Introduction
Terwijl metalen biomaterialen zijn op grote schaal gebruikt als dragende implantaten en interne fixatie inrichtingen vanwege hun uitstekende mechanische sterkte en veerkracht, 1-3 zij betrekking twee kritische problemen: 1) mechanische mismatch omdat metalen zijn veel stijver dan biologische weefsels, wat ongewenste schade de omringende weefsels en 2) lage bioactiviteit die vaak resulteert in een slechte koppeling met biologische weefsels, vaak veroorzakend reacties van het lichaam (bijvoorbeeld een ontsteking of trombose). hebben 4-6 poreus metallisch steigers voorgesteld om botingroei te bevorderen in de structuren, verbeteren . bot-implantaat contact terwijl de spanning afscherming effecten onderdrukt vanwege hun verminderde stijfheid 7-9 Voorts dient het metaal wijzigingen zijn aangebracht om de biologische activiteiten van metalen implantaten te verbeteren; dergelijke modificaties omvatten coating het metaaloppervlak met bioactieve moleculen (bijvoorbeeld groei facren) of drugs (bijvoorbeeld vancomycine, tetracycline). 12/10 echter problemen zoals verminderde mechanische eigenschappen van poreuze metalen steigers, verminderde stijfheid en de snelle afgifte van de bioactieve coating lagen onopgelost blijven. 13-16
In het bijzonder titaan (Ti) en Ti legeringen zijn een van de meest populaire BioMetal systemen vanwege hun uitstekende mechanische eigenschappen, chemische stabiliteit en goede biocompatibiliteit. 13,17-19 hun schuim-vormig aanvragen trok ook toenemende belangstelling omdat het 3D poreuze netwerken voor botingroei naast botachtige mechanische eigenschappen. 20-22 zijn pogingen gedaan om de mechanische eigenschappen te verbeteren door de ontwikkeling van nieuwe fabricagetechnieken zoals replicatie polymere spons, sinteren van metaaldeeltjes, Rapid Prototyping (RP) methode, en space houder methode om de verschillende functies van de poriën regelen (bijvoorbeeld poriën fractievorm, grootte, distributie en connectivity) en materiaaleigenschappen (bv metallische fase en onzuiverheid). 23-25 Onlangs heeft de vries gieten van water gebaseerde metal drijfmest heeft opgedaan veel aandacht aan mechanisch versterkte Ti vormen met goed uitgelijnd poriën produceren structuren door gebruikmaking van de unidirectionele ijs dendriet groei tijdens het stollen; echter, zuurstof vervuiling door contact van metaalpoeders met water vereist speciale zorg aan de verbrossing van Ti scaffolds minimaliseren. 14,15
Daarom hebben we een nieuwe benadering fabriceren bioactieve en mechanisch afstembare poreuze Ti scaffolds ontwikkeld. 25 De steigers ligt aanvankelijk poreuze structuur met een porositeit van meer dan 50%. De gefabriceerde poreuze steigers werden bekleed met biologisch actieve moleculen en vervolgens gecomprimeerd met behulp van een mechanische pers waarin de uiteindelijke porositeit, mechanische eigenschappen en de geneesmiddelafgifte gedrag werden gecontroleerd door de toeed stam. De verdichte poreuze Ti implantaten aangetoond lage porositeit met goede sterkte ondanks de lage stijfheid vergelijkbaar met dat been (3-20 GPa). 2 vanwege de bekledingslaag, werd de biologische activiteit van de verdichte poreuze Ti aanzienlijk verbeterd. Bovendien, vanwege de unieke platte poriënstructuren geïnduceerd door de verdichtingswerkwijze, de beklede bioactieve moleculen werden gezien geleidelijk afgegeven uit het schavot behoud van hun werkzaamheid langdurig.
In deze studie hebben we onze gevestigde methode verdichte poreuze Ti draagstructuren voor potentieel gebruik in biomedische toepassingen fabriceren geïntroduceerd. Het protocol bevat dynamische bevriezing gieten met metalen slurry en verdichting van poreuze steigers. Ten eerste, poreuze draagstructuren Ti goede vervormbaarheid de dynamische freeze gietmethode ingevoerd zoals getoond in figuur 1A fabriceren. Ti poeder werd verspreid in vloeibare kamfeen; Vervolgens, door het verlagen van de temperatuur,de vloeibare fase werd gestold, waardoor de fasescheiding tussen de Ti poeder netwerk en vaste camfeen kristallen. Vervolgens werd de gestolde Ti-camfeen groenling gesinterd waarin Ti poeders werden gecondenseerd met doorlopende Ti stutten en de camfeen fase werd volledig verwijderd om een poreuze structuur te verkrijgen. De coating en verdichtingswerkwijze de verkregen poreuze draagstructuren werd toegepast, variëren van de mate van verdichting en beginporositeit. De bekledingslaag en afgiftegedrag gevisualiseerd en gekwantificeerd met het green fluorescent protein (GFP) gecoate poreuze Ti met en zonder verdichting in vergelijking met de GFP-beklede dichte Ti. Tenslotte functionele gradient Ti scaffolds die twee poreuze structuren voorgesteld en gedemonstreerd door het variëren van de mate van verdichting van de binnenste en buitenste delen van de poreuze steigers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabricage van poreus metaal Scaffolds
- Bereid Ti-camfeen slurries door mengen commercieel verkrijgbaar Ti poeder, kamfeen en KD-4 na afweging van de geschikte hoeveelheden van materialen zoals beschreven in tabel 1 van poreuze Ti steigers met vier initiële porositeiten (40, 50, 60 en 70). Giet de slurries in 500 ml polyethyleen (PE) flessen en draai de flessen bij 55 ° C gedurende 30 min in een kogelmolen oven bij 30 rpm.
- Giet de slurries van PE flessen tot cilindrische aluminium (Al) vormen met een diameter van 60 mm en een hoogte van 60 mm. Seal elk Al mal met de corresponderende Al dekglas en draai de mallen in een kogelmolen oven met een snelheid van 30 rpm bij 55 ° C gedurende 10 min.
