Introduction
Mens metalliske biomaterialer har blitt mye brukt som bærende implantater og interne fikseringsanordninger på grunn av deres utmerket mekanisk styrke og elastisitet, 1-3 involvere de to kritiske utfordringer: 1) mekanisk mismatch fordi metallene er mye stivere enn biologiske vev, forårsaker uønskede skader til de omkringliggende vev og 2) lav bioaktivitet som ofte resulterer i dårlig grensesnitt med biologisk vev, ofte vekkfremmedlegemereaksjoner (for eksempel, betennelse eller trombose). 4-6 Porøse metalliske stillas er blitt foreslått for å fremme beninnvekst i strukturene, bedre . bone-implantat kontakt mens de stresset skjold effekter undertrykkes på grunn av deres redusert stivhet 7-9 Også ulike overflate modifikasjoner blitt brukt for å forbedre de biologiske aktiviteter av metalliske implantater; slike modifikasjoner inkluderer belegg metalloverflaten med bioaktive molekyler (f.eks vekst factors) eller legemidler (f.eks, vancomycin, tetracyklin). 10-12 imidlertid problemer som reduserte mekaniske egenskapene til porøse metall stillaser, redusert stivhet og rask frigjøring av bioaktive belegningslag forbli uløst. 13-16
Spesielt, titan (Ti) og Ti-legeringer er en av de mest populære Biometall systemer på grunn av sine gode mekaniske egenskaper, kjemisk stabilitet, og god biokompatibilitet. 13,17-19 deres skumformet applikasjoner har også tiltrukket seg økende interesse fordi 3D porøse nettverk fremme beninnvekst i tillegg til beinlignende mekaniske egenskaper. 20-22 Arbeidet har vært gjort for å forbedre de mekaniske egenskapene ved å utvikle nye produksjonsteknikker som replikering av polymer svamp, sintring av metallpartikler, rapid prototyping (RP) metode, og plass holder metode for å kontrollere de forskjellige funksjoner i porene (f.eks pore fraksjon,form, størrelse, distribusjon, og tilkoblings) og materialegenskaper (f.eks metallic fase og urenhet). 23-25 Nylig fryse støping av vannbasert metall slurry har fått betydelig oppmerksomhet til å produsere mekanisk forbedrede Ti skjemaer med godt justert pore strukturer ved å utnytte den ensrettede isen Dendritt vekst under størkning; Men oksygen forurensning forårsaket av kontakt av metallpulver med vann krever spesiell omsorg for å redusere sprøhet av Ti stillaser. 14,15
Derfor har vi utviklet en ny tilnærming mot fabrikere bioaktive og mekanisk tunbare porøse Ti stillaser. 25 stillasene i utgangspunktet har porøse strukturer med en porøsitet på mer enn 50%. De fabrikkerte porøse stillasene ble belagt med bioaktive molekyler og deretter komprimert med en mekanisk trykk der den endelige porøsitet, mekaniske egenskaper og legemiddeldosering atferd ble kontrollert av apparaed belastning. De densifiserte porøse ti- implantater har vist lav porøsitet med god styrke til tross for lav stivhet sammenlignes med ben (3-20 GPa). 2. På grunn av belegglaget ble bioaktiviteten av det densifiserte porøse Ti betydelig forbedret. Videre, på grunn av de unike flate porestrukturer indusert av fortetningsprosessen ble de belagte bioaktive molekyler sett å bli gradvis frigitt fra stillaset, opprettholde sin effektivitet over en lengre periode.
I denne studien har vi introdusert vår etablert metode for å dikte densifiserte porøse Ti stillaser for potensiell bruk i biomedisinske applikasjoner. Protokollen inkluderer dynamisk frysing casting med metall slurrier og fortetting av porøse stillaser. Først, for å fremstille porøse Ti stillas med god duktilitet den dynamiske frysestøpemetoden ble innført som vist i figur 1A. Ti-pulver ble dispergert i flytende kamfen; deretter, ved å redusere temperaturen,væskefasen ble gjort fast, noe som resulterer i faseseparasjon mellom Ti-pulver nettverket og faste kamfen krystaller. Deretter ble størknet Ti-kamfen grønne legemet sintres hvori Ti-pulver ble kondensert med kontinuerlig Ti struts, og kamfen fase ble fullstendig fjernet for å oppnå en porøs struktur. Belegget og fortetting prosess med de oppnådde porøse stillasene ble anvendt, variere graden av fortetting og initial porøsitet. Dekkbelegget og dets frigjøring oppførsel ble visualisert og kvantifisert ved hjelp av grønt fluorescerende protein (GFP) -belagt porøs Ti med og uten fortetning sammenlignet med GFP-belagte tett Ti. Til slutt ble funksjonelt gradert Ti stillaser som har to forskjellige porøse strukturene foreslått og demonstrert ved å variere graden av fortetting av de indre og ytre deler av de porøse stillaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabrikasjon av porøse metallStillas
- Forbered Ti-kamfen oppslemninger ved å blande kommersielt tilgjengelig Ti-pulver, kamfen, og KD-4 etter veiing i passende mengder av materialer som beskrevet i tabell 1 for porøse Ti stillas med fire innledende porøsiteter (40, 50, 60, og 70). Hell oppslemminger i 500 ml polyetylen (PE) flasker og rotere flaskene ved 55 ° C i 30 minutter i en kulemølle ovn ved 30 rpm.
- Hell oppslemmingene fra PE-flaskene inn i sylindriske aluminium (Al) former med en diameter på 60 mm og en høyde på 60 mm. Forsegle hver Al formen med den tilsvarende Al dekkglass og rotere formene i en kulemølle ovnen ved en hastighet på 30 rpm ved 55 ° C i 10 min.
