Introduction
في عام 2006، وقد وصفت نهجا جديدا لإعادة برمجة الخلايا الجسدية إلى دولة المحفزة. بعد الغربلة من مجموعة من إعادة برمجة المحتملة العوامل يمكن تحويلها الليفية الفئران بنجاح إلى ما يسمى يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (آي بي إس) من خلال تنبيغ فيروسات وoverexpression من أربعة عوامل النسخ (Oct4، Sox2، Klf4، ج. Myc على) 1. بعد ذلك تم إعادة إنتاج هذه التقنية بشكل فعال باستخدام الخلايا الجسدية من أنواع الثدييات المختلفة بما في ذلك البشر 2، 3 القرود والفئران 4، 5 الكلاب والأغنام والخنازير 6 7. بالإضافة إلى ذلك، تعديل بروتوكولات حذف أو استبدال عامل النسخ يحتمل أنكجنيك ج- MYC تم نشر 8، 9.
بغض النظر عن إعادة برمجة الأولية الاقتراب من تعدد القدرات الحقيقية للمستعمرات المتزايد لابد من تأكيد، وهي مهمة شاقة وتستغرق وقتا طويلا. والعيب الرئيسيغالبية هذه التحليلات هو أنها لا يمكن أن يؤديها على الخلايا الحية. عوامل تعدد القدرات الراسخة مثل OCT4، SOX2، NANOG أو REX1 تمثل عوامل النسخ الموجود في نواة والكشف عنها يتطلب تثبيت الخلايا قبل المناعية أو تحلل الخلايا لتحليل RT-PCR 10 - 12 وبعد ذلك، يتم فقدان هذه الخلايا للمستقبل التجارب التي تتطلب تكرار الثقافات من كل مستعمرة.
وهكذا، وهي تقنية لتحليل تعدد القدرات على الخلايا الحية مرغوب فيه للغاية. يمكن في الواقع عدة طرق يتم تنفيذها مباشرة على الخلايا الحية باستخدام الأجسام المضادة الموجهة ضد المستضدات التي تعتمد على الأغشية (على سبيل المثال. TRA-1-60، SSEA4)، وأفاد 12 الفلورسنت الأصباغ للكشف عن الفوسفاتيز 13 أو صغيرة جزيئات القلوية التي تسمية تحديدا الجذعية الجنينية (ES) وخلايا الجذع 14. ومع ذلك، قد الأجسام المضادة مع ذلك تؤثر سلبا على الخلايا وكل المنهجياتيقتصر التطوير التنظيمي إلى تعدد القدرات علامة واحدة. وأخيرا، منارات الجزيئية فلوري، [أليغنوكليوتيد ثنائي العقاقير مع الهياكل دبوس الشعر، والتي تسمح تلطيخ حية من الخلايا، وقد وصفت 15. على الرغم من أن هذا النهج يمكن تطبيقها على العديد من الجينات، والأسلوب يتطلب nucleofection من تعليق خلية واحدة، وهو ما لا ينطبق على المتنامية الجذع المستعمرات.
وقبل عامين وقد وصفت النانوية الجينات المحددة لتحليل التعبير survivin في SKBR3 خلايا سرطان الثدي البشرية 16. تصف هذه المخطوطة نهجا مبتكرا جديدا للكشف عن علامات تعدد القدرات في ES الحية وخلايا الجذع من خلال استخدام تقارن جسيمات متناهية الصغر من الذهب. تتكون هذه الجسيمات النانوية من الجسيمات الذهب المركزي مع التقاط حبلا إلى جانب تحمل تسلسل الحمض النووي الريبي مكملة وحبلا مراسل CY3 المسمى. تطفأ إشارة الفلورسنت من حبلا مراسل من الجسيمات الذهب المركزي. بالإضافة إلى ذلك، مناسباالنانوية تخدم الضوابط سلبية وإيجابية، على التوالي (الشكل 1). لتطبيق تضاف النانوية ببساطة إلى مستنبت (الشكل 2) وتدخل الخلايا عن طريق الإلتقام (الشكل 3). إذا تم أعرب RNA الهدف هو إزاحة حبلا مراسل التي تنبعث ثم إشارة الفلورسنت. لا يتطلب هذا الأسلوب التلاعب في الخلية المستهدفة والتعبير عن الجينات المستهدفة يمكن رصد بصريا تحت المجهر مضان مباشرة في الخلايا الحية. وعلاوة على ذلك، فإن التكنولوجيا يمكن تطبيقها على أي جين الهدف المنشود عبر الأنواع في حالة خلايا الجذع، وبالتالي قد تكون استخدمت في العديد من المجالات البحثية المختلفة. وأخيرا، يحلل تدفق cytometric تسمح بتحديد وإثراء خلايا إيجابية CY3.
Protocol
1. إعداد وسائل الإعلام، والكواشف خلية شروط الثقافة
- HEK الإنسان 293 خلايا الكلى الجنينية
- ثقافة HEK 293 الخلايا (CRL-1573، ATCC) في DMEM / هام في F-12 متوسطة تستكمل مع 5٪ FCS، L-الجلوتامين (2 ملم)، والبنسلين (100 U / مل) / الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل).
