Använda<em> Ex vivo</em> Upright Dropp Kulturer av hela organ hos fostren att studera utvecklingsprocesser under Mouse Organogenesis
Summary
The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.
Abstract
Undersöka organogenes i livmodern är en tekniskt utmanande process i moderkakan däggdjur på grund av otillgänglighet av reagens till embryon som utvecklas i livmodern. En nyutvecklad ex vivo upprätt droppodlingsmetod ger ett attraktivt alternativ till studier utförda i livmodern. Ex vivo droppkultur ger möjlighet att undersöka och manipulera cellulära interaktioner och olika signalvägar genom användning av olika blockering och aktiverande föreningar; dessutom kan effekterna av olika farmakologiska reagenser om utvecklingen av specifika organ studeras utan oönskade biverkningar av systemisk läkemedelsleverans i livmodern. Jämfört med andra in vitro-system, droppkulturen tillåter inte bara förmågan att studera tredimensionella morfogenes och cell-cell-interaktioner, som inte kan återges i däggdjurscellinjer, men också kräver betydligt mindre reagents än andra ex vivo och in vitro-protokoll. Detta dokument visar korrekt mus fosterorgan dissekering och upprätt droppodlingstekniker, följt av hela organ immunofluorescens att demonstrera effektiviteten av metoden. Ex vivo droppodlingsmetod medger bildning av organarkitektur jämförbar med vad som observeras in vivo och kan användas för att studera annars svår studie processer på grund av embryonal dödlighet i in vivo-modeller. Som en modell ansökningssystemet, kommer en liten molekyl hämmare användas för att sondera roll vaskularisering i testikel morfogenes. Detta ex vivo droppodlingsmetod kan utökas till andra fosterorgansystem, såsom lung- och potentiellt andra, även om varje organ måste vara omfattande studier för att fastställa eventuella organspecifika ändringar av protokollet. Denna organkultursystem ger flexibilitet i experiment med organ hos fostren och resultat obtained använder denna teknik kommer att hjälpa forskare att få inblick i fosterutvecklingen.
Introduction
Organregenerering in vivo hos människa är mycket begränsad; därför, vävnadsteknik, utveckling av vävnader och organ från enskilda celler som donerats av en värd, håller på att bli en attraktiv potentiell terapi för utbyte orgel. Men för denna behandlingsstrategi för att lyckas, faktorer och cellulära interaktioner som är involverade i morfogenes av orgeln måste undersökas grundligt och väl förstått. På grund av oförmågan att studera utvecklingen av särskilda organ med traditionella metoder har forskarna vänt sig till alternativa hela embryo eller hela organkulturer. 1 Kalaskar et al. Har visat att ex vivo hela embryokultur ger jämförbara resultat (i 58% av odlade embryon) i livmodern utveckling, vilket tyder på att ex vivo odlingsmetoder är ett realistiskt alternativ för organogenesen studier.
En individualiserad organodlingssystemet, som detta ex vivo droPlet odlingssystem, möjliggör helt organ analys oberoende av systemiska effekter, medan den tillåter manipulering av en viss signalväg eller cellulära interaktioner via tillsats av farmakologiska reagenser eller antikroppar. Traditionellt har studiet av fosterorganutveckling varit begränsad till transgena och knockout mus teknik, utöver farmakologiska reagenser levererade moderligt. Men det finns tekniska frågor som rör dessa tekniker och behandlingar in vivo; de flesta oro kretsar kring effekterna av att påverka olika organ samtidigt som ofta resulterar i embryonal dödlighet. Ett ytterligare bekymmer studier manipulera fosterutveckling farmakologiskt är moderns effekten av läkemedel på embryonal utveckling i livmodern (t.ex. moderns metabolism av läkemedlet innan det når embryot) och om sådana reagens kan passera placentabarriären.
Hela organkultur teknik som beskrivshär anpassades från ett protokoll som först beskrevs av et al. Maatouk 2, i vilken hela fetala gonader inkuberas i ex vivo upprätt droppkulturer. En betydande fördel att odla foster könskörtlar är att småmolekylära hämmare lätt kan få tillgång till hela organ genom enkel diffusion. . DeFalco m.fl. har visat att användning av denna ex vivo-droppodlingsmetoden i samband med småmolekylära inhibitorer kan användas för att studera signalprocesser och interaktioner som inträffar under gonad utveckling 3; dessa processer skulle vara svårt att undersöka in vivo på grund av tekniska problem (t.ex. passage av läkemedel genom moderkakan eller dödligheten påverka flera organ med genetiska eller farmakologiska metoder).