- Vervolgens verminderen de temperatuur van de kogelmolen oven tot 44 ° C en continu roteren van de mallen met een snelheid van 30 rpm bij een constante temperatuur van 44 ° C gedurende 12 uur.
- Haal de mal van de bal-mill oven na bovendien roteren van de schimmels bij kamertemperatuur 1 uur voor het koelproces. Verwijder de gestolde titaan / kamfeen groene lichaam van Al mal met behulp van een Al zuiger.
- Plaats de gestolde titaan / kamfeen groene lichaam in een rubberen zak met de hand en volledig sluit de rubber zak door koppelverkoop de mond van de zak met een string. Plaats de rubberen zak in het waterreservoir van een koud isostatisch persen (CIP) machine en een isostatische druk van 200 MPa aanvragen 10 min. Verwijder de gecomprimeerde groene lichaam uit de rubber zak.
- Breng de Ti-kamfeen groene lichaam op een alumina smeltkroes met de hand en plaats de smeltkroes in de vriesdroger machine. Vriesdrogen de groenling het camfeen fase sublimeren in de groenling bij - 40 ° C gedurende 24 uur.
- Vervolgens sluit de kroes met een aluminiumoxide dekglas en plaats de gesloten kroes in een vacuum oven (beneden 10 -6 Torr) bij RT. Vervolgens verhoging van de temperatuur van de oven tot 1300 ° C bij een verwarmingssnelheid raten van 5 ° C / min en houd de temperatuur bij 1300 ° C gedurende 2 uur.
- Na de warmtebehandeling, houdt de gesinterde poreuze Ti in de oven voor 6-7 uur totdat de oven volledig is afgekoeld tot kamertemperatuur.
Opmerking: Bij 6 uur van het koelproces, de gemiddelde afkoelsnelheid van de oven boven 400 ° C ~ 15 ° C / min en de gemiddelde afkoelsnelheid van de oven onder 400 ° C ~ 2 ° C / min. - Eventueel snijden het blok gesinterde poreuze Ti tot schijfvormige monsters met een diameter van 16 mm door middel van elektrische ontlading (EDM). 27
Opmerking: Afhankelijk van de grootte van de Al matrijzen, de grootte van het gesinterde poreuze Ti moet worden gewijzigd door het bewerkingsproces (Figuur 2A). - Plaats een glazen beker met poreuze Ti monsters in een autoclaaf en steriliseer de monsters bij 121 ° C gedurende 15 min. Verwijder de monsters uit de autoclaaf. Was de poreuze Ti monsters met gedestilleerd water twee keer en vervolgens met 70% ethanol tweemaal.Tot slot laat de poreuze Ti in een petrischaal en lucht-drogen van de monsters bij kamertemperatuur op een schone bank onder UV-licht.
2. Dip Coating van Steigers met bioactieve stoffen
- Verdun de commerciële Groene Fluorescentie Eiwit (GFP) van 1 mg / ml tot 100 ug / ml in een schone werkbank door het mengen van 1 ml van GFP met 9 ml Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS, pH 7,4) oplossing in een 10 ml gesteriliseerd polystyreen (PS) buis zoals aangegeven in tabel 1.
- Dompel het gesteriliseerde dicht of poreus Ti in 10 ml verdunde GFP-oplossing (100 ug / ml) door het plaatsen van het Ti monsters in de PS buis met de GFP-oplossing bij kamertemperatuur en het op een schone werkbank.
- Plaats de PS buis in een vacuümexsiccator en evacueren exsiccator gedurende 10 min te zorgen GFP oplossing dringt door de poriën van het poreuze Ti effectiever.
- Verwijder de poreuze titaan van de PS buis met behulp van een pincet. Plaats het GFP-beklede poreuze Ti in een 10 cm diameter Petri gerecht en de lucht drogen O / N bij kamertemperatuur op een schone bank.
- Spoel de poreuze Ti tweemaal met 10 ml Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) in een bekerglas en zet de poreuze Ti in een 10 cm diameter petrischaal met een pincet en de lucht drogen bij kamertemperatuur op een schone bank.
3. verdichting van poreuze steigers
- Plaats het GFP-beklede poreuze Ti monsters met verschillende hoogtes in een cilindrische stalen matrijs, en plaatst een aantal stempels in de bovenste en onderste gaten van de stalen matrijs (Figuur 3A).
- Druk de poreuze Ti in de stalen matrijs samenstel bij kamertemperatuur in de z-richting van het monster (Figuur 3A) met een persmachine bij tussenliggende vervormingssnelheden van 0,05 ~ 0,1 sec -1 tegen de vooraf bepaalde toegepaste stammen weergegeven in tabel 2. Houd de druk gedurende 1 min voor het lossen.
- Verwijder de verdichte Ti monsters van de stalen matrijs. Was de verdichte monsters tweemaal met 10 ml van DPBSin een beker en de lucht drogen O / N bij kamertemperatuur op een schone bank.
4. Laat Test van GFP-gecoate steigers
- Dompel drie typen monsters (GFP-beklede dichte Ti (na stap 2), GFP-gecoate poreuze Ti (na stap 1 en 2) en GFP-beklede verdichte poreuze Ti (na stap 1-3)) in 5 ml DPBS (pH 7,4) oplossing in een 10 ml gesteriliseerd PS buis bij 37 ° C op een schone werkbank.
- Zuig alle DPBS oplossing uit elke PS buis met de GFP beklede monster en vullen met een nieuwe 5 ml DPBS (pH 7,4) met een pipet volgens de vooraf bepaalde tijd van 1, 2, 3, 5, 8, 12, 15, 22 en 29 dagen na onderdompeling.
- Neem de fluorescentiebeelden van het GFP-beklede monsters voor de onderdompeling (dag 0) en na 22 dagen onderdompeling met behulp van confocale laser scanning spectroscopie (CLSM).