- لمرور الخلايا، وغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني، إضافة 0.05٪ التربسين / EDTA واحتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. نقل الخلايا في أنبوب 15 مل، أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1200 دورة في الدقيقة (300 × ز) ونقل ما يقرب من 5X10 5 خلايا في قارورة ثقافة T25 جديدة.
- الليفية الجنينية في الفئران (MEFS)
- إضافة 1 مل من محلول الجيلاتين 0.1٪ إلى الفردية 6-الآبار واحتضان عند درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 ساعة. السائل نضح وتخزينها في RT حتى الاستخدام.
- ثقافة MEFS في DMEM تستكمل مع 10٪ FCS، L-الجلوتامين (2 ملم)، L-الجلوكوز (4.5 غرام / لتر)، البيروفات الصوديوم (1 ملم)، والبنسلين (100 U /مل) / الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل) على 6 لوحات جيدا المغلفة الجيلاتين.
- توزيع MEFS إلى 6 لوحات جيدا وتركها لتنمو حتى التقاء. إضافة ميتوميسين (5 ميكروغرام / مل) لمدة 2.5 ساعة للقبض على الخلايا. نضح المتوسطة، وغسل الخلايا مرتين مع كامل المتوسطة MEF وإضافة 3 مل المتوسطة MEF إلى كل 6 جيدا. هذه الخلايا بمثابة طبقة المغذية للخلايا الفئران والخنازير الجذع.
- ثقافة ES الفئران وخلايا الجذع
- لإعداد الماوس ES مستنبت، تكملة DMEM المتوسطة مع 15٪ FCS، L-الجلوتامين (2 ملم)، L-الجلوكوز (4.5 غرام / لتر)، MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية (1X)، β المركابتويثانول (0.1 ملم) وعامل مثبط اللوكيميا (1،000 U / مل).
- شطف 6 آبار مع MEFS اعتقل نمو مرة واحدة مع المصل خالية DMEM، إضافة 2 مل الماوس ES المتوسطة وخلايا الجذع الفئران (20٪ من خلايا طبق متموجة). كل الخلايا غسل يوم مرة واحدة مع المصل خالية DMEM وإضافة 2 مل الماوس جديدة ES المتوسطة.
- لمرور الخلايا، ويغسل كل مرة بشكل جيد مع المصل خالية DMEM، إضافة 00.25٪ التربسين / EDTA واحتضان لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل، أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1200 دورة في الدقيقة (300 × ز)، وخلايا resuspend في 500 ميكرولتر الماوس ES المتوسطة وإضافة 100 ميكرولتر من تعليق إلى 2 مل الماوس ES المتوسطة في طازجة 6-جيدا مع MEF المغذية طبقة.
- ثقافة خنزير IPS الخلايا
- لإعداد خنزير الجذع المتوسطة، تكملة DMEM / هام في F-12 المتوسطة مع 20٪ مصل خروج المغلوب، L-الجلوتامين (2 ملم)، MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية (1X)، β المركابتويثانول (0.1 ملم)، والبنسلين (100 U / مل) / الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل). مرشح من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة 2-3 أسابيع. عند الاستخدام الأول، إضافة bFGF (10 نانوغرام / مل تركيز النهائي).
- شطف 6 آبار مع MEFS اعتقل مرة واحدة مع نمو خلايا الجذع المصل خالية DMEM / هام في F-12 وإضافة 1.5 مل خنزير الجذع المتوسطة والخنزير (10٪ من خلايا طبق متموجة). كل الخلايا غسل يوم مرة واحدة مع المصل خالية DMEM / هام ل-F 12 وإضافة 1.5 مل الخنزير الطازج الجذع المتوسطة.
- لإعداد تفارق العازلة إضافة 2.5٪ التربسين، كولاجيناز الرابع (10 ملغ / مل)، مصل خروج المغلوب (20٪) وCaCl 2 (1 ملم) إلى الكالسيوم 2+ خالية PBS. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني واحتضان مع تفارق العازلة لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل، أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1200 دورة في الدقيقة (300 × ز).
- و resuspend خلايا الجذع الخنازير في 500 ميكرولتر الطازجة خنزير الجذع المتوسطة وإضافة 50 ميكرولتر من تعليق إلى 1.5 مل خنزير الجذع المتوسطة في طازجة 6-جيدا مع MEF المغذية طبقة. كل الخلايا غسل يوم مرة واحدة مع المصل خالية DMEM / F-12 وإضافة 1.5 مل هام في الخنزير الطازج الجذع المتوسطة.
- ثقافة خالية من التغذية للخلايا الجذع الإنسان
- ذوبان الجليد القارورة الأصلية التي تحتوي على إعداد الغشاء القاعدي في 4 درجات مئوية، وتمييع مع الثلج الباردة المصل خالية DMEM / هام في F-12-8 ملغ / مل، قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
- ذوبان الجليد قسامة من القاعدةمنة إعداد الغشاء عند 4 درجات مئوية، وتمييع مع المصل خالية DMEM / F12 المثلج لحم الخنزير (90 ميكروغرام / مل). الماصة 1 مل من هذا المحلول في أطباق الثقافة 3 سم ودوامة بلطف لضمان أن يتم تغطية السطح كله. ختم الأطباق مع parafilm وتخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى واحد. قبل استخدام لزراعة الخلايا احتضان الأطباق لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C أو 3 ساعة على RT للسماح للبلمرة إعداد الغشاء القاعدي.
