Introduction
Under 2006 har en ny metod som beskrivs att programmera somatiska celler i ett pluripotent tillstånd. Efter prescreening av en array av potentiell omprogrammering faktorer murina fibroblaster framgångsrikt kunde omvandlas till s.k. inducerade pluripotenta stamceller (iPS) genom retroviral transduktion och överexpression av fyra transkriptionsfaktorer (Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc) 1. Därefter denna teknik har på ett effektivt sätt återgivits med somatiska celler från olika däggdjursarter inklusive människa 2, apor 3, råttor 4, hundar 5, får 6 och grisar 7. Dessutom ändrade protokoll utelämna eller byta ut potentiellt onkogen transkriptionsfaktorn c- MYC har publicerats 8, 9.
Oberoende av den initiala omprogrammering närma den sanna pluripotens av växande kolonier måste bekräftas, en mödosam och tidskrävande uppgift. En stor nackdelav huvuddelen av dessa analyser är att de inte kan utföras på levande celler. Etablerade pluripotensbestämmande faktorer såsom Oct4, Sox2, NANOG eller REX1 representerar transkriptionsfaktorer som ligger i kärnan och deras detektion kräver fixering av cellerna före immunohistokemi eller cellys för RT-PCR-analys 10 -. 12 Därefter dessa celler förlorade för framtida experiment som kräver upprepade kulturer av varje koloni.
Således, är mycket önskvärt en teknik för att analysera pluripotens på levande celler. Flera metoder kan faktiskt utföras direkt på levande celler med användning av antikroppar riktade mot membranbaserade antigener (t.ex.. TRA-1-60, SSEA4) 12, rapporterade fluorescerande färgämnen för att detektera alkaliskt fosfatas 13 eller små molekyler, som specifikt märka embryostam (ES) och iPS-celler 14. Däremot kan antikropparna ändå negativt påverkar cellerna och varje method är begränsad till en enda pluripotens markör. Slutligen fluorescerande molekylära fyrar, dubbla antisensoligonukleotider med hårnålsstrukturer, som tillåter levande färgning av celler, har beskrivits 15. Även om detta tillvägagångssätt kan appliceras på många gener kräver tekniken nucleofection av en enkelcellsuspension, som inte är tillämpligt på växande iPS kolonier.
För ett par år sedan genspecifika nanopartiklar har beskrivits för att analysera survivin uttryck i humana SKBR3 bröstcancerceller 16. Detta manuskript beskriver en ny innovativ metod för att upptäcka pluripotens markörer i levande ES och iPS-celler med hjälp av guldnanopartiklar konjugat. Dessa nanopartiklar består av en central guldpartikel med en kopplad infångnings sträng som bär den komplementära RNA-sekvensen och en Cy3-märkt reporter strängen. Den fluorescerande signalen av reporter strängen släckes genom den centrala guldpartikel. Dessutom lämpligtnanopartiklar tjänar som negativa och positiva kontroller, respektive (Figur 1). För en ansökan nanopartiklarna är helt enkelt läggas till odlingsmediet (Figur 2) och in i cellerna via endocytos (Figur 3). Om mål-RNA uttrycks den förflyttar reporter sträng som sedan emitterar en fluorescenssignal. Denna metod kräver inte manipulering av målcellen och uttrycket av målgenen kan övervakas optiskt under ett fluorescensmikroskop direkt i levande celler. Vidare kan tekniken tillämpas på vilken som helst önskad målgen mellan arter i fallet med iPS-celler och sålunda kan användas i många olika forskningsområden. Slutligen analyserar flödescytometrisk möjliggöra identifiering och anrikning av Cy3 positiva celler.
Protocol
1. Framställning av medier, reagenser och cellodlingsbetingelser
- Humant HEK 293 embryonala njurceller
- Kultur HEK 293-celler (CRL-1573, ATCC) i DMEM / Hams F-12-medium kompletterat med 5% FCS, L-glutamin (2 mM) och penicillin (100 U / ml) / streptomycin (100 | ig / ml).
- Till passagen cellerna, tvätta cellerna en gång med PBS, tillsätt 0,05% trypsin / EDTA och inkubera i 3 min vid 37 ° C och 5% CO2. Överför celler till en 15 ml rör, centrifugera i 5 minuter vid 1200 rpm (300 x g) och överför approximativt 5x10 5 celler in i en färsk T25 odlingskolv.
- Murina embryonala fibroblaster (MEF)
- Tillsätt 1 ml av en 0,1% gelatinlösning till individuella 6-brunnar och inkubera vid rumstemperatur (RT) under en timme. Aspirera vätska och lagra vid RT tills det ska användas.