- Meet het fluorescentiesignaal intensiteit van de afgegeven GFP in 1 ml oplossing uit een totaal van 5 ml DPBS oplossing Van iedere PS buis in rubriek 4,2 behulpUV-spectroscopie bij een golflengte van 215 nm. Zet de intensiteitswaarde in de concentratie van het GFP-oplossing met de standaard curve.
Opmerking: Voor de meting, trek de standaardcurve van GFP oplossing door meting van het fluorescentiesignaal intensiteit van het GFP-oplossing in het concentratiebereik van 0 ng / ml - 10 ug / ml.
5. Fabricage van Graded poreuze Ti Steigers
- Produceren een blok van de gesinterde poreuze Ti door het herhalen van stap 1,1 tot 1,7 stap.
- Machine het gesinterde poreuze Ti blok overeenkomstig de vooraf bepaalde structuur ontwerpen (bijvoorbeeld figuur 5a en 5d) van EDM.
- Plaats de bewerkte Ti monsters met een hoogte verdeling in een stalen matrijs indien de diameter van poreuze Ti ~ 0,1 mm kleiner dan de diameter van de matrijs en plaats een aantal stempels in de bovenste en onderste gaten van de stalen matrijs.
- Voer stap 3.2 en 3.3.
6. porositeit Measurement van Ti Scaffolds
- Meet de massa (m s) van Ti steigers.
- Bereken de schijnbare volume (Vs) van lengtemeting, breedte en hoogte van Ti steigers.
- Bereken de porositeit met de volgende formule:
waarbij P de totale porositeit percentage ρ Ti is de theoretische dichtheid van het titaan en m S / V S de gemeten dichtheid van het monster.
Opmerking: De porositeit van Ti monsters direct opgehaald uit microCT beelden na microCT beeldvorming wordt uitgevoerd met een micro-computed tomography scanner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het fabricageproces gebruikt om poreuze draagstructuren Ti produceren is geïllustreerd in figuur 1A. Ti poeder wordt gehouden verspreid homogeen in kamfeen door continue rotatie van de container bij 44 ° C gedurende 12 uur en, terwijl de vloeibare kamfeen volledig is gestold, kan elke sedimenten van relatief zwaar Ti poeder worden geminimaliseerd. Als resultaat werd de homogene Ti-camfeen groenling geproduceerd volgens de dynamische freeze gietproces zoals getoond in figuur 1B, waarbij 3-dimensioneel verbonden camfeen grote poriën worden omringd door de Ti poederfase (figuur 1C). De verkeerde draairichting van de containers vaak tot inhomogene Ti en camfeen fasen in het groene lichaam, waardoor vervorming of scheuren van de poreuze scaffold volgende warmtebehandeling. De optimale conditie van de rotatiesnelheid bleek 30 rpm, die in staat zijn een homogene groene massa te produceren in de meeste gevallen was zijn. Alvorens te gaaning met hittebehandeling, wordt de uitgebreide groei van kamfeen bevestigd door het observeren van de doorsnede van de Ti-camfeen groenling zoals getoond in figuur 1C. Als de kamfeen fase discontinu met een significante grootteverdeling van de poriën, de temperatuur en tijd van de dynamische freeze casting moet worden gereset. Kenmerkend de camfeen fase van het Ti-camfeen groene lichamen bleek goed worden ontwikkeld na 12 uur dynamisch freeze casting, waarbij de camfeen fase werd continu omdat grote bolvormige poriën zijn in contact met elkaar. De grootte, morfologie en connectiviteit van poriën in poreuze Ti werden verder onderzocht met behulp van micro-CT analyse na warmtebehandeling.
Na sinteren bij 1300 ° C, worden de poreuze Ti blokken in meerdere cilindervormige monsters gesneden door vonkverspaning (Figuur 2A). De verkregen cilindrische monsters geen scheuren of gebreken vertonen. Representatieve micro-CT-beelden van de porous Ti steigers vervaardigd met gebruikelijke (boven) en dynamische vries gieten (onder) zijn weergegeven in figuur 2B. De poriënstructuur van Ti monsters van de conventionele freeze casting toont directionele poriën aanpassing aan onregelmatig gevormde poriën door de dendritische groei van camfeen tijdens het vriezen. Anderzijds, het monster van dynamische freeze casting vertoont nagenoeg bolvormige poriën met willekeurige porieverdeling. Hoe groter resolutie microscopische beelden van de poreuze Ti scaffolds met verschillende porositeiten (beginporositeit (IP) = 50, 60 en 70 vol%) duidelijk bolvormige poriën willekeurig verspreid in het Ti-netwerk (figuur 2C). De poriegrootte van de poreuze draagstructuren Ti af als het volume van kamfeen afgenomen.
Vervolgens worden de vervaardigde poreuze draagstructuren Ti gecoat met biomoleculen en verdicht in de mal door het variëren van de aangebrachte spanning zoals getoond in figuur 3A. Voor het visualization van de bioactieve coating op het Ti monsters, groen fluorescent eiwit (GFP) werd gebruikt in deze studie. De aangebrachte spanning (ε zz), die overeenkomt met de druk (P zz), blijkt de mate van verdichting variëren zoals getoond in figuur 3B. De porievorm wordt afgevlakt als de mate van verdichting toeneemt en, als gevolg, de hoogste verdichting poriën nagenoeg verdwijnen door aangrenzende poriën in contact met elkaar. Echter, uit onze eerdere studie hebben we bevestigd dat de poriën kanalen van de verdichte monsters nog open, met vrijwel dezelfde oppervlakte als die van het poreuze Ti van dezelfde porositeit. 25 De verdichte monsters met verschillende uitgangsposities porositeiten evalueren de z-hoogte verschilt afhankelijk van de initiële porositeit zodat het verdichte monster dezelfde uiteindelijke porositeit. Tabel 2 geeft eveneens de voorspelde spanningen toegepast op de beoogde uiteindelijke p vindenorosity (FP) van de verdichte poreuze steigers met verschillende initiële porositeiten. Om bijvoorbeeld de verdichte poreuze specimens met FP = 5%, de poreuze scaffold met IP = 70% vereist een rek van ongeveer 0,7, terwijl de steiger met IP = 50% heeft het ongeveer 0,5. Daarom werden de initiële hoogte van de poreuze draagstructuren zorgvuldig berekend volgens de beginporositeit om monsters te verkrijgen met dezelfde eindlengte na verdichting. Zoals getoond in figuur 3C, vier monsters met verschillende porositeiten van IP = 40% tot 70% tonen verschillende hoogtes voor initiële verdichting en dan aan het einde, met bijna identieke hoogte van 2 mm.
