Kullanımı<em> Ex Vivo</em> Tüm Fetal Organları Dik Damlacık Kültürleri Fare Organogenesis sırasında Gelişim Süreçleri Eğitim için
Summary
The ex vivo upright droplet culture is an alternative to current in vitro and in vivo experimental techniques. This protocol is easy to perform and requires smaller amounts of reagent, while permitting the ability to manipulate and study fetal vascularization, morphogenesis, and organogenesis.
Abstract
Intrauterin organogenezi incelenmesi rahim içinde gelişmesi embriyolar nedeniyle reaktif erişilememesi plasenta memelilerde teknik olarak oldukça zor bir süreçtir. Yeni geliştirilen ex vivo dik damlacık kültür yöntemi rahimde yapılan çalışmalara cazip bir alternatif sunuyor. Ex vivo damlacık kültürü incelemek ve çeşitli engelleme ve aktive bileşiklerin kullanımı ile hücresel etkileşimleri ve çeşitli sinyal yolları işlemek için yeteneği sağlar; buna ek olarak, belirli bir organların gelişimi üzerindeki çeşitli farmakolojik reaktifler etkileri in utero sistemik ilaç verilmesi, istenmeyen yan etkiler olmadan incelenebilir. Vitro sistemler diğer karşılaştırıldığında, damlacık kültürü, memeli hücre çizgilerinde üretilemeyen, üç boyutlu morfogenez ve hücre-hücre etkileşimini incelemek için yeteneği, izin verir, ancak, aynı zamanda daha az r gerektirir sadeceex vivo ve in vitro diğerinden daha protokollerde eagents. Bu yazıda yöntemin etkinliğini göstermek için tüm organ immünofloresan ardından uygun fare fetal organı diseksiyonu ve dik damlacık kültürü teknikleri, göstermektedir. Ex vivo damlacık kültürü yöntemi benzer in vivo olarak gözlenen ve in vivo modellerde embriyon ölümlerine nedeniyle, aksi takdirde zor çalışma süreçleri incelemek için kullanılabilir ne organ mimarisi oluşumunu sağlar. Bir örnek uygulama sistemi olarak, bir küçük moleküllü inhibitör testiküler morfojenezinde damarlanma rolünü araştırmak için kullanılacaktır. Her organ yoğun olması protokole herhangi bir organ spesifik değişiklikler belirlemek için okudu gerekir, ancak bu ex vivo damlacık kültür yöntemi, akciğer ve potansiyel diğerleri gibi diğer fetal organ sistemlerinde, yükseltilebiliyor. Bu organ kültür sisteminde fetal organlar ile deney esneklik sağlar ve obtaine sonuçlarıd araştırmacılar fetal gelişim içgörüler elde etmenize yardımcı olacaktır, bu tekniği kullanarak.
Introduction
Insanlarda in vivo olarak organ yenilenmesi çok sınırlıdır; Bu nedenle, doku mühendisliği, doku ve bir ev sahibi tarafından bağışlanan bireysel hücrelerden organ gelişimi, organ değişimi için cazip bir potansiyel tedavi haline geliyor. Bu tedavi stratejisi başarılı olması için, ancak, faktörler ve organ morfolojilerinden katılan hücresel etkileşimleri iyice incelenmesi gerekir ve iyi anladım. Geleneksel yaklaşımlara belirli organların gelişimini incelemek için yetersizlik nedeniyle, araştırmacılar, alternatif bütün embriyo veya tüm organ kültürlerinde döndü. Kalaskar ve ark., 1 o ex vivo kültür yöntemleri organogenezisin çalışmaları için uygun bir alternatif düşündüren, utero geliştirme için (kültürlü embriyoların% 58'inde) o ex vivo tüm embriyogenez kültür karşılaştırılabilir sonuçlar verir göstermiştir.
Bir bireyselleştirilmiş organ kültürü sistemi gibi bu ex vivo drofarmakolojik reaktifler veya antikorların ilavesi ile, belirli bir sinyal yolu ya da hücresel etkileşimler manipülasyonu izin verirken plet kültür sistemi, sistemik etkileri tüm organ analizi bağımsız sağlar. Geleneksel olarak, fetal organ gelişimine çalışma maternal teslim farmakolojik reaktifler yanı sıra, transgenik fare ve boşaltma teknolojileri ile sınırlı olmuştur. Ancak, in vivo bu teknikleri ve tedavileri kapsayan teknik sorunlar vardır; En endişeleri genellikle embriyonik öldürücülüğü sonuçları eş zamanlı olarak çeşitli organları etkileyen etkileri etrafında döner. Fetal gelişimi manipüle çalışmaların ilave endişe farmakolojik tür reaktifler plasental bariyeri geçmek eğer (örneğin, ilacın anne metabolizma o embriyoyu ulaşmadan önce) ve intrauterin embriyonik gelişimi üzerindeki ilaçların anne etkisidir.