- Deretter reduseres temperaturen i kulemølle ovn til 44 ° C, og kontinuerlig rotere formene ved en hastighet på 30 opm ved konstant temperatur på 44 ° C i 12 timer.
- Ta ut formen fra kulemill ovnen etter ytterligere roterende støpeformene ved RT i 1 time for avkjøling. Ta av størknet titanium / kamfen grønn kroppen fra Al mold ved hjelp av en Al stempelet.
- Plasser den størknede titan / kamfen grønne kroppen i en gummipose for hånd, og forsegle den gummiposen ved å binde munningen av posen med en streng. Plasser gummipose i vanntanken av en kald isostatisk pressing (CIP) maskin og anvende et isostatisk trykk på 200 MPa i 10 minutter. Fjern den komprimerte grønne legemet fra gummiposen.
- Overfør Ti-kamfen grønn kropp på en aluminadigel for hånd og plasser smeltedigel i fryse tørketrommel. Fryse-tørke det grønne legemet for å sublimere kamfen fase i det grønne legemet ved - 40 ° C i 24 timer.
- Deretter lukker digelen med en aluminiumoksyd dekkglass og plasser den lukkede digel i en vakuumovn (under 10 -6 Torr) ved romtemperatur. Deretter øker temperaturen i ovnen til 1300 ° C ved en oppvarmings rspiste på 5 ° C / min og holde temperaturen ved 1300 ° C i 2 timer.
- Etter varmebehandlingen, må det sintrede porøse Ti i ovnen for 6-7 timer inntil ovnen er fullstendig avkjølt til romtemperatur.
Merk: I løpet av 6 timer kjøleprosessen, er den gjennomsnittlige avkjølingshastighet av ovnen over 400 ° C ~ 15 ° C / min, og den gjennomsnittlige avkjølingshastighet av ovnen under 400 ° C er ~ 2 ° C / min. - Hvis det er nødvendig, kuttet blokk av sintret porøs Ti i prøvene skiveformede med en diameter på 16 mm gjennom elektrisk utladningsmaskinering (EDM). 27
Merk: Avhengig av størrelsen på Al formene, må størrelsen av den sintrede porøse Ti som skal modifiseres gjennom maskineringsprosessen (figur 2A). - Plasser et glassbeger med de porøse Ti-prøvene i en autoklav og sterilisere prøvene ved 121 ° C i 15 min. Fjerne prøvene fra autoklaven. Vask de porøse Ti prøver med destillert vann to ganger og deretter med 70% etanol to ganger.Til slutt forlater den porøse Ti i en petriskål og luft-tørke prøvene ved RT på en ren benk under UV-lys.
2. Dypp Coating av stillas med Bioaktive Agents
- Fortynn den kommersielle grønn fluorescens Protein (GFP) fra 1 mg / ml til 100 ug / ml i en ren benk ved å blande 1 ml av GFP med 9 ml av Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS, pH 7,4) oppløsning i en 10 ml-sterilisert polystyren (PS) tube som angitt i tabell 1.
- Dypp sterilisert tette eller porøse Ti i 10 ml fortynnet GFP-oppløsning (100 pg / ml) ved å anbringe prøvene i Ti-PS røret med GFP-løsning ved romtemperatur og å plassere på en ren benk.
- Plasser PS røret i en vakuumeksikator og evakuere eksikator i 10 minutter for å sikre at GFP oppløsningen trenger inn i porene i det porøse Ti mer effektivt.
- Fjern den porøse titan fra PS røret ved hjelp av pinsett. Plasser GFP-belagt porøs Ti inn i en 10 cm diameter Petri parabol og lufttørke O / N ved RT på en ren benk.
- Skyll den porøse Ti to ganger med 10 ml Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (DPBS) i et glassbeger, og flytter den porøse Ti i en 10 cm diameter petriskål ved hjelp av pinsetter og lufttørket ved romtemperatur på en ren benk.
3. Fortetting av porøse Stillas
- Plasser GFP-belagt porøse Ti prøver med ulike høyder i en sylindrisk stålform, og sette inn et sett av slag inn i topp og bunn hull i stålform (figur 3A).
- Komprimere den porøse Ti inne i stålform sammenstillingen ved RT i z-retningen av prøven (figur 3A) ved hjelp av en pressemaskin ved mellomliggende strekkhastigheter på 0,05 ~ 0,1 sek -1 mot de forutbestemte anvendes stammer som vist i tabell 2. Hold trykket i 1 min før lossing.
- Fjern de densifiserte Ti prøver fra stålform. Vask de densifiserte prøvene to ganger med 10 ml DPBSi et begerglass og lufttørke O / N ved RT på en ren benk.
4. Slipp Test av GFP-belagt Stillas
- Dyppe tre typer prøver (GFP-belagte tett Ti (etter trinn 2), GFP-belagte porøse Ti (etter trinn 1 og 2) og GFP-belagte densifiserte porøs Ti (etter trinn 1-3)) i 5 ml DPBS (pH 7,4) oppløsning inneholdt i en 10 ml sterilisert PS rør ved 37 ° C på en ren benk.
- Sug ut all DPBS oppløsning fra hvert PS rør med GFP-belagte prøven og fylle opp med en ny 5 ml DPBS oppløsning (pH 7,4) ved hjelp av en pipette i henhold til forutbestemte tider på 1, 2, 3, 5, 8, 12, 15, 22 og 29 dager etter nedsenking.
- Ta fluorescens bilder av GFP-belagt prøver før nedsenking (dag 0) og etter 22 dagers-immersion hjelp konfokal laser scanning spektroskopi (CLSM).
- Måle fluorescens signalintensiteten av de frigitte GFP i 1 ml oppløsning av totalt 5 ml DPBS oppløsning trekkes fra hver PS rør i avsnitt 4.2 ved hjelpUV-spektroskopi ved en bølgelengde på 215 nm. Konverter intensitetsverdi i konsentrasjonen av GFP løsning ved hjelp av standardkurven.