GFP werd gebruikt voor de bekledingslaag op poreuze (IP = 70%) en verdichte poreuze Ti (IP = 70%, FP = 7%) monsters vergeleken met commerciële dichte Ti zie figuur 4A visualiseren. Alle drie monsters het gecoate oppervlak morfologie duidelijk weer te geven dat overeenstemt met deMER microstructuren. De volledig dichte Ti oppervlak is volledig bedekt met een groene coating, terwijl poreus en verdicht poreuze monsters groen gekleurde Ti veerpoten met duidelijke poriën. Met deze drie beklede monsters getoond in figuur 4A werd het afgiftegedrag waargenomen (Figuur 4B). De hoeveelheid afgegeven GFP van elk monster werd uitgedrukt als het gemiddelde ± standaardafwijking (n = 3) en werd berekend tot één maand door meting van de intensiteit van fluorescentie. Zowel dichte en poreuze Ti bleken snel GFP afgiftegedrag met de eerste barsten effect te hebben, met de meeste vrijgegeven binnen een week. Echter, verdichte poreuze Ti toont continue afgifte tot één maand, waarop duidelijk GFP op het oppervlak, zelfs na één maand (CLSM afbeeldingen Figuur 4B).
De verdichting werkwijze kan ook worden toegepast op de vervaardiging van functionele gradient poreuze draagstructuren Ti zoals geïntroduceerd in figuur 5. De twee pottiële ontwerp schema gradiënt structuren werden gekozen, waarvan de binnen- en buitenlagen van een cilindrische scaffold verschillende porositeiten. Voor de constructie van een dichtere kern getoond in figuur 5A, is het buitenste deel van het Ti steiger verkort door mechanische bewerking zoals getoond in figuur 5B. Na selectief verdichten van de hogere binnendeel, werd het verloop constructie verkregen. De gedetailleerde structurele informatie van de figuren 5Bb en 5E gemeten door micro CT wordt in Tabel 3 De micro CT beeld van Figuur 5C toont duidelijk de binnenste en buitenste delen van de steiger met verschillende porositeiten (binnenkant. FP = ~ 60%, buiten: FP = ~ 70%). Als alternatief kan een structuur met dichtere buitenlaag worden geproduceerd door het veranderen van het hoogteverschil tussen de binnenste en buitenste delen (Figuur 5D). De poreuze Ti met de hogere en lagere buitenste binnendelen resulteert in een dichtere outer gedeelte na verdichting (Figuur 5E), waarbij de porositeit van het buitendeel verlaagd tot ~ 45%, waarbij het binnenste deel met de bewaarde beginporositeit (IP = 70%) zoals weergegeven in figuur 5F.
Figuur 1. Fabricage van Ti-kamfeen groen lichaam door dynamische freeze casting. (A) Schematische weergave van het dynamische bevriezing behuizing procedure voor de verzameling vast Ti-camfeen groenling vóór de warmtebehandeling (Aangepast met toestemming van Elsevier, Jung et al., 2013). (B) optische afbeelding van een representatief Ti-camfeen groenling na de voltooiing van de dynamische freeze gietproces. (C) beeld in dwarsdoorsnede van de Ti-camfeen groenling waarin de vaste fase camfeen willekeurig verdeeld binnen het continue Ti poeder phase. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. poreuze Ti steigers met diverse initiële porositeit na warmtebehandeling. (A) Optische beelden van een volledig gesinterde poreuze Ti blok voor en na bewerking en een verkregen cilindrische poreuze Ti steiger van bewerking. (B) Sectional micro-CT-beelden van de poreuze Ti steigers vervaardigd door gebruikelijke vries gieten (boven) en dynamische vries gieten (onder). Gele pijlen op de bovenkant van Figuur 2B geven de porie aanpassing in de radiale richting. (C) dwarsdoorsnedebeelden van het poreuze Ti steigers vervaardigd door dynamische bevriezen gieten met de initiële porositeit (IP) van 70% (boven), 60%(midden) en 50% (onder), waar inzetstukken zijn de optische afbeeldingen van de overeenkomstige poreuze Ti steigers (Aangepast met toestemming van Elsevier, Jung et al., 2013). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Dip-coating en verdichting van poreuze Ti steigers. (A) Schematische weergave van het fabricageproces van een verdichte poreuze metalen steiger (Ti) gecoat met biomoleculen (bv GFP) (Aangepast met toestemming van Elsevier, Jung et al. , 2015). (B) Doorsnede beelden van de verdichte poreuze Ti scaffolds (IP = 70%) bij de toegepaste stam (ε zz) = 0, 0,53, 0,63, 0,68, resulterend in de uiteindelijke porositeit (FP = 70, 33, 19, 7%). (C Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. In vitro afgiftegedrag van GFP-beladen verdichte poreuze draagstructuren Ti. (A) Origineel CLSM afbeeldingen GFP geladen op het oppervlak van dichte, poreuze en verdicht Ti steigers. (B) Cumulatieve hoeveelheden GFP afgegeven uit dichte, poreuze en verdicht Ti steigers tot 29 dagen (n = 3) met de CLSM afbeeldingen van deze drie monsters na onderdompeling in PBS gedurende 24 dagen (schaal bar = 200 pm). Standaarddeviatie (SD) is onsed voor de beschrijvende fout bar van elk meetpunt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Fabricage van functioneel ingedeeld poreuze metalen steigers. (A) Schematische weergave van een gesorteerde poreuze scaffold design met een dichtere binnenste deel. (B) Graded poreuze Ti schavot met de dichtere binnenste deel vervaardigd door middel van verdichting. Micro-CT beeld van gesorteerde poreuze Ti steiger (C) 2-D gereconstrueerd met de dichtere binnenste gedeelte. (D) Schematische voorstelling van een steiger ontwerp met gradiënt porositeit met de dichtere buitenste deel. (E) Graded poreuze Ti schavot met de dichtere buitenste deel vervaardigd door middel van verdichting waarin de steiger heeft een poreuze interne kernomringd door de verdichte buitenlaag. Micro-CT beeld van gesorteerde poreuze Ti schavot met de dichtere buitenste deel (F) 2-D gereconstrueerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Doelmonster | Ti-kamfeen slurry | Coating oplossing | |||
| Ti poeder (g) | Kamfeen (g) | KD-4 (g) | GFP (ml) | PBS (ml) | |
| Ti scaffold IP = 40% | 204,3 | 90 | 0,294 | 1 | 9 |
| Ti scaffold IP = 50% | 171,4 | 97 </ td> | 0,268 | ||
| Ti scaffold IP = 60% | 136,5 | 103 | 0,239 | ||
| Ti scaffold IP = 70% | 100 | 110 | 0.21 | ||
Tabel 1. Gedetailleerde informatie van Ti-kamfeen slurry en bekledingsoplossing voor de fabricage van target Ti poreuze draagstructuren (IP = 40, 50, 60, 70%) bekleed met GFP. (IP staat voor beginporositeit).