- Kultur MEFs i DMEM kompletterat med 10% FCS, L-glutamin (2 mM), L-glukos (4,5 g / I), natriumpyruvat (1 mM) och penicillin (100 U /ml) / streptomycin (100 | ig / ml) på gelatinbelagda 6-brunnsplattor.
- Fördela MEF i 6-brunnsplattor och låta dem växa till konfluens. Lägg mitomycin (5 | ig / ml) under 2,5 timmar för att stoppa celler. Sug medium, tvätta cellerna två gånger med fullständigt MEF medium och tillsätt 3 ml MEF medium till varje 6 brunnar. Dessa celler tjänar som en matare-skikt för murina och porcina iPS-celler.
- Odling av murina ES och iPS-celler
- För att framställa mus ES-odlingsmedium, komplettera DMEM-medium med 15% FCS, L-glutamin (2 mM), L-glukos (4,5 g / I), MEM icke-essentiella aminosyror (1x), β-merkaptoetanol (0,1 mM) och leukemihämmande faktor (1,000 U / ml).
- Skölj 6-brunnar med tillväxthämmade MEF gång med serumfritt DMEM, tillsätt 2 ml mus ES-medium och murina iPS-celler (20% av cellerna hos ett sammanflytande maträtt). Varje dag tvätta cellerna en gång med serumfritt DMEM och tillsätt 2 ml färsk mus ES-medium.
- Till passagen cellerna, tvätta varje brunn en gång med serumfritt DMEM, tillsätt 00,25% trypsin / EDTA och inkubera i 3 min vid 37 ° C och 5% CO2. Överför celler till en 15 ml rör, centrifug under 5 min vid 1200 rpm (300 x g), Resuspendera cellerna i 500 | il mus-ES-medium och tillsätt 100 | il av suspensionen till 2 ml mus ES-medium i en färsk 6-väl med en MEF matare-skiktet.
- Odling av gris iPS-celler
- För att framställa gris iPS-medium, komplettera DMEM / Hams F-12-medium med 20% knockout serum, L-glutamin (2 mM), MEM icke-essentiella aminosyror (1x), β-merkaptoetanol (0,1 mM) och penicillin (100 E / ml) / streptomycin (100 | ig / ml). Filtrera genom ett 0,22 pm filter och förvara vid 4 ° C under 2 till 3 veckor. Vid första användning, tillsätt bFGF (10 ng / ml slutkoncentration).
- Skölj 6-brunnar med tillväxthämmade MEF gång med serumfritt DMEM / Hams F-12 och tillsätt 1,5 ml gris iPS medel och svin iPS-celler (10% av cellerna hos ett sammanflytande maträtt). Varje dag tvätta cellerna en gång med serumfritt DMEM / Hams F-12 och lägg 1,5 ml färsk gris iPS medel.
- För att framställa dissociationsbuffert lägga 2,5% trypsin, kollagenas IV (10 mg / ml), knockout serum (20%) och CaCl2 (1 mM) för Ca 2 + -fri PBS. Tvätta cellerna två gånger med PBS och inkubera med dissociationsbuffert under 5 min vid 37 ° C och 5% CO2. Överför celler till en 15 ml rör, centrifugera i 5 minuter vid 1200 rpm (300 x g).
- Resuspendera svin iPS-celler i 500 l färskt svin iPS-medium och tillsätt 50 pl av suspensionen till 1,5 ml gris iPS medium i en ny 6-bra med en MEF matare lager. Varje dag tvätta cellerna en gång med serumfritt DMEM / Ham F-12 och lägga till 1,5 ml färskt gris iPS medium.
- Feeder-fri kultur av humana iPS-celler
- Tina den ursprungliga flaskan med basalmembranpreparatet vid 4 ° C och späd med iskall serumfritt DMEM / Hams F-12 till 8 mg / ml, alikvot och förvara vid -20 ° C tills vidare användning.
- Tina en alikvot av basenningsmembranpreparat vid 4 ° C och späd med iskall serumfritt DMEM / Hams F12 (90 | ig / ml). Pipett 1 ml av denna lösning i 3 cm odlingsskålar och snurra försiktigt för att säkerställa att hela ytan är täckt. Täta rätter med parafilm och förvara vid 4 ° C i upp till en vecka. Före användning för cellodling inkubera rätter för 30 min vid 37 ° C eller 3 timmar vid rumstemperatur för att tillåta polymerisation av basalmembranberedning.