Merk: Før målingen, trekke standardkurve for GFP-løsning ved måling av fluorescens signalstyrken for GFP oppløsningen i konsentrasjonsområdet fra 0 ng / ml - 10 ug / ml.
5. Fabrikasjon av Gradert Porøse Ti Stillas
- Lag en blokk av sintret porøse Ti ved å gjenta trinn 1,1 til trinn 1.7.
- Maskinen sintret porøs Ti blokken i henhold til forhåndsbestemte struktur design (f.eks figur 5a og 5d) av EDM.
- Plasser de maskinerte Ti-prøvene med høydefordeling i en stålform hvor diameteren av porøse Ti er ~ 0,1 mm mindre enn diameteren av dysen og sette inn et sett av stempler i de øvre og nedre hull av stålform.
- Utfør trinn 3.2 og 3.3.
6. Porøsitet Measurement av Ti Stillas
- Måle massen (m s) of Ti stillaser.
- Beregn tilsynelatende volum (V e) for måling av lengden, bredden og høyden av Ti stillaser.
- Beregne porøsiteten ved hjelp av følgende ligning:
hvor P er den totale prosentvise porøsitet, ρ Ti er den teoretiske densitet for titan- og m S / V S er den målte tettheten av prøven.
Merk: porøsitet Ti prøver kan direkte hentes fra microCT bilder etter microCT avbildning utføres ved hjelp av en mikrodatamaskinstyrt tomografi scanner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fremstillingsprosessen som brukes til å fremstille porøse Ti stillas er illustrert i figur 1A. Ti pulveret holdes homogent dispergert i kamfen ved kontinuerlig rotasjon av beholderen ved 44 ° C i 12 timer og, mens flytende kamfen er fullstendig størknet, kan eventuelle sedimenter med forholdsvis tung Ti pulver reduseres til et minimum. Som et resultat ble den homogene Ti-kamfen grønne legemet produsert ved hjelp av den dynamiske fryse støpeprosessen som vist i figur 1 B, hvor 3-dimensjonelt innbyrdes forbundet kamfen store porer er omgitt av Ti pulverfase (figur 1C). Imidlertid feil rotasjon av beholderne ofte resulterer i inhomogen fordeling av Ti og kamfen faser i det grønne legemet, forårsaker forvrengning eller sprekkdannelse i den porøse stillaset følgende varmebehandling. Den optimale tilstand av rotasjonshastigheten ble funnet å være 30 rpm, som var i stand til å produsere en homogen rålegeme i de fleste tilfeller. Før fortsetteing med varmebehandling, er en sterk økning av kamfen bekreftet ved å observere tverrsnitt av den Ti-kamfen grønne legemet som vist i figur 1C. Hvis kamfen fasen er diskontinuerlig med en betydelig størrelse fordeling av porer, temperaturen og tiden for den dynamiske fryse støpingen må tilbakestilles. Typisk ble kamfen fasen av Ti-kamfen rålegemer funnet å være godt utviklet etter 12 timers dynamisk frysestøping, hvor kamfen fase ble kontinuerlig siden store kuleformede porer var i kontakt med hverandre. Størrelsen, morfologi og tilkobling av porer i porøst Ti ble ytterligere evaluert ved hjelp av mikro-CT-analyse etter varmebehandling.
Etter sintring ved 1300 ° C, blir de porøse Ti blokkene skjæres opp i flere sylindriske formede prøver med elektrisk utladningsmaskinering (figur 2A). De oppnådde sylindriske prøver viste ikke sprekker eller defekter. Representative mikro-CT-bilder av Porous Ti stillaser fabrikkert av konvensjonell (øverst) og dynamisk fryse støping (nederst) er vist i figur 2B. Porestruktur Ti-prøvene fra den konvensjonelle frysestøpe viser retnings pore innretting med irregulært formede porer på grunn av den dendrittiske veksten av kamfen under frysing. På den annen side, prøven fra dynamisk frysestøpe oppviser nesten sfæriske porer med tilfeldig porefordeling. Videre er høyere oppløsning mikroskopiske bilder av de porøse Ti stillaser med ulike porøsiteter (Initial Porøsitet (IP) = 50, 60, og 70 vol%) viser klart sfæriske porer tilfeldig fordelt innenfor Ti-nettverk (figur 2C). Porestørrelsen av de porøse Ti stillasene reduseres etter hvert som volumet av kamfen redusert.
Deretter blir fremstille porøse Ti stillaser belagt med biomolekyler og kompaktert inne i formen ved å variere det påførte belastning som vist i figur 3A. For visualization av det bioaktive belegglaget på Ti-prøvene, ble grønt fluorescerende protein (GFP) som anvendes i denne studien. Den påførte belastning (ε zz), som svarer til trykket (P zz), er funnet å variere graden av kompaktering som vist i figur 3B. Pore form blir utflatet som graden av fortetting øker og, som et resultat, på det høyeste fortetting, porer nesten forsvinner fordi nabo porene er i kontakt med hverandre. Men fra vår tidligere studie, bekreftet vi at pore- kanaler av de densifiserte prøvene er fremdeles åpen, med nesten den samme overflateareal som den porøse Ti av samme porøsitet. 25 For å evaluere de densifiserte prøver med forskjellige start porøsiteter, jo z-høyde skulle variere avhengig av den opprinnelige porøsitet for at fortettede prøven for å ha den samme endelige porøsitet. Tabell 2 gir også den forutsagte påført belastning for å oppnå den endelige målrettede porosity (FP) av de densifiserte porøse stillaser med forskjellig innledende porøsiteter. For eksempel, for å fremstille de densifiserte porøse prøvene med FP = 5%, av den porøse stillaset med IP = 70% krever en belastning på omtrent 0,7, mens stillaset med IP = 50% trenger omtrent 0,5. Derfor ble de innledende høydene av de porøse stillasene nøye beregnet i henhold til den opprinnelige porøsitet for å oppnå prøver med den samme endelige høyde etter fortetning. Som vist i figur 3C, fire prøver med varierende porøsiteter fra IP = 40% til 70% viser forskjellige innledende høyder før fortetting og deretter på slutten, med nesten identiske høyder på 2 mm.