| Initial porositeit (%) | Final porositeit (%) | ||||||
| 60 | 50 | 40 | 30 | 20 | 10 | 5 | |
| 50 | 0.17 | 0.29 | 0.38 | 0.44 | 0.47 | ||
| 60 | 0.20 | 0,33 | 0.43 | 0.50 | 0.56 | 0.58 | |
| 70 | 0.25 | 0.40 | 0.50 | 0.57 | 0.63 | 0.67 | 0.68 |
Tabel 2. Voorspelde aangebrachte spanning (ε zz) poreuze draagstructuren (IP = 50, 60, 70%) in termen van het beoogde uiteindelijke porositeit (FP) met behulp van de vergelijking, FP = 1 - (1- IP) / (1- ε zz).
| Specimen | Voordat verdichting | Na verdichting | |||||
| Hoogte (mm) | Porositeit (%) | Poriegrootte (pm) | Hoogte (mm) | Porositeit (%) | Poriegrootte (pm) | ||
| Binnenste deel | 18 ± 1 | 70 ± 1 | 370 ± 100 | 13 ± 1 | 57 ± 5 | 285 ± 100 | |
| Buitenste deel | 14 ± 1 | 70 ± 5 | 365 ± 110 | ||||
| Graded steiger van Fig. 5e | Binnenste deel | 14 ± 2 | 12 ± 1 | 70 ± 8 | 315 ± 110 | ||
| Buitenste deel | 18 ± 1 | 45 ± 8 | 230 ± 80 | ||||
Tabel 3. Structurele gegevens van de binnenste en buitenste delen gesorteerde poreuze draagstructuren (figuur 5B en figuur 5E) voor en na verdichting in termen van de z-hoogte, porositeit en gemiddelde poriegrootte gemeten met micro-CT.
| Beginporositeit poreuze Ti (%) | Voordat verdichting | Na verdichting (FP = 5%) | ||
| Stijfheid (GPa) | Rekgrens (MPa) | Stijfheid (GPa) | Rekgrens (MPa) | |
| 50 | 19 | 143 | 44 | > 370 |
| 60 | 13 | 130 | 42 | > 370 |
| 70 | 5 | 58 | 35 | > 370 |
Tabel 4. Stijfheid en vloeisterkte van Ti poreuze draagstructuren (IP = 50, 60, 70%) voor en na verdichting (Aangepast met toestemming van Elsevier, Jung et al., 2015).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Terwijl BioMetal systemen zijn op grote schaal gebruikt voor biomedische toepassingen, met name als dragende materialen, hoge stijfheid en lage bioactiviteit van metalen werden beschouwd als belangrijke uitdagingen. In deze studie hebben we de fabricagemethode van een nieuwe metalen systeem, een verdichte poreuze metalen scaffold die biomimetische mechanische eigenschappen alsmede bioactieve oppervlak duurzaam gedrag release. De belangrijkste voordelen van onze fabricage werkwijze omvatten 1) geen verandering in de vorige dynamische bevriezing gietmethode die we reeds ontwikkelde, 28 2) controle van een parameter-verdichting naar zowel de mechanische verbetering en duurzaam gedrag afgifte van biomoleculen uit poreuze bereiken metalen steigers en 3) mogelijke toepassing functioneel gradiënt materialen.