- Aspirera medium från skålar belagda med basalmembranpreparatet och tvätta två gånger med serumfritt DMEM / Hams F-12. Lägg 1,5 ml E8 medium till odlingsskålen och mänskliga iPS-celler (10% av cellerna hos ett sammanflytande maträtt). Varje dag tvätta cellerna en gång med serumfritt DMEM / Hams F-12 och tillsätt 1,5 ml färskt E8 medium.
- Passage cellerna, skölj rätter två gånger med PBS och tillsätt 1 ml PBS / 0,5 mM EDTA. Inkubera skålarna under 5 min vid RT. Övervaka celler i mikroskop. Obs: När kolonierna börjar samla ihop och appear att få hål de är redo för överföring.
- Aspirera vätskan, tillsätt 1,5 ml E8 medium och lösgöra cellerna genom att försiktigt pipettera upp och ned. Överför celler till en 15 ml rör, centrifugera i 5 minuter vid 1200 rpm (300 x g), återsuspendera i 500 | il E8-medium och tillsätt 50 | il av suspensionen till 1,5 ml E8 medium i en färskt odlingsskål belagd med basalmembranet preparatet .
2. Design av Target-sekvenser mellan arter Borders
- Välj referens människa, mus och svin cDNA-sekvenser av målgener (GAPDH, NANOG, GDF3) och utför en CLUSTAL multi-sekvensinriktningsanalys.
Obs: Detta indikerar sekvenserna homolog mellan arter.- Använd följande inställningar för flera inriktning: gap straff (fast) 10, gap straff (varierande) 5, övergångs viktning 0, gap separations straff intervallet 8% identitet för fördröjning 40, till maximalt antal iterationer utföra 3.
- Skicka in önskade målsekvenser till tillverkaren (se tabell för materialkemi) för sond konstruktion och tillverkning.
Obs: Tillverkaren kommer då att bekräfta förenligheten önskad sekvens med tekniken. Om så önskas kan sekvensen inte är kompatibel kommer tillverkaren föreslå alternativa sekvenser.- Se till att homologa regioner som kan användas som potentiella fånga strängsekvenser har en längd av 27 bp.
Obs: Det är tillrådligt att beställa flera nanopartiklar med olika infångnings trådar för en vald målgen som bara den verkliga cellulära experiment kommer att ge ett definitivt bevis på funktionaliteten hos en enskild sekvens. Därför användes två olika sekvenser för GAPDH och GDF3 utvärderas medan tre olika nanopartiklar testades för att utvärdera NANOG expression. Deras placering och de exakta sekvenserna har publicerats på annat håll 17. Tillverkaren tillverkar kommersiellt i nanopartiklar med önskade sekvenser och ger dem i frystorkad form.
- Se till att homologa regioner som kan användas som potentiella fånga strängsekvenser har en längd av 27 bp.
3. Beredning av Nanopartiklar och tillägg till cellkulturer
- Lagra lyofiliserade nanopartiklar vid mottagandet vid 4 ° C i mörker.
- Rekonstruera nanopartiklar genom tillsats av 50 | j, l dubbeldestillerat vatten, som ger en slutlig koncentration av 100 nM. Efter beredning butiksnanopartiklar vid RT i mörker. Anmärkning: Under detta förhållande är de stabila under minst ett år. Lagring av rekonstituerade proverna vid 4 ° C kan påverka deras stabilitet.
- Pre-späda nanopartiklar stamlösningen med PBS till en koncentration av 2 (HEK 293-celler) eller 8 nM (iPS och ES-celler) på dagen för ansökan. Notera: Denna koncentration är 20 gånger högre än den slutliga koncentrationen i odlingsskålen. I ES-celler och iPS-celler, 400 pM av nanopartiklar inducerade en fluorescerande signal lätt detekterbar under mikroskop. För HEK 293-celler, aconcentration av 100 pM är tillräckligt.
- Pipettera 12,5 pl av förspädd nanopartiklar till en 24-brunnars innehållande 237,5 pl komplett cellodlingsmediet. För brunnar i olika storlekar, justera volymen därefter. Snurra plattan försiktigt för att garantera lika fördelning av nanopartiklar. Inkubera cellerna över natten (O / N) vid 37 ° C och 5% CO2 i en fuktad atmosfär.
- Nästa dag analysera cellkulturer för genspecifik Cy3 fluorescens med en excitationsvåglängd av 546 nm (emission 575 - 640 nm) under ett fluorescensmikroskop. Obs: Den tid som krävs för att erhålla en tillräckligt stark fluorescens kan bero på celltypen och målgenen. I dessa experiment var detta ses mellan 16 och 20 timmar efter appliceringen av sonden.