GFP ble anvendt for å visualisere det beleggsjikt på porøse (IP = 70%) og fortettet porøs Ti (IP = 70%, FP = 7%) prøvene sammenlignet med kommersielle tett Ti som vist i figur 4A. Alle tre prøver viser klart den belagte overflaten morfologi svarende til thEir mikrostrukturer. Den fullstendig tett Ti overflate er fullstendig dekket med et grønt overtrekkslag, mens det porøse og fortettede porøse prøver har grønn Ti fjærben med store porer. Ved hjelp av disse tre belagte prøvene er vist i figur 4A, er utløser oppførsel observert (figur 4B). Mengden av frigitt GFP fra hver prøve ble uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (n = 3), og ble fulgt opp til en måned ved å måle intensiteten av fluorescens. Både tette og porøse Ti ble funnet å ha rask frigivelse GFP oppførsel med initial sprengning virkning, med de fleste frigjøres i løpet av en uke. Imidlertid viser fortettet porøs Ti kontinuerlig frigjøring opp til en måned, tydelig viser GFP på overflaten selv etter én måned (CLSM bilder av figur 4B).
Kompakteringsprosessen kan også brukes til fabrikasjon av funksjonelt gradert porøse Ti stillas som innføres i figur 5. De to pottenential utforming skjematisk av graderte strukturer ble valgt, hvor de indre og ytre lag av et sylindrisk stillas har forskjellige porøsiteter. For konstruksjonen med et tettere kjerne er vist i figur 5A, er den ytre delen av Ti stillaset forkortet ved mekanisk bearbeiding, som vist i figur 5B. Etter selektiv fortetning av det høyere indre del, ble gradienten struktur oppnås. Den detaljerte strukturinformasjon i fig 5BB og 5E målt ved hjelp av mikro-CT er gitt i Tabell 3 Mikro CT bildet i fig 5C viser tydelig de indre og ytre deler av stillaset med ulike porøsiteter (indre.: FP = ~ 60%, ytre: FP = ~ 70%). Alternativt kan en struktur med tettere ytre lag fremstilles ved å endre høydeforskjellen mellom de indre og ytre deler (figur 5D). Den porøse Ti med høyere ytre og nedre indre deler resulterer i en tettere oUter del etter fortetting (figur 5E), hvor porøsiteten i den ytre del ble senket til ~ 45%, med den indre del med den bevarte opprinnelige porøsitet (IP = 70%) som vist på figur 5F.
Figur 1. Fabrikasjon av Ti-kamfen grønn kroppen ved dynamisk fryse casting. (A) Skjematisk illustrasjon av den dynamiske fryse foringsprosessen for å oppnå størknede Ti-kamfen grønne legemet før varmebehandling (tilpasset med tillatelse fra Elsevier, Jung et al., 2013). (B) Optisk bilde av en representativ Ti-kamfen grønne legemet etter gjennomføringen av den dynamiske frysestøpeprosessen. (C) tverrsnittsbilde av Ti-kamfen grønt legeme hvor den faste kamfen fase er tilfeldig fordelt innenfor de kontinuerlige Ti pulver phase. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Porøse Ti stillaser med ulike innledende porøsitetene etter varmebehandling. (A) Optiske bilder av en fullt sintret porøs Ti blokk før og etter maskinering og en oppnådd sylindrisk porøst Ti stillas fra maskinering. (B) Ledd mikro-CT-bilder av de porøse Ti stillaser fabrikkert av konvensjonell fryse støping (øverst) og dynamisk fryse støping (nederst). Gule piler på toppen bildet i fig 2B viser pore innretting i radial retning. (C) Tverrsnitts bilder av de porøse Ti stillasene fabrikkert av dynamisk fryse støping med den første porøsitet (IP) 70% (øverst), 60%(midten) og 50% (nederst) der innfellinger er de optiske bilder av de tilsvarende porøse Ti stillaser (tilpasset med tillatelse fra Elsevier, Jung et al., 2013). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. dip-coating og fortetting av porøse Ti stillaser. (A) Skjematisk illustrasjon av fremstillingsprosessen av et fortettet porøs metall stillas (Ti) belagt med biomolekyler (f.eks GFP) (tilpasset med tillatelse fra Elsevier, Jung et al. , 2015). (B) Tverrsnittskonstanter bilder av de densifiserte porøse Ti stillas (IP = 70%) ved den påførte belastningen (ε zz) = 0, 0,53, 0,63, 0,68, noe som resulterer i den endelige porøsitet (FP = 70, 33, 19, 7%). (C Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. In vitro frigjøring oppførsel av GFP-lastet densifiserte porøse Ti stillaser. (A) Typiske CLSM bilder av GFP lastet på overflaten av tette, porøse og fortettede Ti stillaser. (B) Akkumulert mengder GFP løslatt fra tett, porøse og fortettet Ti stillasene opp til 29 dager (n = 3) med CLSM bilder av disse tre prøver etter nedsenking i PBS i 24 dager (skala bar = 200 mikrometer). Standardavvik (SD) er ossed for den beskrivende feilfelt med hvert datapunkt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Fabrikasjon av funksjonelt gradert porøs metall stillaser. (A) Skjematisk av en gradert porøs stillaset design med en tettere indre del. (B) Gradert porøs Ti stillas med tettere indre delen fabrikkert gjennom fortetting. (C) 2-D rekonstruert mikro-CT bilde av gradert porøs Ti stillas med den tettere indre del. (D) Skjematisk av et stillas design med gradient porøsitet med tettere ytre delen. (E) Gradert porøs Ti stillas med den tettere ytre del fremstilt ved fortetting hvor stillaset besitter en porøs indre kjerneomgitt av det densifiserte ytre lag. (F) 2-D rekonstruert mikro-CT-bilde av gradert porøs Ti stillas med tettere ytre delen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Target prøve | Ti-kamfen slurry | Belegningsoppløsning | |||
| Ti-pulver (g) | Kamfen (g) | KD-4 (g) | GFP (ml) | PBS (ml) | |
| Ti stillas med IP = 40% | 204,3 | 90 | 0,294 | 1 | 9 |
| Ti stillas med IP = 50% | 171,4 | 97 </ td> | 0,268 | ||
| Ti stillas med IP = 60% | 136,5 | 103 | 0.239 | ||
| Ti stillas med IP = 70% | 100 | 110 | 0,21 | ||
Tabell 1. Detaljert informasjon fra Ti-kamfen slurry og beleggsløsningen for fremstilling av mål-porøse Ti stillas (IP = 40, 50, 60, 70%) belagt med GFP. (IP står for første porøsitet).