Tüm organ kültürü tekniği tarifBurada bütün fetal gonadlar ex vivo dik damlacık kültürleri inkübe edildiği ilk Maatouk ve ark., 2 tarafından tarif edilen protokol uyarlanmıştır. Fetal gonadlar kültürlenmesi önemli bir avantajı, küçük molekül inhibitörleri ile kolaylıkla difüzyon ile bütün bir organ erişebilir olmasıdır. . DeFalco ve arkadaşları, küçük-molekül inhibitörleri ile bağlantılı olarak, bu ex vivo damlacık kültür yöntemi kullanılarak süreçler ve gonad gelişimi sırasında meydana gelen 3 etkileşimleri sinyal incelemek için kullanılabilir olduğunu göstermiştir; bu işlemler nedeniyle teknik zorlukları in vivo incelenmesi zor olacağını (örneğin, plasenta ya da genetik ya da farmakolojik yaklaşımlar kullanarak birden fazla organı etkileyen ölümcül yoluyla ilaçların geçişi).
Damlacık kültürü sadece utero deneme belirli yönleri üzerinde bir gelişmedir, ama aynı zamanda in vitro ve ex vi üzerinde bir gelişmedirvo sistemleri de. Bunlar, çok çeşitli hücre tiplerini eksikliği, organ mimarisinin oluşmasına izin kritik hücre dışı matris (ECM) bileşenleri yoksundur ve sinyal basamaklarının gölgeleri göstermemesi için morfonogenezi çalışma hücre çizgilerinin kullanımı son derece zordur. Doku mühendisliği ECM taklit iskeleleri oluştururken önemli iyileştirmeler yapılmış olmasına rağmen, sinyaller organogenezis sırasında her hücre türüne göre gerekli olan ilgili bilgi eksikliği zorlu in vitro organ sistemini oluşturmak için yapar. Diğer ex vivo sistemler daha önce, filtreler 6 ve diğer iskele matrisleri 7,8 organogenezi incelemek için kurulan ya da daha spesifik olarak morfogenez ve agar 4 fetal organların canlı görüntüleme için çok başarılı olmuştur, 5 transwells oylandı. Damlacık kültür sisteminin avantajı, o kadar az reaktifleri, kullanma olanağı sağlayarak morfogenez çalışma olanak sağlamasıdırFTEN pahalı, ama aynı zamanda büyüme ve sinyal yetenekleri 9 için önemli olan, organ yüzey gerilimi vererek.
Fare, ilk testis morfogenezisi embriyonik (E) arasında yer alan E11.5 E13.5 ve aşamaları; Bu aşamalar cinsiyete özgü farklılaşma etkileyen faktörleri incelemek için en uygun zaman penceresini içermektedir. Testis oluşumu sırasında meydana gelen önemli işlemler arasında testis kord mimarisinin üretimi ve testis özgü damar ağı oluşumu bulunmaktadır. Bu ex vivo tüm organ damlacık kültür sistemi kullanmak, bir erkek spesifik vaskülarizasyon değiştirebilir ve küçük bir molekül inhibitörü kullanmak suretiyle testis morfogenetiğine inhibe edebilir engelleyen, vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) için reseptör etkinliği; VEGF-aracılı vasküler yeniden modellenme Testis gelişiminin 10-12 için kritik öneme sahiptir. Bu teknik, başarılı bir diğer organlara uygulanabilir ve belirli bir zaman hedefleyebilirgelişme pencereler. Tüm montaj organı görüntüleme hayati yapıların görselleştirme yanı sıra çeşitli inhibitörlerinin uygulanmasından kaynaklanan yapısal ve hücresel değişiklikler sağlar. Önemli olarak, bu sistem, bir araştırmacı, in vivo hedefli gen stratejileri maternal ilaç uygulama ya da sistemik olarak bozulması potansiyel karıştırıcı etkilerini atlayabilir avantajlıdır. Böylece, bütün bu organın ex vivo damlacık kültürü sistemi önemli ölçüde fetal gelişim sırasında belirli organları içinde özellikle meydana gelen etkileşimleri ve sinyalizasyon anlama yeteneğini geliştirmek olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma fetal gelişimi eğitimi için birçok potansiyel uygulamalar vardır bir ex vivo tüm organ damlacık yöntemi gösterir. Bu teknik sayesinde embriyo ve potansiyel embriyonik letalitesinin erişilememesi biyolojik in vivo kullanarak incelemek için zor sorulara yaklaşımları ele araştırmacı birden organlar için kullanılan ve izin verir edilebilir. Bu kültür yöntemi memeli hücre çizgileri gibi yaklaşımlar nitro Diğer üzerinde ek avantajları vardır: bütün organ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors were supported by: a CancerFree KIDS Research Grant, a March of Dimes Basil O’Connor Starter Scholar Award (#5-FY14-32), a Cincinnati Children’s Hospital Medical Center (CCHMC) Trustee Grant Award; a CCHMC Research Innovation and Pilot Funding Award; and CCHMC developmental funds. Authors also acknowledge the Capel laboratory for the initial optimization of this technique.