4. Identifiering av Cy3 Positiva cellpopulationer med flödescytometri
- Väx HEK 293 eller mus ES-celler med hjälp av de villkor som anges i avsnitt 1.1 eller 1.3, respectively. En dag före FACS-analys till GAPDH -specifika nanopartiklar vid olika koncentrationer för att HEK 293-celler (se figur 6A) och åtmin 400 pM till murina ES-celler. Inkubera cellerna O / N vid 37 ° C och 5% CO2 i en fuktad atmosfär.
- Analysera cellkulturer för genspecifik Cy3-inducerad fluorescens under ett fluorescensmikroskop.
- Lossa HEK 293-celler som anges i punkt 1.1.2. Centrifug, överföring till ett 1,5 ml rör och återsuspendera i 200 ul iskall PBS / 0,5% BSA / 2 mM EDTA (FACS buffert). Håll celler mörka på is tills flödescytometrisk analys.
- Lossa murina ES-celler som anges i punkt 1.3.3. Centrifug, överföring till ett 1,5 ml rör och återsuspendera i 200 ul iskall PBS / 0,5% BSA / 2 mM EDTA. Håll celler mörka på is tills flödescytometrisk analys.
- Tryck cellerna genom en 30 iM filter för att förhindra cellaggregation och till propidiumjodid (2 ng / ml slutlig koncentration) 2 minföre FACS-analys för att utesluta döda celler.
- För att analysera Cy3-positiva celler först ställa hierarkiska grindar på FSC-A / SSC-A delmängd, FSC-H / FSC-W-delmängd och SSC-H / SSC-W delmängd. Använd framåt och sidospridning att utesluta celldebris och celler som inte är spridda. Utesluta döda celler genom deras propidiumjodidfärgning visar PE mot PE-Texas Red. Utför slutliga sorterings gate på Cy3-PE-positiva celler (Figur 4).
Representative Results
I ett första försök att kontrollera och fastställa den intracellulära detektion av specifika genuttryck i levande celler med hjälp av nanopartiklar som vi beslutat att genomföra pilotförsök med hjälp av en konstitutivt uttryckt hus bevarande gen (GAPDH) i human HEK 293-celler. Koncentrationen av nanopartiklar som används i dessa experiment valdes enligt rekommendationerna från tillverkaren. Tillsatsen av en GAPDH-specifik sond till odlingsmediet vid en 100 pM slutkoncentration inducerade en entydig Cy3-fluorescens i dessa celler som var synlig under ett fluorescensmikroskop efter O / N inkubation (figur 5A). Två kontroller ingick i dessa experiment för att styrka resultatet. En kontroll består av en så kallad "rusning" nanopartikel där rapportören strängen inte har en matchande sekvens i däggdjurs eller eukaryota celler. "Kapplöpningen" nanopartiklar bestämmer ospecifika bakgrunden fluorescence på grund av möjlig sond nedbrytning eller ofullständig släckning av fluorescens. Tillsatsen av förvrängnings sonden gav en marginell fluorescerande signal, som är försumbar (figur 5B). En permanent fluorescerande "upptaget" kontroll hjälper till att bestämma förmågan hos cellerna att införliva nanopartiklar genom endocytos som kan variera mellan olika celltyper. Dessa positiva kontrollpartiklar producerade en ljust fluorescerande signal i HEK 293-celler (figur 5C). Således var det är möjligt att tekniken för att spela in en specifik fluorescerande signal av en intracellulär gen med försumbar bakgrundssignal bekräftas. Det måste nämnas att skillnaden mellan bakgrundssignalen och den specifika fluorescensen minskar med tiden. Bakgrunds ökar på grund av sond nedbrytning eller ofullständig härdning medan specifik fluorescens bleknar gradvis (Figur 5D). Samma GAPDH -specifika nanopartiklar hartestats i primära fibroblastkulturer av mus, svin och får ursprung 17. Dessa celler producerar ett mycket högre bakgrundssignal än HEK 293-celler medan målet-specifik fluorescens är ganska svag, möjligen på grund av den relativt låga proliferativa kapaciteten hos dessa kulturer.