| Initial porøsitet (%) | Slutt porøsitet (%) | ||||||
| 60 | 50 | 40 | 30 | 20 | 10 | 5 | |
| 50 | 0,17 | 0,29 | 0,38 | 0,44 | 0,47 | ||
| 60 | 0,20 | 0,33 | 0.43 | 0,50 | 0,56 | 0,58 | |
| 70 | 0,25 | 0,40 | 0,50 | 0,57 | 0,63 | 0,67 | 0,68 |
Tabell 2. Forut påført belastning (ε zz) av porøse stillas (IP = 50, 60, 70%) i form av målrettet endelige porøsitet (FP) ved hjelp av ligningen, FP = 1 - (1- IP) / (1- ε zz).
| Eksemplar | Før fortetting | Etter fortetting | |||||
| Høyde (mm) | Porøsitet (%) | Porestørrelse (mikrometer) | Høyde (mm) | Porøsitet (%) | Porestørrelse (mikrometer) | ||
| Indre del | 18 ± 1 | 70 ± 1 | 370 ± 100 | 13 ± 1 | 57 ± 5 | 285 ± 100 | |
| Ytre del | 14 ± 1 | 70 ± 5 | 365 ± 110 | ||||
| Gradert stillaset av fig. 5e | Indre del | 14 ± 2 | 12 ± 1 | 70 ± 8 | 315 ± 110 | ||
| Ytre del | 18 ± 1 | 45 ± 8 | 230 ± 80 | ||||
Tabell 3. Struktur informasjon av de indre og ytre deler av graderte porøse stillasene (figur 5B og figur 5E) før og etter fortetting i forhold til z-høyde, porøsitet og midlere porestørrelse målt ved hjelp av mikro-CT.
| Initial porøsitet på porøse Ti (%) | Før fortetting | Etter kompaktering (FP = 5%) | ||
| Stivhet (GPa) | Flytegrense (MPa) | Stivhet (GPa) | Flytegrense (MPa) | |
| 50 | 19 | 143 | 44 | > 370 |
| 60 | 1. 3 | 130 | 42 | > 370 |
| 70 | 5 | 58 | 35 | > 370 |
Tabell 4. Stivhet og flytegrense porøse Ti stillas (IP = 50, 60, 70%) før og etter fortetting (tilpasset med tillatelse fra Elsevier, Jung et al., 2015).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mens Biometall systemer har vært mye brukt for biomedisinske anvendelser, spesielt, som bærende materialer av høy stivhet og lav bioaktivitet av metaller har vært ansett som store utfordringer. I denne studien har vi etablert fabrikasjon metoden for en ny metall-system, en fortettet porøst metall stillas som har biomimetic mekaniske egenskaper samt bioaktive overflate med bærekraftig utgivelsen oppførsel. De store fordelene ved vår fremstillingsmetode omfatter 1) ingen endring i det foregående dynamisk frysestøpemetode som vi allerede utviklet, 28 2) kontroll av en parameter-grad av fortetting å oppnå både mekanisk forsterkning og bærekraftig frigjøring oppførsel av biomolekyler fra porøs metall stillas og 3) potensial søknad til funksjonelt gradert materiale.
En av de kritiske trinn som trengs for å produsere den fortettede porøse metall er fremstillingen av porøse Ti, som besitter to viktige features: 1) duktilitet å kontrollere frigjøringshastigheten av bioaktive molekyler og de mekaniske egenskaper og 2) høy pore tilkoblinger å laste og slipper biomolekyler. Imidlertid rapportert tidligere porøse titan stillaser som produseres ved hjelp av avstandsholder-metoden, svamp mal metode, og pulver har vist seg enten begrenset pore sammenkopling eller duktilitet. 14,24,29 Spesielt urenhetene som er opprettet ved omsetning av metallpulver med andre omkringliggende materiale under varmebehandlingen er kjent for å redusere materialets duktilitet fordi metallpulver er i kontakt med de andre materialer (f.eks plass holder eller polymer mal), noe som resulterer i sprøtt svikte under mekaniske tester. 14,24,29 Således , for å fremstille kompaktert porøst metall, urenhetene må minimaliseres for de fleste av de konvensjonelle fremstillingsmetoder. For å unngå denne komplikasjonen, undersøkte vi den porøse morfologi og mekaniske atferd of porøse titan stillaser fremstilt ved bruk av det frysestøpemetoden med kamfen for å minimere interaksjonen mellom metallpulver og den flytende fase. 26,28,30-33
En ulempe ved den konvensjonelle frysestøpemetoden er at den ofte resulterer i retnings porekanaler (figur 2B, øverste bilde). På den annen side, med dynamisk frysestøping, ble pore form og størrelse funnet å være mer ensartet enn for den konvensjonelle frysestøpe og porefordeling i stillaset er nesten tilfeldig. . Disse strukturelle trekk porøse stillasene fra dynamisk fryse støping showet isotrop mekanisk oppførsel, og dermed gir fortetting i et trangt mold under uniaxial press 26,28 Under dynamisk fryse casting, to store hendelser inntreffer innenfor metall slurry: 1) krystallvekst kamfen fase og 2) omfordeling av metallstøv og størknet kamfen i den gjenværende væskefasen å unngå sedimentation. Tyngdekraften fører til at metallpulver for å segregere til væsken kamfen er fullstendig stivnet. Den kontinuerlige rotasjon av slurryen nær smeltetemperaturen for kamfen gir tilstrekkelig tid for sfæriske kamfen krystaller vokse homogent, slik at den tilfeldige og jevn fordeling av Ti pulvere og kamfen krystaller, som vist i figur 1C.