Een van de kritische stappen die nodig zijn om de verdichte poreuze metaal te produceren is het vervaardigen van poreuze Ti, die twee belangrijke featu bezitres: 1) taaiheid aan de afgiftesnelheid van biologisch actieve moleculen en de mechanische eigenschappen te controleren en 2) grote porie interconnectiviteit laden en laat biomoleculen. Echter, eerder beschreven poreuze titaan draagstructuren geproduceerd met de ruimte houder werkwijze spons sjabloon methode en poedermetallurgie toonden ofwel beperkt porie interconnectiviteit of taaiheid. 14,24,29 Vooral de verontreinigingen door de reactie van metaalpoeders met omliggende materialen tijdens de warmtebehandeling is bekend dat de taaiheid van het materiaal aanzienlijk verminderen omdat metaalpoeders in contact met het tweede materiaal (bijv ruimte houder of polymeer mal), wat resulteert in brosse breuk onder mechanische testen. Aldus 14,24,29 om verdichte poreuze metaal te fabriceren moeten de onzuiverheden geminimaliseerd worden voor de meeste traditionele fabricagemethoden. Om deze complicatie te voorkomen, onderzochten we de poreuze morfologie en mechanische o gedragf poreuze titaan draagstructuren vervaardigd met behulp van de bevriezing gietmethode met camfeen om de interactie tussen metaal poeders en vloeibare fase te minimaliseren. 26,28,30-33
Een nadeel van de conventionele bevriezing casting werkwijze is dat deze vaak resulteert in gerichte poriën kanalen (bovenste afbeelding figuur 2B). Anderzijds, dynamische freeze casting, de porievorm en grootte bleken uniformer dan die van de conventionele bevriezing gieten en de porieverdeling in de scaffold bijna willekeurig zijn. . Deze structurele kenmerken van poreuze steigers van dynamische freeze casting-show isotroop mechanisch gedrag, waardoor verdichting in een afgesloten mal onder éénassige druk 26,28 Tijdens dynamische freeze casting, twee belangrijke gebeurtenissen binnen de metalen slurry: 1) kristalgroei van kamfeen fase en 2) herverdeling van metaal poeders en gestold kamfeen binnen de resterende vloeibare fase vermijden sedimentation. Zwaartekracht zorgt ervoor dat de metalen poeders te scheiden tot de vloeistof kamfeen volledig is gestold. De continue draaiing van de suspensie nabij de smelttemperatuur van kamfeen geeft voldoende tijd voor sferische camfeen kristallen homogeen groeien, waardoor de willekeurige en gelijkmatige verdeling van Ti poeders en camfeen kristallen zoals getoond in figuur 1C.
Na het afkoelen volledig gestold Ti-camfeen bifasische groenling (Figuur 1B) werd verkregen. Om de camfeen van het gestolde groenling volledig te verwijderen zonder de structuur instorten, camfeen werd gesublimeerd in een vacuümexsiccator bij -20 ° C. Na verwijdering van de camfeen fase de groenling werd poreuze, uit slechts Ti poeder. Aangezien er geen interactie tussen deeltjes Ti, de Ti poreuze groene lichaam is kwetsbaar, zodat zorgvuldige hantering noodzakelijk. Om een directe behandeling van de groene lichaam te vermijden met de handen voor warmtebehandelingment, een keramische kroes werd gekozen voor de houder van de groenling voor vriesdrogen en sinteren. De houder met het groene lichaam werd in een vacuümoven geplaatst direct na het vriesdrogen en de warmtebehandeling bij 1300 ° C, waardoor de groenling volledig verdichte zonder significante gebreken in de metalen stutten zijn. Voor de evaluatie van de monsters, werden poreuze Ti blokken gesneden in kleinere poreuze Ti cilinders vanwege de geometrie en grootte van het poreuze monsters identiek (figuur 2A) moet zijn. Alle exemplaren werden met succes bewerkt zonder noemenswaardige gebreken (Figuren 2B en 2C). Afhankelijk van de hoeveelheid Ti stroom in de slurry, Ti scaffolds met verschillende porositeiten werden verkregen met bolvormen en willekeurig verdeelde poriën (Figuur 2C).
Nadat de poreuze Ti scaffolds werden verkregen volgens de dynamische freeze gietmethode zoals beschreven in onze vorige stuDY, 28 werden de biomoleculen op het oppervlak Ti en verdichting van beklede poreuze Ti beklede werd uitgevoerd zoals getoond in figuur 3A. Om eventuele besmetting of denaturatie van de biomoleculen te vermijden, werd de coating proces uitgevoerd op een schone bank bij RT binnen 24 uur na de poreuze steigers werden geautoclaveerd en zorgvuldig schoongemaakt. Om verlies van de beklede biomoleculen voor verdichting te minimaliseren, werd het reinigingsproces geminimaliseerd nadat het bekledingsproces werd uitgevoerd. Het verdichten werkwijze werd gecontroleerd door de toegepaste vervorming van de poreuze Ti monsters in de z-richting, omgezet in stam ε zz. 26 Afhankelijk van de initiële porositeit van de Ti steigers, de aangebrachte spanning en de bijbehorende uiteindelijke porositeit werden gevarieerd (tabel 2 ). Om de verdichte poreuze draagstructuren met verschillende porositeiten initiële ervoor hadden identieke uiteindelijke geometrie en afmetingen van de aangebrachte spanning van de individual steigers werd berekend en de totale monsterhoogte (lengte in z-richting) van elk monster werd vervolgens voorspeld voordat verdichten. Figuur 3D toont dat verschillende hoogten afzonderlijke poreuze monsters met variërende porositeit kan leiden tot de verdichte poreuze monster met identieke eindlengte op Hetzelfde uiteindelijke porositeit.
Door het regelen van de mate van verdichting, de verdichte poreuze draagstructuren hebben unieke mechanische eigenschappen bij langdurige afgifte van de gecoate biomoleculen. De toegepaste druk verandert twee belangrijke parameters van de poreuze Ti steigers: uiteindelijke porositeit en poriegrootte. De poreuze steigers met een lagere porositeit tonen hogere stijfheid en sterkte. Onze eerdere studie die de spanning-rek gedrag van verdichte poreuze scaffolds met verbeterde sterkte in vergelijking met poreuze Ti (Tabel 4) eveneens aanzienlijk verminderd stijfheid in vergelijking met commerciële dichte Ti. 26 In deze studie hebben we ook waargenomen the afgiftegedrag van verdichte poreuze Ti opzichte van zowel dichte en poreuze Ti door middel gevisualiseerd detectie van het GFP-bekledingslaag zoals weergegeven in figuur 4. De resultaten waren in overeenstemming met onze eerdere studie, 26 waarbij de verdichte poreuze draagstructuren bezitten aanzienlijk verbeterd afgiftegedrag gecoate materialen, het verlengen van de release tijd van maximaal vier maanden als gevolg van verhoogde torturosity van de steigers met een verminderde poriën. De huidige 30 dagen afgifte test laat duidelijk de resterende GFP op het oppervlak van de verdichte poreuze Ti in tegenstelling tot geen GFP restant aan beide dicht of poreus Ti oppervlakken.