Dessa pilotförsök fick oss att använda denna teknologi för detektion av pluripotens genuttryck i iPS härledda från olika arter. För detta ändamål NANOG och GDF3 analyserades, av vilka båda är kända för att uttryckas i pluripotenta celler 18. Vid första iPS-celler härledda från svans-tip fibroblaster av en Nkx2.5 hjärt förstärkare transgen mus linje 19 undersöktes. För båda generna en stark fluorescerande signal erhölls (fig 6a) och en försumbar Cy3-fluorescens för förvrängnings kontrollen (data ej visad). Liknande resultat erhölls med humana och porcina iPS-celler (Figur 6B och C). Viktigt var fluorescenssignalen begränsad till de iPS kolonierna och inte märka fibroblaster som används som ett matarskikt för mus och svin iPS (se pilarna i fig 6A och C). Analysen av NANOG genuttryck visade också att inte varje sekvens förutspådde in silico för att vara "bra" äntligen är funktionell. En av tre mönster av en nanog specifika nanopartiklar inducerade nästan ingen fluorescerande signal som är jämförbar med den hos rusning kontroll trots en 100% sekvens match i murina iPS-celler (figur 6D). Ett liknande resultat erhölls på iPS-celler från människa och svin med denna prob (data ej visade). Således kan nanopartiklar användas för att detektera pluripotens genuttryck över arter gränser medan funktionaliteten hos varje enskild utformad sond måste utvärderas på förhand.
De lovande resultaten av in situmärkning av levande celler i cellodlingsskålar fick oss att analysera genexpression kvantitativt genom flödescytometri. För detta ändamål GAPDH -specifika nanopartiklar tillsattes vid graderade koncentrationer för att HEK 293-monoskikt i syfte att jämföra de märkningseffektiviteten inom målcellspopulationen. Såsom bestämdes genom fluorescensmikroskopi en förbättrad Cy3-inducerad fluorescens sågs med den lägsta koncentrationen jämfört med celler som inte fick nanopartiklarna. Ökande koncentrationer av nanopartiklar inducerade en klart koncentrationsberoende fluorescens av HEK 293-celler in situ (figur 7A). Utsätta dessa celler till en flödescytometrisk analys bekräftade den koncentrationsberoende märkningseffektiviteten. Frekvensen av Cy3 positiva celler ökade signifikant (mer än sju gånger) när den högsta koncentrationen av nanopartiklar anbringades (figur 7B). I ytterligare experiment ES-celler från Nkx2.5 hjärtförstärkare transgen mus linje 19 användes för att analysera uttrycket av pluripotens gener genom flödescytometri. Pilotförsök med 400 pM av den positiva upptag kontrollen gav tydligt Cy3 positiva levande ES-kolonier under mikroskop och flödescytometri upptäcks nästan 40% av Cy3 positiva celler (figur 7C). I motsats härtill jämförbara med obehandlade celler ca 0,1% av cellerna som behandlats med förvrängnings färgade positivt (data visas ej). På liknande tillsats av nanopartiklar som är specifika för GAPDH, NANOG och Gdf3 inducerade en distinkt fluorescenssignal i enskilda kolonier i cellodlingsskål. Frekvensen av Cy3-positiva celler för GAPDH såsom bestämt genom flödescytometri var jämförbar med den som ses för båda pluripotensbestämmande gener (figur 7C). Detta resultat är expect som Nanog och Gdf3 är också tänkt att uttryckas konstitutivt i pluripotenta ES-celler. Således är dessa uppgifter klart indiCate att celler som uttrycker en speciell gen kan identifieras genom flödescytometrisk analys, kvalitativt och genom deras relativa mängd.
Figur 1: Schematisk representation av strukturen av Nanopartiklar. (A) Struktur av en gen-specifik nanopartikel. (B) rusning nanopartikel (negativ kontroll). (C) Upptag nanopartikel (positiv kontroll). Anpassad från Lahm et al. 17 återges med tillstånd från Wiley.
Figur 2: Tillämpning av nanopartiklar till cellkulturer En korrekt utspädd lösning av nanopartiklar pipetteras helt enkelt i odlingsmediet.. Efter O / N inkubation genspecifika fluorescerande celler är synliga under af luorescent mikroskop.
Figur 3:. Aktivt upptag av nanopartiklar av celler via Endocytosis (A) Celler aktivt uppsluka nanopartiklar genom endocytos (B) Mål mRNA binder till infångnings strängen och förskjuter fluorescerande reporter..
Figur 4: Gating strategi för flödescytometri. (A) strategi för HEK 293-celler. (B) Strategi för murina ES-celler. Data förvärvades med hjälp av anordning 1 för HEK 293-celler eller anordning 2 för murina ES-celler och analyserades därefter med ett mjukvaruverktyg (se tabell of Materials).
/53268fig5.jpg "/>
Figur 5:. Analys av GAPDH -expression i HEK 293-celler En GAPDH -specifika nanopartikel sattes till cellerna vid 100 pM (slutlig koncentration) och fluorescens registrerades efter O / N inkubation (A) GAPDH -specifika nanopartikel (B.. ) rusning (negativ kontroll). (C) Upptagning (positiv kontroll). (D) Kinetik av rusning och upptag kontroll. Fluorescens bestämdes vid de angivna tidpunkter efter tillsats av GAPDH specifika nanopartiklar. Skalstrecken representerar 50 iM.