Etter kjøleprosessen, størknet fullstendig Ti-kamfen bifasisk grønne legemet (figur 1B) ble oppnådd. For å fullstendig fjerne kamfen fra den størknede grønne legemet uten at strukturen kollapser, kamfen ble sublimert i en vakuum-eksikator ved -20 ° C. Etter fjerning av kamfen fase, ble den grønne kroppen porøse, bestående av kun Ti pulver. Siden det ikke er noen interaksjon mellom Ti partikler, er det porøse Ti grønne kroppen skjør slik at forsiktig håndtering er nødvendig. For å unngå direkte håndtering av den grønne kroppen med hendene før varmebehandlingment, en keramisk digel ble valgt for beholder av det grønne legemet for frysetørking og sintring. Beholderen med den grønne legeme ble plassert i en vakuum ovn umiddelbart etter frysetørking og varmebehandling ved 1300 ° C, noe som gjør det mulig for det grønne legemet for å være helt fortettet uten signifikante feil i metall struts. For vurdering av prøvene ble det porøse Ti blokkene skjæres opp i mindre porøse Ti sylindere fordi geometrien og størrelsen av de porøse prøver bør være identiske (figur 2A). Alle prøvene ble vellykket bearbeides uten vesentlige feil (Tall 2B og 2C). Avhengig av mengden av Ti strøm i oppslemmingen, ble Ti stillaser med forskjellige porøsiteter oppnådd med sfæriske former og tilfeldig fordelte porer (figur 2C).
Etter at de porøse Ti stillasene ble oppnådd ved bruk av dynamisk frysestøpemetode som rapportert i vårt tidligere study, ble 28 de biomolekyler belagt på overflaten av Ti og fortetting av den belagte porøse Ti ble utført som vist i figur 3A. For å unngå enhver forurensning eller denaturering av biomolekyler, ble belegningsprosessen utføres på en ren benk ved RT i løpet av 24 timer etter at de porøse stillasene ble autoklavert og omhyggelig renset ut. For å minimalisere tapet av de belagte biomolekyler før fortetning, ble renseprosessen minimaliseres etter beleggingsprosessen ble utført. Kompakteringsprosessen ble kontrollert av den anvendte deformasjon av de porøse Ti prøvene i z-retningen, omdannet til stammen, ε zz. 26 Avhengig av den opprinnelige porøsitet av Ti-stillas, den påførte belastning og tilsvarende endelige porøsitet ble variert (tabell 2 ). For å sikre de densifiserte porøse stillaser med forskjellig innledende porøsiteter hadde identiske endelige geometrier og størrelser, den anvendte stamme av den inditvillingstillasene ble beregnet, og den totale prøvehøyden (lengde i z-retning) av hver prøve ble deretter forutsagt før fortetning. Figur 3D viser at forskjellige høyder av de enkelte porøse prøver med varierende porøsitet kan føre til at den fortettede porøse prøven med identisk endelig høyde på samme endelige porøsitet.
Ved å kontrollere graden av fortetting, de densifiserte porøse stillasene har unik mekanisk atferd med langvarig frigjøring av de belagte biomolekyler. Den påførte belastning forandrer to viktige parametre av de porøse Ti stillasene: endelige porøsitet og porestørrelse. De porøse stillaser med lavere porøsitet viser høyere stivhet og styrke. Vår tidligere studie rapporterte stress-belastning oppførselen densifiserte porøse stillas med forbedret styrke i forhold til porøse Ti (tabell 4), samt betydelig redusert stivhet i forhold til kommersielle tett Ti. 26. I denne studien har vi også observert the frigjøring oppførsel av fortettet porøs Ti sammenlignet med både tette og porøse Ti gjennom visualisert påvisning av GFP-belegglaget som vist i figur 4. Resultatene var i overensstemmelse med vår tidligere studie, 26 hvor de densifiserte porøse stillasene besitter betydelig forbedret frigivelse oppførsel av belagte materialer, forlenge utgivelsen tid med inntil fire måneder på grunn av økt torturosity av stillasene med redusert porestørrelse. Den nåværende 30 frigang testen viser tydelig den resterende GFP på overflaten av det densifiserte porøse Ti i motsetning til ingen GFP rest på enten tette eller porøse Ti overflater.