- نضح المتوسطة من الأطباق المغلفة مع إعداد الغشاء القاعدي ويغسل مرتين مع المصل خالية DMEM / هام في F-12. إضافة 1.5 مل E8 المتوسطة إلى الطبق الثقافة وخلايا الجذع الإنسان (10٪ من خلايا طبق متموجة). كل الخلايا غسل يوم مرة واحدة مع المصل خالية DMEM / هام في F-12 وإضافة 1.5 مل المتوسطة E8 الطازجة.
- لمرور الخلايا، وشطف الأطباق مرتين مع برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل PBS / 0.5 ملي EDTA. احتضان الأطباق لمدة 5 دقائق على RT. مراقبة الخلايا تحت المجهر. ملاحظة: عندما تبدأ المستعمرات لجمع وAPPEع أن يكون ثقوب تكون جاهزة للنقل.
- نضح السائل، إضافة 1.5 مل E8 المتوسطة وفصل الخلايا عن طريق pipetting بلطف صعودا وهبوطا. نقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل، أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1200 دورة في الدقيقة (300 × ز)، resuspend في 500 ميكرولتر E8 المتوسطة وإضافة 50 ميكرولتر من تعليق إلى 1.5 مل E8 المتوسطة في طبق ثقافة جديدة المغلفة مع إعداد الغشاء القاعدي .
2. تصميم الهدف متواليات عبر الأنواع حدود
- حدد متواليات [كدنا الخنازير من الجينات المستهدفة (GAPDH، NANOG، GDF3) البشرية المرجعية، والفئران، وإجراء تحليل المحاذاة متعددة تسلسل كلوستال.
ملاحظة: هذا إشارة إلى متواليات مثلي بين الأنواع.- استخدام الإعدادات التالية لمحاذاة متعددة: عقوبة الفجوة (الثابتة) 10، عقوبة الفجوة (متفاوتة) 5، والانتقال الترجيح 0، مجموعة فجوة عقوبة الفصل 8، الهوية٪ لتأخير 40، الحد الأقصى لعدد مرات التكرار لأداء 3.
- إرسال تسلسل الهدف المنشود إلى الصانع (انظر جدول المواد) لتصميم التحقيق والتصنيع.
ملاحظة: إن الشركة المصنعة ثم تأكيد التوافق التسلسل المطلوب مع التكنولوجيا. إذا تسلسل المطلوب غير متوافق، فإن الصانع يقترح تسلسل بديلة.- تأكد من أن المناطق المتجانسة والتي يمكن استخدامها حسب تسلسل المحتملة القبض حبلا لها طول 27 سنة مضت.
ملاحظة: من المستحسن أن تأمر العديد من الجسيمات النانوية مع خيوط التقاط مختلفة لجين الهدف المحدد فقط كما ان التجربة الخلوية حقيقية تعطي دليلا واضحا على وظيفة تسلسل الفردية. لذلك، تم تقييم اثنين من سلاسل مختلفة لGAPDH وGDF3 في حين تم اختبار ثلاثة النانوية مختلفة لتقييم NANOG التعبير. وقد نشرت مواقعها وتسلسل الدقيقة 17 أماكن أخرى. الشركة المصنعة تصنع تجاريا في nanopمقالات مع تسلسل المطلوبة وتوفر لهم في شكل مجفف بالتجميد.
- تأكد من أن المناطق المتجانسة والتي يمكن استخدامها حسب تسلسل المحتملة القبض حبلا لها طول 27 سنة مضت.
3. إعادة تشكيل النانوية وإضافة إلى الثقافات خلية
- تخزين النانوية مجفف بالتجميد على إيصال عند 4 درجات مئوية في الظلام.
- إعادة النانوية بإضافة 50 ميكرولتر الماء المقطر المزدوج الذي يعطي تركيز النهائي من 100 نانومتر. مرة واحدة أعيد مخزن النانوية في RT في الظلام. ملاحظة: تحت هذا الشرط أنها مستقرة لمدة سنة على الأقل. تخزين عينات أعيد تشكيلها في 4 ° C قد تؤثر سلبا على استقرارها.
- قبل تمييع الحل الأسهم جسيمات متناهية الصغر مع برنامج تلفزيوني إلى تركيز 2 (كلوة 293 الخلايا) أو 8 نانومتر (آي بي إس وخلايا ES) في يوم تقديم الطلب. ملاحظة: هذا التركيز هو 20 أضعاف أعلى من التركيز النهائي في صحن الثقافة. في خلايا ES وخلايا الجذع، 400 م من الجسيمات النانوية التي يسببها إشارة الفلورسنت اكتشافها بسهولة تحت المجهر. لكلوة 293 الخلايا، ميلانoncentration 100 م يكفي.
- الماصة 12.5 ميكرولتر من النانوية prediluted إلى تحتوي على 24-جيدا 237.5 ميكرولتر ثقافة خلية كاملة المتوسطة. للآبار من مختلف الأحجام، وضبط كميات فقا لذلك. دوامة لوحة بعناية لضمان التوزيع العادل للالنانوية. احتضان خلايا بين عشية وضحاها (O / N) عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في جو مرطب.