Figur 6:. Analys av Pluripotens genuttryck i iPS-celler av olika arter Nanopartiklar specifik för NANOG eller GDF3 sattes till cellerna vid 400 pM (slutlig concentration) och fluorescens registrerades efter O / N inkubation. (A) Murin iPS-celler. (B) Human iPS-celler. (C) Svin iPS-celler. Pilar i (A) och (C) betecknar omärkt fibroblast feeder-skikt-celler. (D) Fluorescens i murina iPS-celler efter tillsats av NANOG-designen SF3 nanopartikel. Skalstrecken representerar 50 iM.
Figur 7: Nanoparticle Märkta levande celler kan identifieras genom flödescytometri. (A) Mikroskopisk vy av Cy3 positiva HEK 293-celler efter tillsats av olika koncentrationer av nanopartiklar. (B) Frekvens av Cy3-positiva celler bestäms genom flödescytometri. (C) Levande färgning av murina ES-cellkolonier och bestämning av frekvensen för Cy3 positiv celler. Nanopartiklar tillsattesvid en slutkoncentration av 400 pM. Skalstrecken representerar 50 iM.
Discussion
Föreliggande arbete beskriver användningen av fluorescensmärkta nanopartiklar som tillåter tillförlitlig utvärdering av intracellulär genuttryck direkt i levande celler från olika däggdjursarter med skiftande histogenetic ursprung under ett fluorescensmikroskop. Detta tillvägagångssätt har ett par fördelar jämfört med andra publicerade metoder. Först och främst forskaren är inte begränsad med avseende på antingen målgenen eller celltyp. Alla antikroppsbaserade detektionsmetoder är begränsade till en enda epitop. Även fluorescerande molekylära fyrar också kan utformas för ett brett spektrum av gener kräver denna metod dissociation av cellerna och efterföljande nucleofection 15. Däremot inte tillämpningen av genspecifika nanopartiklar inte kräver någon manipulation av målcellen som omger nanopartiklarna aktivt genom endocytos. Under efterföljande passage guldpartiklarna gradvis lämna cellerna och odlingen kan användas i downstream experiment.
Ändå också fortfarande har tekniken vissa begränsningar. Vissa markörer är uppenbarligen inte upptäckas på grund av deras kolhydrat natur, såsom SSEA-1 eller TRA-1-81 20. För närvarande finns ett stort utbud av nanopartiklar är kommersiellt tillgängliga. Dessa partiklar har förtestad för sin funktionalitet i cellulära experiment. Syftet med detta arbete var att utforma skräddarsydda prober som kan användas över arter gränser. När man följer ett sådant tillvägagångssätt eller när man utformar en sond för en ny målgen måste man vara medveten om att funktionaliteten hos en in silico förutspådde sond måste utvärderas noggrant in vitro. Den NANOG-SF3 sond som visade en 100% homologi med sekvenshomologin fungerade inte alls, medan NANOG-SF1 med en inkompatibla bas i murina och svin sekvens producerade en fin fluorescenssignal. En annan fråga avser ett effektivt upptag av nanopartiklarna. Partiklarna angercellerna genom endocytos, en process som påverkas av storleken av nanopartiklarna 21, till celltypen och differentieringsstatus 22 och den cellulära förmågan att utföra phago- och macropinocytosis 23. Den optimala koncentrationen för att erhålla en tillfredsställande fluorescenssignal måste testas för varje enskild applikation eller cellinje. För detta ändamål bör det första experimentet alltid tillämpningen av upptagningskontroll för att utvärdera kompatibiliteten av sonderna inom de celltyper och odlingsbetingelser innan man går vidare till mål-specifik detektion av genuttryck.