Til slutt ble fortetting Metoden som anvendes til produksjon av funksjonelt gradert porøse stillas hvor de indre og ytre deler har forskjellige porøsiteter. For den sylindriske stillaset, kan differensiere z-høydene av de indre og ytre deler er lett føre til gradert porøse stillas som vist i figur 5. Den påførte belastning (ε zz) på den indre del i den porøse Ti stillaset er vist på figur 5B var ~ 0,27, noe som resulterte i den endelige porøsitet på ~ 57%, mens ingen belastning ble påført den ytre delen. På den annen side, den påførte belastningen (ε zz) på den ytre del i det porøse Ti stillaset på figur 5B var ~ 0,33, noe som resulterte i den endelige porøsitet på ~ 45%, mens den indre del var nesten intakt, bevare den opprinnelige porøsitet (Tabell 3). Imidlertid ble to store utfordringer for de graderte porøse stillaser observert fra dette eksperimentet. Først må de kontinuerlige indre og ytre deler indusert inkonsekvent belastninger fordeling innen stillas; således inntraff fortetting inhomogeneously, hvor regionene rundt de øvre og nedre overflater var tettere enn de rundt den indre overflaten. Denne tendensen var kritisk som høydeforskjellen mellom de to delene økes. Videre gradert porooss stillas med den tettere indre del var vanskeligere å fremstille enn stillaset med den tettere ytre del på grunn av fortetting av den indre del skal utføres, å være begrenset til den ytre delen, noe som resulterte i inhomogen deformasjon i de to deler. Å løse inhomogene fortetting av gradert stillaset, har vi utviklet to separate deler som kan settes sammen i løpet av fortetting prosessen. Selv om det i denne artikkelen, i den optimale tilstand frembringe perfekt fremstilt gradert porøs struktur var ennå ikke helt funnet, ble potensialet for fortetting fremgangsmåte for fremstilling av trinnkonstruksjonen også bekreftet. Den optimaliserte fremstillingsmetode av gradert porøse struktur er pågående, og som videre arbeidet, vil selektiv narkotika lasting til gradert struktur bli undersøkt for den funksjonelle utgivelsen oppførsel av stillaset.
Fordelene med den foreslåtte tilnærmingen i denne studien omfatter 1) bedre mechanical kompatibilitet med biologiske vev med god styrke og 2) forlenget bioaktivitet for bedre biologiske resultater. Imidlertid er en av de største ulempene er redusert porestørrelse som ikke kan fremme beninnvekst gjennom poren nettverk av metalliske stillas for en bedre ben-implantat-grensesnitt. For å løse dette problemet, gradert porestrukturer har blitt foreslått, der de porøse og tette deler eksistere; således, de porøse deler tillater beninnvekst, mens de tette delene mekanisk stabilitet og forlenget bioaktivitet. Derfor vil funksjonelt gradert ti- implantater gjennom forskjellige strukturelle utførelser være fremstilt og testet, spesielt fokus på den forbedrede evne til ben integrering. Videre bør en annen begrensning være fabrikasjon av implantater med komplisert geometri. For å oppnå en kompleks formet implantat (f.eks femoral kjegle augmentasjonen), blir den ytterligere bearbeidingen kreves etter densifisering, å pålegge to store ulemper påsluttproduktet: ineffektiv og uøkonomisk materialforbruk, fordi den betydelige volum av porøs Ti Blokken er ofte fjernes under prosessen, og potensiell forurensning og tap av belagte biomolekyler under maskineringsprosessen. Forbedring på fabrikasjon prosessen med de porøse Ti stillasene med kompleks geometri pågår. De densifiserte porøse metall stillas kan påføres på forskjellige ortopedisk bruk, f.eks kunstig ny plate, ved å erstatte enten bulk eller porøse metalliske implantater, og virker som en laststøtte, så vel som en medikamentbærer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Titanium powder | Alfa Aesar | #42624 | -325 mesh, 99.5% (metals basis) |
| Camphene | SigmaAldrich | #456055 | 95%, C10H16 |
| KD-4 | Croda | | Hypermer, polymeric dispersant |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Welgene | ML 008-01 | |
| Green Fluorescent Protein (GFP) | Genoss Co. | - | >98% purity, 1 mg/ml |
| Ball mill oven | SAMHENUG ENERGY | SH-BDO150 | |
| Freeze dryer | Ilshin Lab. | PVTFD50A | |
| Cold isostatic pressing (CIP) machine | SONGWON SYSTEMS | CIP 42260 | |
| Vaccum furnace | JEONG MIN INDUSTRIAL | JM-HP20 | |
| electical chaege machine | FANUC robocut | 0iB | External use |
| Press machine | CG&S | AJP-200 | |
| Confocal laser scanning spectroscopy (CLSM) | Olympus | FluoView FV1000 | External use |
References
- Long, M., Rack, H. Titanium alloys in total joint replacement-a materials science perspective. Biomaterials. 19 (18), 1621-1639 (1998).
- Niinomi, M. Recent metallic materials for biomedical applications. Metall. Mater. Trans. A. 33 (3), 477-486 (2002).
- Frosch, K. H., Stürmer, K. M. Metallic biomaterials in skeletal repair. Eur. J. Trauma. 32 (2), 149-159 (2006).
- Huiskes, R., Weinans, H., Van Rietbergen, B. The relationship between stress shielding and bone resorption around total hip stems and the effects of flexible materials. Clin. Orthop. Relat. Res. 274, 124-134 (1992).
- Kanayama, M., et al. In vitro biomechanical investigation of the stability and stress-shielding effect of lumbar interbody fusion devices. J. Neurosurg. Spine. 93 (2), 259-265 (2000).
- Jung, H. -D., Kim, H. -E., Koh, Y. -H. Production and evaluation of porous titanium scaffolds with 3-dimensional periodic macrochannels coated with microporous TiO2. 135, 897-902 (2012).
- Jones, A. C., et al. Assessment of bone ingrowth into porous biomaterials using MICRO-CT. Biomaterials. 28 (15), 2491-2504 (2007).