Materials
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Cover Glasses: Squares (22 mm x 22 mm, No. 1.5) | Fisherbrand | 12-541B | |
| Sally Hansen Xtreme Wear Nail Polish, Invisible | Sally Hansen | N/A | |
| 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes & Detached Flat Caps | GeneMate | T3218-1 | |
| Pipetman L P1000L, P200L, P20L, P10L, P2L | Gilson | FA10006M, FA10005M, FA10003M, FA10002M, FA10001M | |
| Dumont #5 Forceps | FST | 91150-20 | |
| Fine Scissors | FST | 91460-11 | |
| Posi-Click 1.7 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2170 | |
| Posi-Click 0.6 ml microcentrifuge tubes | Denville | C2176 | |
| 10 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1096FR | |
| 20 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1121 | |
| 200 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1122 | |
| 1000 μl SHARP Precision Barrier Tips | Denville | P1126 | |
| 1 ml syringe with 27gauge needles | BD PrecisionGlide | 309623 | |
| 10 ml syringe | BD | 305559 | |
| 0.2 μM PES syringe filter | VWR | 28145-501 | |
| Grade 3 Qualitative Filter Paper Standard Grade, circle, 185 mm | Whatman | 1003-185 | |
| Primaria 35mm Easy Grip Style Cell Culture Dish | Falcon/Corning | 353801 | |
| Petri Dishes, Sterile (100 mm x 15 mm) | VWR | 25384-088 | |
| New Brunswick Galaxy 14 S CO2 Incubator | Eppendorf | CO14S-120-0000 | |
| Biosafety Cabinet | Nuare | NU-425-400 | |
| Mini-centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| BioExpress GyroMixer Variable XL | GeneMate | R-3200-1XL | |
| Mastercycler Pro Thermal Cycler with control panel | Eppendorf | 950040015 | |
| SMZ445 stereomicroscope | Nikon | SMZ445 | |
| MultiImage Light Cabinet with AlphaEase Software | Alpha Innotech Corporation | Discontinued | |
| Absolute 200 proof Ethanol | Fisher | BP2818-500 | |
| Triton X-100 | Fisher | BP151-100 | |
| Sodium Phosphate (Dibasic MW 142) Na2HPO4 | Fisher | S374-1 | |
| Potassium Phosphate (Monobasic MW 136) KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379-1KG | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S671-3 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911-1KG | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma | M2393-100g | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma | C5670-100g | |
| Ambion Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9938 | |
| XY PCR Primer | IDT | N/A | |
| Glacial Acetic Acid | Fisher | A38-500 | |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher | BP2482-1 | |
| 1% Ethidium bromide solution | Fisher | BP1302-10 | Toxic |
| Agarose | GeneMate | E-3120-500 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 367176-2.5KG | |
| Trizma Base | Sigma | T1503-1KG | |
| dNTP Set, 100 mM Solutions | Thermo Scientific | R0182 | |
| DNA Choice Taq polymerase with 10x Buffer | Denville | CB-4050-3 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | Toxic |
| FluorMount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Hydrogen Chloride (HCl) | Fisher | A144212 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), powder, Fraction V, Heat shock isolation | Bioexpress | 0332-100g | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), triple 100-nm filtered | Fisher | 03-600-511 | Heat-inactivate before using |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Use at 1:100 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO), Hybri-max, sterile-filtered | Sigma | D2650 | |
| VEGFR Tyrosine Kinase Inhibitor II – CAS 269390-69-4 – Calbiochem | EMD Millipore | 676481 | |
| Rabbit Anti-Sox9 Antibody | Millipore | AB5535 | Use at dilution: 1:4,000 |
| Rat Anti-Mouse PECAM1 (CD31) Antibody | BD Pharmingen | 553370 | Use at dilution: 1:250 |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Cell Signaling | 9661S | Use at dilution: 1:250 |
| Rat E-cadherin / CDH1 Antibody (ECCD-2) | Life Technologies | 13-1900 | Use at dilution: 1:500 |
| Hoechst 3342, trihydrochloride, trihydrate | Invitrogen (Molecular Probes) | H1399 | Use at 2ug/ml |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-165-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Alexa Fluor 647 AffiniPure Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch | 712-605-153 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate | Life Technologies | A31572 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21206 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Life Technologies | A21208 | Use at dilution: 1:500 |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate | Life Technologies | A31573 | Use at dilution: 1:500 |
References
- Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. J. Vis. Exp. (85), e50803 (2014).