En kritisk punkt för att få tillförlitliga resultat vid tillämpningen av detta protokoll till en ny cellinje eller cellpopulation är införandet av riktiga kontroller. Den ständigt fluorescerande upptaget kontroll kommer att ge en ledtråd där koncentrationen av nanopartiklar kommer att inducera en tillräckligt fluorescerande signal i målcellspopulationen. Fluorescensen måste utvärderad nästa dag som signalen kommer att blekna med tiden 17. Samtidigt förvrängningskontrollen utan en motsvarighet i den eukaryota genomet appliceras i en identisk koncentration måste framkalla en försumbar bakgrundssignal. Som en tredje styr är det tillrådligt att använda en nanopartikel som är specifik för en housekeeping-gen (t.ex. GAPDH, β-aktin). Dessa nanopartiklar tjänar som en positiv kontroll att tillvägagångssättet kan användas för att detektera specifika genuttryck i den valda målcellspopulationen. Om dessa kontroller visar sig tillfredsställande man kan förvänta sig att få tillförlitliga specifika fluorescerande signaler med hjälp av nanopartiklar som är specifika för andra målgener. Koncentrationen av de applicerade nanopartiklar kan också vara kritisk eftersom de har visat sig nedreglera målsekvensen 24. Emellertid kräver denna effekt mycket högre koncentrationer (5 nM) än de koncentrationer som används i experimenten som presenteras här (400 pM). Vid denna koncentration den nanoflares påverkar inte målgen-mRNA eller proteinnivåer och koncentrationer så höga som 2 nM inte försämrar spridningen av HEK293 och murina ES-celler 17. Dessutom hade en hela genomet uttrycksanalys inte avslöja några betydande förändringar i genuttryck 25. Därför i koncentrationer upp till 1 nM de nanoflares inte uppvisar några viktiga biverkningar.
En mycket lovande tillämpning av denna teknologi är möjligheten att märka varje given cellpopulation vilket markeras med en specifik gen. Nyligen har genspecifika nanopartiklar framgångsrikt använts för att selektivt färga levande ventrikulära myocyter 26, subpopulationer av melanomceller 27, monocyter 28 och cerebellär cellkulturer 29. Sådana fluorescens-märkt cellpopulationer kan sorteras och renas genom flödescytometri som levande celler. Inom området för onkologi är det tänkbart att isolera levande metastatiska tumörceller i djurmodellerbaserat på deras uttryck av CEA, mest värdefulla för sökning av potentiella metastaser främja gener eller målstrukturer. Vi har nyligen visat att verkligen omprogrammerade murina iPS kolonier kan identifieras in situ med nanog -specifika nanopartiklar baserade på den detekterade fluorescensintensiteten 17. Därför kan identifieringen av verkligt omprogrammerade iPS kolonierna utföras på hög genomströmning plattformar, som använder robotfluorescensdetektering och plocka anordningar för att identifiera de mest lovande kolonierna. Denna teknik verkar vara lämpliga i många forskningsområden att välja specifika cellulära subpopulationer och det verkar möjligt att tillämpa nanopartiklar i hög genomströmning plattformar. Sammanfattningsvis utgör detta protokoll en ny metod med hjälp av fluorescens märkta nanopartiklar som möjliggör detektion av intracellulära genuttryck direkt i levande celler. Denna teknik kan vara ett värdefullt verktyg för att rena, expandera och ytterligare teckenize sällsynta cellulära subpopulationer i många forskningsområden.
Disclosures
HL har fått nanopartiklar från EMD Millipore Corporation gratis. Alla andra författare har inget att lämna ut.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/Ham's F12 medium with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG4815 | |
| Fetal calf serum | Life Technologies | SV30160.03 | |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Millipore | A2213 | |
| Sodium pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-039 | |
| DMEM high glucose with stable glutamine | Biochrome GmbH | FG0435 | |
| Mitomycin C | Roche | 10 107 409 001 | prevents cell division of MEFs |
| MEM non-essential amino acids (100x) | Life Technologies | 11140-050 | |
| b-Mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| Leukemia inhibitory factor (107 U/ml) | Millipore | ESG1107 | growth factor for murine ES and iPS cells, prevents differentiation |
| 0.25% Trypsin/EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-056 | detaches adherent cell cultures |
| Knockout serum | Invitrogen | 10828-028 | supplement for human and porcine iPS cell culture |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | growth factor for human and porcine iPS cells |
| Collagenase IV | Worthington | LS004188 | dissociation of pig iPS cells |
| Matrigel | Corning | 354277 | effective surface for feeder-free culture of human iPS cells, referred to as basement preparation membrane in the manuscript |
| E8 medium | Stem Cell Technologies | 05940 | defined medium for feeder-free culture of human iPS cells on Matrigel |
| EDTA 0.5 M | Invitrogen | 15575-038 | |
| SmartFlare Probes | EMD Millipore Corporation | customized item | detection of intracellular gene expression in live cells, referred to as nanoparticles in the manuscript |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 200M | |
| HeraCell 150i CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51026282 | |
| Gelatine (from porcine skin) | Sigma | G6144 | enhances attachment of MEFs to surface |
| Propidium iodide (1 mg/ml) | Sigma | P4864 | labels dead cells in flow cytometric analyses |
| BD FACS Aria Illu | Becton Dickinson | A4544 | referred to as device 1 in Figure 4 |
| Navios | Beckman Coulter | 775213 | referred to as device 2 in Figure 4 |
| FloJo vX 10.0.7r2 | Treestar | software for analysis of flow cytometry data |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Liu, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from adult rhesus monkey fibroblasts. Cell Stem Cell. 3 (6), 587-590 (2008).