Tenslotte werd de verdichting werkwijze voor het produceren van functionele gradient poreuze draagstructuren waarin de binnenste en buitenste delen verschillende porositeiten. Voor de cilindrische schavot differentiatie van de z-hoogte van de binnenste en buitenste delen kan gemakkelijk leiden tot poreuze draagstructuren ingedeeld zoals weergegeven in figuur 5. De aangebrachte spanning (ε zz) aan de binnenkant van de poreuze Ti scaffold figuur 5B was ~ 0,27, wat resulteerde in de uiteindelijke porositeit van ~ 57%, terwijl er geen spanning aangebracht op de buitenkant. Anderzijds, de aangebrachte spanning (ε zz) op het buitendeel van de poreuze Ti scaffold in figuur 5B was ~ 0,33, wat resulteerde in de uiteindelijke porositeit van ~ 45%, terwijl het binnenste deel was vrijwel intact behoud van de initiële porositeit (Tabel 3). Echter, twee grote uitdagingen voor de graded poreuze steigers werden waargenomen van dit experiment. Ten eerste, de continue binnenste en buitenste delen geïnduceerde inconsistent stress en spanning verdeling binnen het schavot; dus de verdichting inhomogeen plaatsgevonden, waarbij de gebieden rond de boven- en ondervlakken zijn dichter dan die rond het binnenoppervlak. Deze tendens was kritisch als het hoogteverschil van de twee delen toe. Bovendien is de gesorteerde poroons steiger met de dichtere binnenste deel was moeilijker te produceren dan het skelet van de dichtere buitendeel omdat de verdichting van het binnendeel worden uitgevoerd, wordt opgesloten met de buitenkant, waardoor homogene vervorming binnen de twee delen. Om de inhomogene verdichting van de gesorteerde scaffold lossen, ontwikkelden we twee afzonderlijke delen die tijdens de verdichtingswerkwijze kan worden gemonteerd. Hoewel in dit document, de optimale conditie voor de perfect gefabriceerde gesorteerde poreuze structuur te produceren is nog niet volledig gevonden, werd het potentieel van de verdichting werkwijze voor de bereiding van de gegradeerde structuur goed bevestigd. De geoptimaliseerde fabricagemethode van de gesorteerde poreuze structuur aan de gang, en verder werken, zal selectieve geneesmiddelbelading de gegradeerde structuur onderzocht voor de functionele afgiftegedrag van de steiger.
De voordelen van de voorgestelde aanpak in deze studie omvatten 1) betere mechanical compatibiliteit met biologische weefsels met een goede sterkte en 2) verlengd bioactiviteit betere biologische prestatie. Een van de belangrijkste nadelen is de gereduceerde poriegrootte die geen ingroei van bot kan bevorderen door het poriënnetwerk metalen scaffolds voor een betere bot-implantaat interface. Om dit probleem gesorteerde poriestructuren zijn voorgesteld, waarbij de poreuze en dichte delen samengaan op te lossen; dus de poreuze delen kan botingroei, terwijl de dichte delen mechanische stabiliteit en langdurige biologische activiteit. Daarom zal functioneel ingedeeld Ti implantaten via verschillende structurele ontwerpen worden vervaardigd en getest, in het bijzonder, gericht op de verbetering van het vermogen van het bot integratie. Bovendien moet een beperking van de productie van implantaten met ingewikkelde geometrie. Om een complex gevormde implantaat (bijv femorale kegel augment) te verkrijgen, is de additionele bewerking vereist na verdichting, instelling twee grote nadelen ophet eindproduct: inefficiënt en oneconomisch materiaalverbruik vanwege de aanzienlijke hoeveelheid poreus Ti blok vaak verwijderd tijdens het proces en mogelijke verontreiniging en verlies van beklede biomoleculen gedurende het bewerkingsproces. Verbetering van het fabricageproces van de poreuze Ti scaffolds met complexe geometrie is gaande. De verdichte poreuze metalen draagstructuren kunnen worden toegepast op verschillende orthopedische toepassingen zoals kunstmatige schijf vervangende vervangen hetzij bulk of poreuze metalen implantaten, en als een draagplatform en een geneesmiddeldrager.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Titanium powder | Alfa Aesar | #42624 | -325 mesh, 99.5% (metals basis) |
| Camphene | SigmaAldrich | #456055 | 95%, C10H16 |
| KD-4 | Croda | | Hypermer, polymeric dispersant |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Welgene | ML 008-01 | |
| Green Fluorescent Protein (GFP) | Genoss Co. | - | >98% purity, 1 mg/ml |
| Ball mill oven | SAMHENUG ENERGY | SH-BDO150 | |
| Freeze dryer | Ilshin Lab. | PVTFD50A | |
| Cold isostatic pressing (CIP) machine | SONGWON SYSTEMS | CIP 42260 | |
| Vaccum furnace | JEONG MIN INDUSTRIAL | JM-HP20 | |
| electical chaege machine | FANUC robocut | 0iB | External use |
| Press machine | CG&S | AJP-200 | |
| Confocal laser scanning spectroscopy (CLSM) | Olympus | FluoView FV1000 | External use |
References
- Long, M., Rack, H. Titanium alloys in total joint replacement-a materials science perspective. Biomaterials. 19 (18), 1621-1639 (1998).
- Niinomi, M. Recent metallic materials for biomedical applications. Metall. Mater. Trans. A. 33 (3), 477-486 (2002).
- Frosch, K. H., Stürmer, K. M. Metallic biomaterials in skeletal repair. Eur. J. Trauma. 32 (2), 149-159 (2006).
- Huiskes, R., Weinans, H., Van Rietbergen, B. The relationship between stress shielding and bone resorption around total hip stems and the effects of flexible materials. Clin. Orthop. Relat. Res. 274, 124-134 (1992).
- Kanayama, M., et al. In vitro biomechanical investigation of the stability and stress-shielding effect of lumbar interbody fusion devices. J. Neurosurg. Spine. 93 (2), 259-265 (2000).
- Jung, H. -D., Kim, H. -E., Koh, Y. -H. Production and evaluation of porous titanium scaffolds with 3-dimensional periodic macrochannels coated with microporous TiO2. 135, 897-902 (2012).