- Maatouk, D. M., et al. Stabilization of beta-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal. Hum. Mol. Genet. 17, 2949-2955 (2008).
- DeFalco, T., Bhattacharya, I., Williams, A. V., Sams, D. M., Capel, B. Yolk-sac-derived macrophages regulate fetal testis vascularization and morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, E2384-E2393 (2014).
- Coveney, D., Cool, J., Oliver, T., Capel, B. Four-dimensional analysis of vascularization during primary development of an organ, the gonad. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7212-7217 (2008).
- Walton, K. D., Kolterud, A. Mouse fetal whole intestine culture system for ex vivo manipulation of signaling pathways and three-dimensional live imaging of villus development. J. Vis. Exp. (91), e51817 (2014).
- Delmarcelle, A. S., Villacorte, M., Hick, A. C., Pierreux, C. E. An ex vivo culture system to study thyroid development. J. Vis. Exp. (88), e51641 (2014).
- Costantini, F., Watanabe, T., Lu, B., Chi, X., Srinivas, S. Dissection of embryonic mouse kidney, culture in vitro, and imaging of the developing organ. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, (2011).
- Petzold, K. M., Spagnoli, F. M. A system for ex vivo culturing of embryonic pancreas. J. Vis. Exp. (66), e3979 (2012).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).
- Combes, A. N., et al. et al.Endothelial cell migration directs testis cord formation. Dev. Biol. 326, 112-120 (2009).
- Bott, R. C., McFee, R. M., Clopton, D. T., Toombs, C., Cupp, A. S. Vascular endothelial growth factor and kinase domain region receptor are involved in both seminiferous cord formation and vascular development during testis morphogenesis in the rat. Biol. Reprod. 75, 56-67 (2006).
- Cool, J., DeFalco, T. J., Capel, B. Vascular-mesenchymal cross-talk through Vegf and Pdgf drives organ patterning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 167-172 (2011).
- Clapcote, S. J., Roder, J. C. Simplex PCR assay for sex determination in mice. BioTechniques. 38, 702, 704-706 (2005).
- Nel-Themaat, L., et al. et al.Morphometric Analysis of Testis Cord Formation in. Dev. Dyn. 238, 1100-1110 (2009).
- Kent, J., Wheatley, S. C., Andrews, J. E., Sinclair, A. H., Koopman, P. A male-specific role for SOX9 in vertebrate sex determination. Development. 122, 2813-2822 (1996).
- Morais da Silva, S., et al. et al.Sox9 expression during gonadal development implies a conserved role for the gene in testis differentiation in mammals and birds. 14, 62-68 (1996).
- Rockich, B. E., et al. Sox9 plays multiple roles in the lung epithelium during branching morphogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, E4456-E4464 (2013).
- Si-Tayeb, K., Lemaigre, F. P., Duncan, S. A. Organogenesis and development of the liver. Dev. Cell. 18, 175-189 (2010).
- Brennan, J., Capel, B. One tissue, two fates: Molecular genetic events that underlie testis versus ovary development. Nat. Rev. Genet. 5, 509-521 (2004).
- Martineau, J., Nordqvist, K., Tilmann, C., Lovell-Badge, R., Capel, B. Male-specific cell migration into the developing gonad. Curr. Biol. 7, 958-968 (1997).
- Yokonishi, T., Sato, T., Katagiri, K., Ogawa, T. In vitro spermatogenesis using an organ culture technique. Methods Mol. Biol. 927, 479-488 (2013).
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471, 504-507 (2011).
- Gohbara, A., et al. In vitro murine spermatogenesis in an organ culture system. Biol. Reprod. 83, 261-267 (2010).