- في اليوم التالي بتحليل الثقافات الخلية الجينات المحددة CY3 مضان مع الطول الموجي الإثارة من 546 نانومتر (الانبعاثات 575-640 نانومتر) تحت المجهر مضان. ملاحظة: المدة اللازمة للحصول على مضان قوية بما فيه الكفاية قد تعتمد على نوع من الخلايا والجينات المستهدفة. في هذه التجارب، وهذا كان ينظر بين 16 و 20 ساعة بعد تطبيق التحقيق.
4. تحديد CY3 إيجابي بالسكان خلية بواسطة التدفق الخلوي
- تنمو HEK 293 أو خلايا ES الفئران باستخدام الشروط المنصوص عليها في البند 1.1 أو 1.3، صespectively. قبل يوم واحد لتحليل FACS إضافة GAPDH النانوية -specific بتركيزات مختلفة لكلوة 293 الخلايا (انظر الشكل 6A) وبسعر 400 مساء إلى الفئران خلايا ES. احتضان الخلايا O / N عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في جو مرطب.
- تحليل مزارع الخلايا لمضان الجينات المحددة CY3 التي يسببها تحت المجهر مضان.
- فصل HEK 293 الخلايا على النحو المحدد في النقطة 1.1.2. أجهزة الطرد المركزي، ونقل في أنبوب 1.5 مل و resuspend في 200 ميكرولتر الجليد الباردة PBS / 0.5٪ BSA / 2 ملي EDTA (FACS العازلة). الحفاظ زنازين مظلمة على الجليد حتى تحليل تدفق cytometric.
- فصل الخلايا ES الفئران كما هو محدد في النقطة 1.3.3. أجهزة الطرد المركزي، ونقل في أنبوب 1.5 مل و resuspend في 200 ميكرولتر الجليد الباردة PBS / 0.5٪ BSA / 2 ملي EDTA. الحفاظ زنازين مظلمة على الجليد حتى تحليل تدفق cytometric.
- اضغط على الخلايا من خلال تصفية 30 ميكرومتر لمنع تراكم الخلايا وإضافة يوديد propidium (تركيز النهائي 2 ميكروغرام / مل) 2 دقيقةقبل التحليل FACS لاستبعاد الخلايا الميتة.
- لتحليل الخلايا CY3 إيجابية المجموعة الأولى بوابات الهرمية على FSC-A / SSC-A فرعية، وFSC-H / FSC-W-فرعية وجزئية SSC-H / SSC-W. استخدام الأمام والجانب مبعثر لاستبعاد الحطام الخلية والخلايا التي لا تنتشر. استبعاد الخلايا الميتة بحكم propidium تلطيخ يوديد عرض PE ضد PE-تكساس الأحمر. أداء البوابة الفرز النهائية على خلايا إيجابية CY3-PE (الشكل 4).
Representative Results
في أول محاولة للتحقق من وإنشاء كشف الخلايا التعبير جين معين في الخلايا الحية باستخدام الجسيمات النانوية قررنا إجراء التجارب الرائدة باستخدام حفظ البيت الجينات أعرب جوهري (GAPDH) في كلوة البشري 293 الخلايا. وقد تم اختيار تركيز الجسيمات النانوية المستخدمة في هذه التجارب وفقا لتوصية من الشركة المصنعة. إضافة التحقيق GAPDH -specific إلى مستنبت بتركيز نهائي 100 م يسببها واضحة CY3 مضان في هذه الخلايا التي كانت مرئية تحت المجهر مضان بعد O / N الحضانة (الشكل 5A). وأدرجت اثنين من عناصر التحكم في هذه التجارب لإثبات النتيجة. وتضم عنصر تحكم واحد من ما يسمى ب "التدافع" جسيمات متناهية الصغر حيث لا يكون حبلا مراسل سلسلة مطابقة في خلايا الثدييات أو حقيقية النواة. يحدد "التدافع" جسيمات متناهية الصغر في fluorescen الخلفية غير محددةم بسبب تدهور التحقيق ممكنا أو التبريد غير مكتملة من مضان. إضافة التحقيق التدافع أنتجت إشارة فقط هامشية الفلورسنت، التي لا يكاد يذكر (الشكل 5B). A الاستشعاع بشكل دائم "امتصاص" السيطرة يساعد على تحديد قدرة الخلايا على دمج الجسيمات النانوية التي الإلتقام التي قد تختلف بين أنواع مختلفة من الخلايا. أنتجت هذه الجسيمات مراقبة إيجابية إشارة الفلورسنت مشرقة في كلوة 293 الخلايا (الشكل 5C). وهكذا، تم تأكيد جدوى هذه التكنولوجيا لتسجيل إشارة الفلورسنت محددة من الجينات داخل الخلايا ومع إشارة الخلفية ضئيلة. ويجب الإشارة إلى أن الفرق بين إشارة الخلفية ومضان معين بمرور الوقت. الزيادات خلفية المستحقة للتحقيق في تدهور أو التبريد غير مكتمل بينما يتلاشى مضان محددة تدريجيا (الشكل 5D). نفس النانوية -specific GAPDH لهاتم اختبارها في الثقافات الليفية الأولية من الفئران، الخنازير والأغنام أصل 17. هذه الخلايا تنتج إشارة الخلفية أعلى بكثير من كلوة 293 الخلايا في حين أن مضان هدف محدد هو ضعيفة إلى حد ما، وربما يرجع ذلك إلى قدرة التكاثري منخفضة نسبيا من هذه الثقافات.