Droppkulturen är inte bara en förbättring av vissa aspekter över in utero experiment, men också att det är en förbättring jämfört med in vitro-och ex VIVO system. Användningen av cellinjer för att studera morfogenes är extremt svårt eftersom de saknar de olika celltyper, saknar kritiska extracellulära matrix (ECM) komponenter som möjliggör bildandet av organ arkitektur och kan uppvisa artefakter i signaleringskaskader. Även om tissue engineering har gjort betydande förbättringar för att skapa ställningar simulerar ECM, bristen på kunskap när det gäller vilka signaler som krävs av varje celltyp under organogenesen gör det svårt att bygga ett organsystem in vitro. Andra ex vivo system har tidigare fastställts att studera organogenesen, eller mer specifikt morphogenesis, och har varit mycket framgångsrika för levande avbildning av fetala organ i agar 4, transwell 5, filter 6, och andra ställnings matriser 7,8. Fördelen av droppen odlingssystemet är att det tillåter studiet av morfogenes genom att åstadkomma förmågan att utnyttja färre reagens, som är often dyrt, men också ge orgel ytspänning, vilket är viktigt för tillväxt och signalering kapacitet 9.
I musen, tar inledande testikel morfogenes rum mellan embryonala (E) steg E11.5 och E13.5; dessa steg utgör den optimala tid för att pröva faktorer som påverkar könsspecifik differentiering. Bland de kritiska processer som sker under testikel bildning är alstringen av testikel sladd arkitektur och bildandet av en testikel specifik vaskulära nätverket. Med användning av denna ex vivo helt organ droppkultursystem, är en möjlighet att påverka den manliga specifika vaskularisering och inhiberar testikel morfogenes genom användning av en liten molekyl inhibitor som blockerar aktiviteten hos receptorerna för vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF); VEGF-medierad kärlremodellering är avgörande för testikelutveckling 10-12. Denna teknik kan med framgång tillämpas på andra organ och kan rikta specifik tidfönster av utveckling. Hela montering organ imaging tillåter visualisering av vitala strukturer samt strukturella och cellförändringar till följd av administrering av olika hämmare. Viktigt är detta system fördelaktigt genom att forskaren kan kringgå eventuella störande effekter från moderns läkemedelsadministrering eller systemisk störning under in vivo riktade gen strategier. Således kan hela detta organ ex vivo droppkultursystem avsevärt förbättra förmågan att förstå samspelet och signalering som sker särskilt inom vissa organ under fosterutvecklingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denna studie visar en ex vivo hela organ droppmetod som har många potentiella tillämpningar för att studera fosterutveckling. Denna teknik kan användas för flera organ, och gör det möjligt för forskare att ta itu med biologiska frågor som är svåra att undersöka med hjälp av in vivo närmar grund av otillgänglighet av embryon och potentiell embryonal dödlighet. Denna odlingsmetod har ytterligare fördelar jämfört med andra in vitro metoder såsom däggdjurscellinjer: hela organ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O’Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.
Materials
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible | Sally Hansen | N/A | |
| 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes & Detached Flat Caps | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2170 | |
| Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2176 | |
| 10 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1096FR | |
| 20 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1121 | |
| 200 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1122 | |
| 1000 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1126 | |
| 1 ml syringe with 27gauge needles | BD PrecisionGlide | 309623 | |
| 10 ml syringe | BD | 305559 | |
| 0.2 μM PES syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35mm Easy Grip Style Cell Culture Dish | Falcon/Corning | 353801 | |
| Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
| New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Biosafety Cabinet | Nuare | NU-425-400 | |
| Mini-centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel | Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 stereomicroscope | Nikon | SMZ445 | |
| MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software | Alpha Innotech Corporation | Discontinued | |
| Absolute 200 proof Ethanol | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Ambion Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| XY PCR Primer | IDT | N/A | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-500 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
| 1% Ethidium bromide solution | Fisher | BP1302-10 | Toxic |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Set, 100 mM Solutions | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | Toxic |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Hydrogen Chloride (HCl) | Fisher | A144212 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation | Bioexpress | 0332-100g | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100-nm filtered | Fisher | 03-600-511 | Heat-inactivate before using |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Use at 1:100 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II – CAS 269390-69-4 – Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Rabbit Anti-Sox9 Antibody | Millipore | AB5535 | Use at dilution: 1:4,000 |
| Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody | BD Pharmingen | 553370 | Use at dilution: 1:250 |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signaling | 9661S | Use at dilution: 1:250 |
| Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Use at dilution: 1:500 |
| Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen (Molecular Probes) | H1399 | Use at 2ug/ml |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A31572 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21206 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21208 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Life Technologies | A31573 | Use at dilution: 1:500 |
References
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803 (2014).
- Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).
- DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).
- Walton, K. D., Kolterud, A. Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development. J. Vis. Exp. (91), e51817 (2014).
- Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An ex vivo culture system to study thyroid development. J. Vis. Exp. (88), e51641 (2014).
- Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. (66), e3979 (2012).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
- Combes, A. N., et al. et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation. Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).
- Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).
- Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).
- Clapcote, S. J., Roder, J. C. Simplex PCR assay for sex determination in mice. BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).
- Nel-Themaat, L., et al. et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in. Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).
- Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination. Development. 122, 2813-2822 (1996).
- Morais da Silva, S., et al. et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds. 14, 62-68 (1996).
- Rockich, B. E., et al. Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).
- Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).
- Brennan, J., Capel, B. One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development. Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).
- Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. Male-specific cell migration into the developing gonad. Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).
- Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis using an organ culture technique. Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471, 504-507 (2011).
- Gohbara, A., et al. In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system. Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).