- Jones, A. C., et al. Assessment of bone ingrowth into porous biomaterials using MICRO-CT. Biomaterials. 28 (15), 2491-2504 (2007).
- Li, J. P., et al. Bone ingrowth in porous titanium implants produced by 3D fiber deposition. Biomaterials. 28 (18), 2810-2820 (2007).
- Ahn, M. -K., Jo, I. -H., Koh, Y. -H., Kim, H. -E. Production of highly porous titanium (Ti) scaffolds by vacuum-assisted foaming of titanium hydride (TiH2) suspension. Mater. Lett. 120 (1), 228-231 (2014).
- Baas, J., et al. The effect of pretreating morselized allograft bone with rhBMP-2 and/or pamidronate on the fixation of porous Ti and HA-coated implants. Biomaterials. 29 (19), 2915-2922 (2008).
- Peng, L., Bian, W. -G., Liang, F. -H., Xu, H. -Z. Implanting hydroxyapatite-coated porous titanium with bone morphogenetic protein-2 and hyaluronic acid into distal femoral metaphysis of rabbits. Chin. J. Traumatol. (English Edition). 11 (3), 179-185 (2008).
- Reiner, T., Kababya, S., Gotman, I. Protein incorporation within Ti scaffold for bone ingrowth using Sol-gel SiO2 as a slow release carrier. J. Mater. Sci. - Mater. Med. 19, 583-589 (2008).
- Lee, J. H., Kim, H. E., Shin, K. H., Koh, Y. H. Improving the strength and biocompatibility of porous titanium scaffolds by creating elongated pores coated with a bioactive, nanoporous TiO2 layer. Mater. Lett. 64, 2526-2529 (2010).
- Li, J. C., Dunand, D. C. Mechanical properties of directionally freeze-cast titanium foams. Acta Mater. 59 (1), 146-158 (2011).
- Chino, Y., Dunand, D. C. Directionally freeze-cast titanium foam with aligned, elongated pores. Acta Mater. 56 (1), 105-113 (2008).
- Kim, S. W., et al. Fabrication of porous titanium scaffold with controlled porous structure and net-shape using magnesium as spacer. Mater. Sci. Eng. C. 33 (5), 2808-2815 (2013).
- Brentel, A. S., et al. Histomorphometric analysis of pure titanium implants with porous surface versus rough surface. J. Appl. Oral Sci. 14 (3), 213-218 (2006).
- Buser, D., et al. Influence of surface characteristics on bone integration of titanium implants. A histomorphometric study in miniature pigs. J. Biomed. Mater. Res. 25 (7), 889-902 (1991).
- Cochran, D., Schenk, R., Lussi, A., Higginbottom, F., Buser, D. Bone response to unloaded and loaded titanium implants with a sandblasted and acid-etched surface: a histometric study in the canine mandible. J. Biomed. Mater. Res. 40 (1), 1-11 (1998).
- Young, D. R., Robb, R. A., Rock, M. G., Chao, E. Y. Analysis of periprosthetic tissue formation around a porous titanium endoprosthesis using CT-based spatial reconstruction. J. Comput. Assist. Tomo. 18 (3), 461-468 (1994).
- Spoerke, E. D., et al. A bioactive titanium foam scaffold for bone repair. Acta Biomater. 1 (5), 523-533 (2005).
- Jung, H. D., et al. Highly aligned porous Ti scaffold coated with bone morphogenetic protein-loaded silica/chitosan hybrid for enhanced bone regeneration. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 102 (5), 913-921 (2013).
- Ryan, G. E., Pandit, A. S., Apatsidis, D. P. Porous titanium scaffolds fabricated using a rapid prototyping and powder metallurgy technique. Biomaterials. 29 (27), 3625-3635 (2008).
- Vasconcellos, L. M. R., et al. Porous titanium scaffolds produced by powder metallurgy for biomedical applications. Mater. Res. 11 (3), 275-280 (2008).
- Jung, H. D., Yook, S. W., Kim, H. E., Koh, Y. H. Fabrication of titanium scaffolds with porosity and pore size gradients by sequential freeze casting. Mater. Lett. 63 (17), 1545-1547 (2009).
- Jung, H. -D., Jang, T. -S., Wang, L., Kim, H. -E., Koh, Y. -H., Song, J. Novel strategy for mechanically tunable and bioactive metal implants. Biomaterials. 37, 49-61 (2015).
- Tarng, Y. S., Ma, S. C., Chung, L. K. Determination of optimal cutting parameters in wire electrical discharge machining. Int. J. Mach. Tools Manufact. 35 (12), 1693-1701 (1995).
- Jung, H. -D., et al. Dynamic Freeze Casting for the Production of Porous Titanium (Ti) Scaffolds. Mater. Sci. Eng. C. 33 (1), 59-63 (2013).
- Lee, J. -H., Kim, H. -E., Shin, K. -H., Koh, Y. -H. Improving the strength and biocompatibility of porous titanium scaffolds by creating elongated pores coated with a bioactive, nanoporous TiO2. Mater. Lett. 64 (22), 2526-2529 (2010).
- Jung, H. -D., Yook, S. -W., Kim, H. -E., Koh, Y. -H. Fabrication of titanium scaffolds with porosity and pore size gradients by sequential freeze casting. Mater. Lett. 63 (17), 1545-1547 (2009).
- Yook, S. -W., et al. Reverse freeze casting: A new method for fabricating highly porous titanium scaffolds with aligned large pores. Acta Biomater. 8 (6), 2401-2410 (2012).
- Yook, S. W., Yoon, B. H., Kim, H. E., Koh, Y. H., Kim, Y. S. Porous titanium (Ti) scaffolds by freezing TiH2/camphene slurries. Mater. Lett. 62 (30), 4506-4508 (2008).
- Yook, S. W., Kim, H. E., Koh, Y. H. Fabrication of porous titanium scaffolds with high compressive strength using camphene-based freeze casting. Mater. Lett. 63 (17), 1502-1504 (2009).