ودفعت هذه التجارب الرائدة لنا لاستخدام هذه التكنولوجيا للكشف عن تعدد القدرات التعبير الجيني في الجذع المستمدة من مختلف الأنواع. لهذا الغرض تم تحليل NANOG وGDF3، وكلاهما من المعروف أن أعرب في الخلايا المحفزة 18. في خلايا الجذع الأولى المستمدة من الخلايا الليفية الذيل غيض من Nkx2.5 محسن القلب خط الماوس المعدلة وراثيا 19 تم التحقيق. لكل من الجينات تم الحصول على إشارة قوية الفلورسنت (الشكل 6A) ويذكر CY3 مضان من السيطرة التدافع (لا تظهر البيانات). وتم الحصول على نتائج مماثلة على خلايا الجذع الإنسان والخنازير (الشكل 6B و C). الأهم من ذلك، اقتصر إشارة مضان إلى المستعمرات الجذع ولم تسمية الخلايا الليفية استخدامها كطبقة المغذية للماوس والجذع الخنازير (انظر السهام في الشكل 6A و C). وكشف تحليل NANOG التعبير الجيني أيضا أنه ليس كل تسلسل توقع في سيليكون لتكون "جيدة" هو في النهاية وظيفية. واحد من ثلاثة تصاميم من NANOG النانوية -specific يسببها تقريبا أي إشارة الفلورسنت مماثلة لتلك التي من السيطرة التدافع على الرغم من مباراة تسلسل 100٪ في خلايا الجذع الفئران (الشكل 6D). تم الحصول على نتيجة مماثلة على الجذع خلايا المنشأ البشرية والخنازير مع هذا التحقيق (لا تظهر البيانات). وهكذا، النانوية يمكن أن تستخدم لكشف تعدد القدرات التعبير الجيني عبر الحدود الأنواع بينما وظيفة كل واحد مصممة التحقيق يجب أن يتم تقييمها مسبقا.
نتائج واعدة لفي الموقعوسم الخلايا الحية في أطباق زراعة الخلايا دفعتنا لتحليل التعبير الجيني الكمية التي التدفق الخلوي. تحقيقا لهذه الغاية أضيفت GAPDH النانوية -specific في تركيزات متدرجة لكلوة 293 الطبقات الوحيدة من أجل مقارنة كفاءة وضع العلامات في أوساط السكان الخلية المستهدفة. وفقا لتقييم المجهر الفلورسنت شوهد مضان تعزيز CY3 التي يسببها بأقل تركيز بالمقارنة مع الخلايا التي لم تتلق النانوية. زيادة تركيزات الجسيمات النانوية التي يسببها مضان بوضوح تركيز تعتمد من كلوة 293 الخلايا الموقع (الشكل 7A) في. إخضاع هذه الخلايا لتحليل تدفق cytometric أكدت تركيز تعتمد الكفاءة وصفها. تردد الخلايا إيجابية CY3 زيادة كبيرة (أكثر من سبع مرات) عندما تم تطبيق أعلى تركيز الجسيمات النانوية (7B الشكل). في مزيد من التجارب خلايا ES من القلب Nkx2.5واستخدمت محسن خط الماوس المعدلة وراثيا 19 لتحليل التعبير عن الجينات تعدد القدرات التدفق الخلوي. التجارب الرائدة مع 400 م من السيطرة امتصاص إيجابية أثمرت CY3 بوضوح الإيجابية ES الحية مستعمرات تحت المجهر والتدفق الخلوي الكشف عن ما يقرب من 40٪ من خلايا إيجابية CY3 (الشكل 7C). في المقابل، مماثلة لخلايا غير المعالجة حوالي 0.1٪ من الخلايا المعالجة مع التدافع الملون الموجب (لا تظهر البيانات). وبالمثل، فإن إضافة جسيمات النانو محددة لGAPDH، NANOG وGdf3 يسببها إشارة مضان متميزة في المستعمرات الفردية في طبق ثقافة الخلية. وكان تردد من خلايا إيجابية CY3 لGAPDH على النحو الذي يحدده التدفق الخلوي مماثلة لتلك التي ينظر إليها على حد سواء الجينات تعدد القدرات (الشكل 7C). هذه النتيجة متوقعة كما يعتقد NANOG وGdf3 أيضا أن أعرب جوهري في خلايا ES المحفزة. وهكذا، وهذه البيانات إيندي بوضوحكيت أن الخلايا معربا عن جينات معينة يمكن تحديدها من قبل تدفق cytometric التحليلات والنوعية والقيمة النسبية الخاصة بهم.
الشكل 1: تمثيل تخطيطي للهيكل النانوية. (A) هيكل من جسيمات متناهية الصغر الجينات المحددة. (B) جسيمات متناهية الصغر التدافع (المراقبة السلبية). (C) امتصاص جسيمات متناهية الصغر (مراقبة إيجابية). مقتبس من لام آخرون 17، وأعيد طبعه بإذن من وايلي.