- Li, J. P., et al. Bone ingrowth in porous titanium implants produced by 3D fiber deposition. Biomaterials. 28 (18), 2810-2820 (2007).
- Ahn, M. -K., Jo, I. -H., Koh, Y. -H., Kim, H. -E. Production of highly porous titanium (Ti) scaffolds by vacuum-assisted foaming of titanium hydride (TiH2) suspension. Mater. Lett. 120 (1), 228-231 (2014).
- Baas, J., et al. The effect of pretreating morselized allograft bone with rhBMP-2 and/or pamidronate on the fixation of porous Ti and HA-coated implants. Biomaterials. 29 (19), 2915-2922 (2008).
- Peng, L., Bian, W. -G., Liang, F. -H., Xu, H. -Z. Implanting hydroxyapatite-coated porous titanium with bone morphogenetic protein-2 and hyaluronic acid into distal femoral metaphysis of rabbits. Chin. J. Traumatol. (English Edition). 11 (3), 179-185 (2008).
- Reiner, T., Kababya, S., Gotman, I. Protein incorporation within Ti scaffold for bone ingrowth using Sol-gel SiO2 as a slow release carrier. J. Mater. Sci. - Mater. Med. 19, 583-589 (2008).
- Lee, J. H., Kim, H. E., Shin, K. H., Koh, Y. H. Improving the strength and biocompatibility of porous titanium scaffolds by creating elongated pores coated with a bioactive, nanoporous TiO2 layer. Mater. Lett. 64, 2526-2529 (2010).
- Li, J. C., Dunand, D. C. Mechanical properties of directionally freeze-cast titanium foams. Acta Mater. 59 (1), 146-158 (2011).
- Chino, Y., Dunand, D. C. Directionally freeze-cast titanium foam with aligned, elongated pores. Acta Mater. 56 (1), 105-113 (2008).
- Kim, S. W., et al. Fabrication of porous titanium scaffold with controlled porous structure and net-shape using magnesium as spacer. Mater. Sci. Eng. C. 33 (5), 2808-2815 (2013).
- Brentel, A. S., et al. Histomorphometric analysis of pure titanium implants with porous surface versus rough surface. J. Appl. Oral Sci. 14 (3), 213-218 (2006).
- Buser, D., et al. Influence of surface characteristics on bone integration of titanium implants. A histomorphometric study in miniature pigs. J. Biomed. Mater. Res. 25 (7), 889-902 (1991).
- Cochran, D., Schenk, R., Lussi, A., Higginbottom, F., Buser, D. Bone response to unloaded and loaded titanium implants with a sandblasted and acid-etched surface: a histometric study in the canine mandible. J. Biomed. Mater. Res. 40 (1), 1-11 (1998).
- Young, D. R., Robb, R. A., Rock, M. G., Chao, E. Y. Analysis of periprosthetic tissue formation around a porous titanium endoprosthesis using CT-based spatial reconstruction. J. Comput. Assist. Tomo. 18 (3), 461-468 (1994).
- Spoerke, E. D., et al. A bioactive titanium foam scaffold for bone repair. Acta Biomater. 1 (5), 523-533 (2005).
- Jung, H. D., et al. Highly aligned porous Ti scaffold coated with bone morphogenetic protein-loaded silica/chitosan hybrid for enhanced bone regeneration. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 102 (5), 913-921 (2013).
- Ryan, G. E., Pandit, A. S., Apatsidis, D. P. Porous titanium scaffolds fabricated using a rapid prototyping and powder metallurgy technique. Biomaterials. 29 (27), 3625-3635 (2008).
- Vasconcellos, L. M. R., et al. Porous titanium scaffolds produced by powder metallurgy for biomedical applications. Mater. Res. 11 (3), 275-280 (2008).
- Jung, H. D., Yook, S. W., Kim, H. E., Koh, Y. H. Fabrication of titanium scaffolds with porosity and pore size gradients by sequential freeze casting. Mater. Lett. 63 (17), 1545-1547 (2009).
- Jung, H. -D., Jang, T. -S., Wang, L., Kim, H. -E., Koh, Y. -H., Song, J. Novel strategy for mechanically tunable and bioactive metal implants. Biomaterials. 37, 49-61 (2015).
- Tarng, Y. S., Ma, S. C., Chung, L. K. Determination of optimal cutting parameters in wire electrical discharge machining. Int. J. Mach. Tools Manufact. 35 (12), 1693-1701 (1995).
- Jung, H. -D., et al. Dynamic Freeze Casting for the Production of Porous Titanium (Ti) Scaffolds. Mater. Sci. Eng. C. 33 (1), 59-63 (2013).
- Lee, J. -H., Kim, H. -E., Shin, K. -H., Koh, Y. -H. Improving the strength and biocompatibility of porous titanium scaffolds by creating elongated pores coated with a bioactive, nanoporous TiO2. Mater. Lett. 64 (22), 2526-2529 (2010).
- Jung, H. -D., Yook, S. -W., Kim, H. -E., Koh, Y. -H. Fabrication of titanium scaffolds with porosity and pore size gradients by sequential freeze casting. Mater. Lett. 63 (17), 1545-1547 (2009).
- Yook, S. -W., et al. Reverse freeze casting: A new method for fabricating highly porous titanium scaffolds with aligned large pores. Acta Biomater. 8 (6), 2401-2410 (2012).
- Yook, S. W., Yoon, B. H., Kim, H. E., Koh, Y. H., Kim, Y. S. Porous titanium (Ti) scaffolds by freezing TiH2/camphene slurries. Mater. Lett. 62 (30), 4506-4508 (2008).
- Yook, S. W., Kim, H. E., Koh, Y. H. Fabrication of porous titanium scaffolds with high compressive strength using camphene-based freeze casting. Mater. Lett. 63 (17), 1502-1504 (2009).
