabinet | Nuare | NU-425-400 | |
| Mini-centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel | Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 stereomicroscope | Nikon | SMZ445 | |
| MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software | Alpha Innotech Corporation | Discontinued | |
| Absolute 200 proof Ethanol | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Ambion Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| XY PCR Primer | IDT | N/A | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-500 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
| 1% Ethidium bromide solution | Fisher | BP1302-10 | Toxic |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Set, 100 mM Solutions | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | Toxic |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Hydrogen Chloride (HCl) | Fisher | A144212 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation | Bioexpress | 0332-100g | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100-nm filtered | Fisher | 03-600-511 | Heat-inactivate before using |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Use at 1:100 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II – CAS 269390-69-4 – Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Rabbit Anti-Sox9 Antibody | Millipore | AB5535 | Use at dilution: 1:4,000 |
| Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody | BD Pharmingen | 553370 | Use at dilution: 1:250 |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signaling | 9661S | Use at dilution: 1:250 |
| Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Use at dilution: 1:500 |
| Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen (Molecular Probes) | H1399 | Use at 2ug/ml |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A31572 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21206 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21208 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Life Technologies | A31573 | Use at dilution: 1:500 |
References
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803 (2014).
- Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).
- DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).
- Walton, K. D., Kolterud, A. Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development. J. Vis. Exp. (91), e51817 (2014).
- Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An ex vivo culture system to study thyroid development. J. Vis. Exp. (88), e51641 (2014).
- Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. (66), e3979 (2012).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
- Combes, A. N., et al. et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation. Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).
- Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).
- Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).
- Clapcote, S. J., Roder, J. C. Simplex PCR assay for sex determination in mice. BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).
- Nel-Themaat, L., et al. et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in. Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).
- Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination. Development. 122, 2813-2822 (1996).
- Morais da Silva, S., et al. et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds. 14, 62-68 (1996).
- Rockich, B. E., et al. Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).
- Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).
- Brennan, J., Capel, B. One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development. Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).
- Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. Male-specific cell migration into the developing gonad. Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).
- Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis using an organ culture technique. Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471, 504-507 (2011).
- Gohbara, A., et al. In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system. Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).