الشكل 2: تطبيق النانوية إلى الخلية الثقافات وpipetted محلول مخفف بشكل صحيح من الجسيمات النانوية ببساطة في مستنبت. بعد O / N حضانة الجينات المحددة الخلايا الفلورسنت مرئية تحت بالعربية luorescent المجهر.
الرقم 3: امتصاص فعال في النانوية بواسطة الخلايا عن طريق الإلتقام (A) خلايا تبتلع بنشاط النانوية التي الإلتقام (B) الهدف مرنا بربط القبض حبلا ويزيح مراسل الإستشعاع.
الرقم 4: استراتيجية المحاصرة لالتدفق الخلوي. (A) استراتيجية HEK 293 الخلايا. (B) استراتيجية لخلايا ES الفئران. تم الحصول على البيانات باستخدام جهاز 1 للكلوة 293 الخلايا أو جهاز 2 للخلايا ES الفئران وحللت في وقت لاحق من قبل أداة برمجية (انظر جدول المواد).
/53268fig5.jpg "/>
الرقم 5: تحليل -expression GAPDH في كلوة 293 الخلايا وأضيف GAPDH جسيمات متناهية الصغر -specific إلى الخلايا في 100 م (تركيز النهائي) وكانت قد سجلت مضان بعد O / N الحضانة (A) GAPDH جسيمات متناهية الصغر -specific (B. ) يتبارى (المراقبة السلبية). (C) امتصاص (مراقبة إيجابية). (D) حركية التدافع والسيطرة امتصاص. تقرر مضان في مبين نقاط وقت بعد إضافة GAPDH النانوية -specific. تمثل الحانات نطاق 50 ميكرومتر.
الرقم 6: تحليل تعدد القدرات التعبير الجيني في الخلايا المحفزة للأنواع المختلفة من الجسيمات النانوية محددة لNANOG أو GDF3 تمت إضافتها إلى خلايا في 400 م (بغية دراسته واقراره النهائيةntration) ومضان تم تسجيلها بعد O / N الحضانة. (A) خلايا الفئران الجذع. (B) خلايا الجذع الإنسان. (C) خلايا الخنزير الجذع. سهام في (A) و (C) تعيين الليفية غير المسماة الخلايا المغذية طبقة (D) الإسفار في خلايا الجذع الفئران بعد إضافة NANOG تصميم SF3 جسيمات متناهية الصغر. تمثل الحانات نطاق 50 ميكرومتر.
الرقم 7: الجسيمات النانوية إعتبر الخلايا الحية يمكن تحديدها من قبل التدفق الخلوي. (A) نظرا المجهري للCY3 HEK إيجابي 293 الخلايا بعد إضافة تركيزات مختلفة من الجسيمات النانوية. (B) تردد من خلايا إيجابية CY3 يحددها التدفق الخلوي. (C) تلطيخ لايف من الفئران مستعمرات الخلايا ES وتحديد وتيرة CY3 إيجابي الخلايا. أضيفت النانويةبتركيز نهائي 400 م. تمثل الحانات نطاق 50 ميكرومتر.
Discussion
يصف هذا العمل استخدام مضان المسمى النانوية التي تسمح للتقييم موثوق من داخل الخلايا التعبير الجيني مباشرة في الخلايا الحية من أنواع الثدييات المختلفة مع الأصل مكون للأنسجة متنوعة تحت المجهر مضان. هذا النهج لديه اثنين من المزايا بالمقارنة مع الطرق الأخرى المنشورة. أولا وقبل كل باحث لا يقتصر فيما يتعلق إما الجين المستهدف أو نوع من الخلايا. وتقتصر كل طرق الكشف الأجسام المضادة تستند إلى حاتمة واحدة. على الرغم من منارات الجزيئية الفلورسنت ويمكن أيضا أن تكون مصممة لطيف واسع من الجينات، يتطلب هذا الأسلوب في تفكك الخلايا وnucleofection لاحق 15. في المقابل، لا يتطلب تطبيق النانوية الجينات المحددة أي تلاعب في الخلية المستهدفة التي تكتنف النانوية بنشاط الإلتقام. خلال الركض لاحق من جزيئات الذهب ترك تدريجيا الخلايا والثقافة يمكن أن تستخدم في downstreaم التجارب.
ومع ذلك، فإن التكنولوجيا أيضا لا يزال لديه بعض القيود. بعض علامات ليست بالطبع يمكن اكتشافها نظرا لطبيعتها الكربوهيدرات مثل SSEA-1 أو TRA-1-81 20. في الوقت الحاضر، مجموعة كبيرة من الجسيمات النانوية هي متاحة تجاريا. تم pretested هذه الجسيمات حصول على وظائف في التجارب الخلوية. وكان الهدف من هذا العمل لتصميم تحقيقات مخصصة والتي يمكن استخدامها عبر الحدود الأنواع. عند اتباع هذا النهج أو عند تصميم التحقيق لرواية واحدة الجين المستهدف يجب أن يكون على علم بأن وظيفة لفي سيليكون وتوقعت يحتاج التحقيق لإجراء تقييم دقيق في المختبر. لم التحقيق NANOG-SF3 التي أظهرت تناظر 100٪ للتناظر تسلسل لا تعمل على الإطلاق في حين NANOG-SF1 مع قاعدة متطابقة واحد في الفئران والخنازير تسلسل المنتجة لطيفة إشارة مضان. سؤال آخر يشير إلى امتصاص فعال من الجسيمات النانوية. الجسيمات دخولالخلايا عن طريق الإلتقام، وهي العملية التي يتأثر حجم الجسيمات النانوية 21، ونوع من الخلايا وحالة التمايز 22 والقدرة الخلوية لأداء البلعمة؛ الأكل وmacropinocytosis 23. تركيز الأمثل للحصول على إشارة مضان مرضية لابد من اختبار لكل طلب فردي أو خط الخلية. وتحقيقا لهذه الغاية، ينبغي أن التجربة الأولى ستكون دائما تطبيق مراقبة امتصاص لتقييم مدى توافق تحقيقات داخل أنواع الخلايا والشروط الثقافة قبل أن ينتقل إلى استهداف محددة الكشف عن التعبير الجيني.