- Liao, J., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from adult rat cells. Cell Stem Cell. 4 (1), 11-15 (2009).
- Luo, J., et al. Generation of leukemia inhibitory factor and basic fibroblast growth factor-dependent induced pluripotent stem cells from canine adult somatic cells. Stem Cells Dev. 20 (10), 1669-1678 (2011).
- Bao, L., et al. Reprogramming of ovine adult fibroblasts to pluripotency via drug-inducible expression of defined factors. Cell Res. 21 (4), 600-608 (2011).
- Esteban, M. A., et al. Generation of induced pluripotent stem cell lines from Tibetan miniature pig. J. Biol. Chem. 284 (26), 17634-17640 (2009).
- Nakagawa, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat. Biotechnol. 6 (1), 101-106 (2008).
- Maekawa, M., et al. Direct reprogramming of somatic cells is promoted by maternal transcription factor Glis1. Nature. 474 (7350), 225-229 (2011).
- Marti, M., et al.
- Wada, N., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human gingival fibroblasts and periodontal ligament fibroblasts. J. Periodontal Res. 46 (4), 438-447 (2011).
- Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
- Singh, U., et al. Novel alkaline phosphatase substrate for identification of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. Rep. 8 (3), 1021-1029 (2012).
- Kang, N. -Y., et al. Embryonic and induced pluripotent stem cell staining and sorting with the live-cell fluorescence imaging probe CDy1. Nat. Protoc. 6 (7), 1044-1052 (2011).
- Ban, K. B., et al. Purification of cardiomyocytes from differentiating pluripotent stem cells using molecular beacons targeting cardiomyocyte-specific mRNA. Circulation. 128 (17), 1897-1909 (2013).
- Seferos, D. S., Giljohann, D. A., Hill, H. D., Prigodich, A. E., Mirkin, C. A. Nano-flares: probes for transfection and mRNA detection in living cells. J. Am. Chem. Soc. 129 (50), 15477-15479 (2007).
- Lahm, H., et al. Live fluorescent RNA-based detection of pluripotency gene expression in embryonic and induced pluripotent cells of different species. Stem Cells. 33 (2), 392-402 (2015).
- Clark, A. T., et al. NANOG and GDF3 genes are expressed in pluripotent cells and map to chromosome 12p13, a hotspot for teratocarcinoma. Stem Cells. 22 (2), 169-179 (2004).
- Wu, S. M., et al. Developmental origin of a bipotential myocardial and smooth muscle cell precursor in the mammalian heart. Cell. 127 (6), 1137-1150 (2006).
- Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat. Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Yue, T., Zhang, X. Cooperative effect in receptor-mediated endocytosis of multiple nanoparticles. ACS Nano. 6 (4), 3196-3205 (2012).
- Andersson, L. I., Hellman, P., Eriksson, H. Receptor-mediated endocytosis of particles by peripheral dendritic cells. Hum. Immunol. 60 (10), 625-633 (2008).
- Weissleder, R., Nahrendorf, M., Pittet, M. J.
- Prigodich, A. E., Seferos, D. S., Massich, M. D., Giljohann, D. A., Lane, B. C., Mirkin, C. A. Nano-flares for mRNA regulation and detection. ACS Nano. 3 (8), (2009).
- Weldon, D., Williams, Y., Ko, A. Cell sorting based on RNA detection in living cells using SmartFlareTM RNA detection reagents.. , EMD Millipore Application Note. Available from: http://www.emdmillipore.com/ (2013).
- Mehta, A., et al. Re-trafficking of hERG reverses long QT syndrome 2 phenotype in human iPS-derived cardiomyocytes. Cardiovasc. Res. 102 (3), 497-506 (2014).
- Seftor, E. A., et al. Melanoma tumor cell heterogeneity: a molecular approach to study subpopulations expressing the embryonic morphogen Nodal. Sem. Oncol. 41 (2), 259-266 (2014).
- Khare, S., et al. The PYRIN domain-only protein POP3 inhibits ALR inflammasomes and regulates responses to infection with DNA virus. Nat. Immunol. 15 (4), 343-353 (2014).
- Kratz, A., et al. Digital expression profiling of the compartmentalized translatome of Purkinje neurons. Genome Res. 24 (8), 1396-1410 (2014).