وهناك نقطة هامة للحصول على نتائج موثوقة عند تطبيق هذا البروتوكول إلى خط خلية رواية أو السكان الخلية هو إدراج ضوابط سليمة. سوف تحكم امتصاص الاستشعاع من أي وقت مضى توفير تلميحا التي تركيزات الجسيمات النانوية ستؤدي إلى إشارة فلوري كافية في السكان الخلية المستهدفة. مضان يجب تقييمد في اليوم التالي كما إشارة سوف تتلاشى مع مرور الوقت 17. في الوقت نفسه سيطرة التدافع دون نظيره في جينوم وحيد الخلية تطبيقها في تركيز مماثل يجب أن تحفز على إشارة الخلفية ضئيلة. كعنصر تحكم الثالثة فمن المستحسن استخدام جسيمات متناهية الصغر محددة لجين التجهيزات المنزلية (على سبيل المثال GAPDH، β-أكتين). هذه الجسيمات النانوية بمثابة مراقبة إيجابية أن النهج يمكن أن تستخدم لكشف محددة التعبير الجيني في السكان الخلية المستهدفة المحددة. إذا هذه الضوابط تتحول واحدة مرضية يمكن أن نتوقع الحصول على إشارات الفلورسنت محددة موثوقة باستخدام الجسيمات النانوية محددة لغيرها من الجينات المستهدفة. تركيز الجسيمات النانوية تطبيقها قد تكون أيضا عاملا حاسما كما ثبت أنها لأسفل تنظيم تسلسل الهدف 24. ومع ذلك، هذا التأثير يتطلب تركيزات أعلى من ذلك بكثير (5 نانومتر) من التركيزات المستخدمة في التجارب المقدمة هنا (400 م). في هذه تركيز nanoflaالدقة لا تؤثر على الهدف مرنا الجينات أو مستويات البروتين وتركيزات عالية تصل إلى 2 نانومتر لا تنال من انتشار HEK293 وخلايا الفئران ES 17. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تحليل الجينوم التعبير كله لم تكشف عن أي تغييرات كبيرة في التعبير الجيني 25. ولذلك، بتركيزات تصل إلى 1 نانومتر وnanoflares لا ينبغي أن تظهر أي آثار سلبية هامة.
تطبيق واعد جدا من هذه التكنولوجيا هو إمكانية تسمية أية مجموعة من السكان خلية معينة التي تتسم جين معين. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت بنجاح النانوية الجينات المحددة وصمة عار انتقائي myocytes البطين حي 26، القطعان من خلايا سرطان الجلد 27، وحيدات الخلية 28 و المخيخ الثقافات 29. هؤلاء السكان خلية بعلامات مضان ويمكن فرزها وتنقيتها عن طريق التدفق الخلوي الخلايا الحية كما. في مجال علم الأورام هو تصورها لعزل خلايا الورم النقيلي الحية في النماذج الحيوانيةعلى أساس التعبير عنها من CEA، الأكثر قيمة للبحث عن الانبثاث المحتملين تعزيز الجينات أو هياكل الهدف. نحن في الآونة الأخيرة أنه برمجتها حقا الجذع مستعمرات الفئران يمكن تحديدها في الموقع مع NANOG النانوية -specific على أساس كثافة مضان الكشف عن 17. لذلك، وتحديد المستعمرات الجذع برمجتها حقا يمكن أن يؤديها على منصات إنتاجية عالية، والتي تستخدم كشف مضان الروبوتية وأجهزة التقاط لتحديد المستعمرات الواعدة. هذه التقنية تبدو مناسبة في العديد من مجالات البحوث لتحديد مجموعات سكانية فرعية الخلوية محددة، ويبدو من الممكن تطبيق النانوية في منصات إنتاجية عالية. في الختام، ويمثل هذا البروتوكول نهجا جديدا باستخدام مضان المسمى النانوية التي تسمح للكشف عن الخلايا التعبير الجيني مباشرة في الخلايا الحية. هذه التكنولوجيا قد تكون أداة قيمة لتنقية وتوسيع وزيادة حرفإيزي القطعان الخلوية نادرة في العديد من المجالات البحثية.
Disclosures
تلقت HL النانوية من EMD ميليبور شركة مجانا. كل الكتاب الآخرين ليس لديهم ما يكشف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/Ham's F12 medium with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG4815 | |
| Fetal calf serum | Life Technologies | SV30160.03 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Millipore | A2213 | |
| Sodium pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-039 | |
| DMEM high glucose with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG0435 | |
| Mitomycin C | Roche | 10 107 409 001 | prevents cell division of MEFs |
| MEM non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Leukemia inhibitory factor (107 U/ml) | Millipore | ESG1107 | growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation |
| 0.25% Trypsin/EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 | detaches adherent cell cultures |
| Knockout serum | Invitrogen | 10828-028 | supplement for human and porcine iPS cell culture |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | growth factor for human and porcine iPS cells |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | dissociation of pig iPS cells |
| Matrigel | Corning | 354277 | effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript |
| E8 medium | Stem Cell Technologies | 05940 | defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel |
| EDTA 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
| SmartFlare Probes | EMD Millipore Corporation | customized item | detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
| HeraCell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | |
| Gelatine (from porcine skin) | Sigma | G6144 | enhances attachment of MEFs to surface |
| Propidium iodide (1 mg/ml) | Sigma | P4864 | labels dead cells in flow cytometric analyses |
| BD FACS Aria Illu | Becton Dickinson | A4544 | referred to as device 1 in Figure 4 |
| Navios | Beckman Coulter | 775213 | referred to as device 2 in Figure 4 |
| FloJo vX 10.0.7r2 | Treestar | software for analysis of flow cytometry data |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Liu, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts. Cell Stem Cell. 3 (6), 587-590 (2008).
- Liao, J., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells. Cell Stem Cell. 4 (1), 11-15 (2009).
- Luo, J., et al. Generation of leukemia inhibitory factor and basic fibroblast growth factor-dependent induced pluripotent stem cells from canine adult somatic cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1669-1678 (2011).
- Bao, L., et al. Reprogramming of ovine adult fibroblasts to pluripotency via drug-inducible expression of defined factors. Cell Res. 21 (4), 600-608 (2011).
- Esteban, M. A., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from Tibetan miniature pig. J. Biol. Chem. 284 (26), 17634-17640 (2009).
- Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat. Biotechnol. 6 (1), 101-106 (2008).
- Maekawa, M., et al. Direct reprogramming of somatic cells is promoted by maternal transcription factor Glis1. Nature. 474 (7350), 225-229 (2011).
- Marti, M., et al.
- Wada, N., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human gingival fibroblasts and periodontal ligament fibroblasts. J. Periodontal Res. 46 (4), 438-447 (2011).
- Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
- Singh, U., et al. Novel alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. Rep. 8 (3), 1021-1029 (2012).
- Kang, N. -Y., et al. Embryonic and induced pluripotent stem cell staining and sorting with the live-cell fluorescence imaging probe CDy1. Nat. Protoc. 6 (7), 1044-1052 (2011).
- Ban, K. B., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons targeting cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128 (17), 1897-1909 (2013).
- Seferos, D. S., Giljohann, D. A., Hill, H. D., Prigodich, A. E., Mirkin, C. A. Nano-flares: probes for transfection and mRNA detection in living cells. J. Am. Chem. Soc. 129 (50), 15477-15479 (2007).
- Lahm, H., et al. Live fluorescent RNA-based detection of pluripotency gene expression in embryonic and induced pluripotent cells of different species. Stem Cells. 33 (2), 392-402 (2015).
- Clark, A. T., et al. NANOG and GDF3 genes are expressed in pluripotent cells and map to chromosome 12p13, a hotspot for teratocarcinoma. Stem Cells. 22 (2), 169-179 (2004).
- Wu, S. M., et al. Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart. Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).
- Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Yue, T., Zhang, X. Cooperative effect in receptor-mediated endocytosis of multiple nanoparticles. ACS Nano. 6 (4), 3196-3205 (2012).
- Andersson, L. I., Hellman, P., Eriksson, H. Receptor-mediated endocytosis of particles by peripheral dendritic cells. Hum. Immunol. 60 (10), 625-633 (2008).
- Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J.
- Prigodich, A. E., Seferos, D. S., Massich, M. D., Giljohann, D. A., Lane, B. C., Mirkin, C. A. Nano-flares for mRNA regulation and detection. ACS Nano. 3 (8), (2009).
- Weldon, D., Williams, Y., Ko, A. Cell sorting based on RNA detection in living cells using SmartFlareTM RNA detection reagents.. , EMD Millipore Application Note. Available from: http://www.emdmillipore.com/ (2013).
- Mehta, A., et al. Re-trafficking of hERG reverses long QT syndrome 2 phenotype in human iPS-derived cardiomyocytes. Cardiovasc. Res. 102 (3), 497-506 (2014).
- Seftor, E. A., et al. Melanoma tumor cell heterogeneity: a molecular approach to study subpopulations expressing the embryonic morphogen Nodal. Sem. Oncol. 41 (2), 259-266 (2014).
- Khare, S., et al. The PYRIN domain-only protein POP3 inhibits ALR inflammasomes and regulates responses to infection with DNA virus. Nat. Immunol. 15 (4), 343-353 (2014).
- Kratz, A., et al. Digital expression profiling of the compartmentalized translatome of Purkinje neurons. Genome Res. 24 (8), 1396-1410 (2014).
