Introduction
而金属生物材料已被广泛用作由于其优异的机械强度和韧性，1-3承重植入物和内固定装置，他们涉及两个关键的挑战：1）机械失配，因为金属是比生物体组织硬得多，从而导致不希望的损害到周围组织和2）低的生物活性，往往导致界面差与生物组织，往往挑起异物反应 （如炎症或血栓形成）。已经提出了促进骨向内生长的结构4-6多孔金属支架，改善骨-植入物接触，而应力屏蔽效果，因为它们降低的刚性抑制7-9此外，各种表面改性已经应用于提高金属植入物的生物活性;这些修改包括涂层将金属表面与生物活性分子（例如，生长的fac器）或药物 （如万古霉素，四环素）10-12但是，存在的问题，如多孔金属支架降低机械性能，降低的硬度和快速释放的生物活性涂层的层仍然没有得到解决。13-16
特别是，钛（Ti）和Ti的合金是一体的，因为它们的优异的机械性能，化学稳定性的最流行biometal系统，以及良好的生物相容性。13,17-19其泡沫形的应用也引起越来越多的关注，因为在3D多孔网络促进除了骨样的机械性能的骨向内生长。20-22已作出努力通过开发新的制造技术，包括聚合海绵的复制，金属粒子，快速成型（RP）的方法的烧结来提高机械性能，并为了控制孔的各种特征空间保持器的方法（例如，孔隙分数，形状，大小，分布，和连接）和材料性质（例如，金属相和杂质）23-25 最近，水性金属浆料的冻结铸造已经获得了相当大的注意，以产生机械增强的Ti形式具有良好对准孔结构通过利用在凝固过程中的单向冰枝晶生长;然而，所造成的金属粉末与水接触氧污染需要特别小心，以尽量减少钛支架的脆化。14,15
因此，我们开发了对制造生物活性和机械可调多孔钛支架的新方法。25支架最初有超过50％的孔隙率多孔结构。所制造的多孔支架涂覆有生物活性分子，然后进行压缩使用期间的最后的孔隙率，机械性能和药物释放行为由APPLI分别控制一个机械压力机编辑应变。致密多孔钛种植体，尽管低刚度比得上骨（3-20 GPA）2由于被覆层的一者所示低孔隙率具有良好的强度，致密多孔钛的生物活性显著改善。因为引起的致密化过程中的独特扁平孔结构。此外，涂布的生物活性分子被视为被逐渐从支架释放时，保持其功效为长时间。
在这项研究中，我们介绍了我们建立的方法来制作致密多孔钛支架的生物医学应用的潜在用途。该协议包括动态凝固的铸造金属浆料和多孔支架的致密化。首先，为了制造多孔钛支架具有良好的延展性的动态冷冻铸造方法被引入，如图1A。钛粉末分散在液体莰;然后，通过降低温度，液相固化，从而在钛粉末网络和固体莰晶体之间的相分离。接着，将固化的Ti-莰生坯进行烧结，其中的Ti粉末缩合的连续钛支柱，和莰相完全除去，得到多孔结构。该涂层和致密化过程用所获得的多孔支架受雇于，变化的致密化和初始孔隙的程度。被覆层和它的释放行为进行观察和使用绿色荧光蛋白（GFP）包被的多孔钛具有和不致密化相比，GFP-涂覆致密的Ti定量。最后，提出并通过改变多孔支架的内层和外层部分的致密化的程度表现出功能梯度的Ti支架具有两个不同的多孔结构。
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Protocol
1.制备多孔金属支架的
- 通过混合市售的Ti粉末，莰烯，和KD-4 如表1中描述的多孔钛支架具有四个初始孔隙率（40，50，60，和70）称量材料的适当的量后制备的Ti-莰泥浆。倾浆料到500ml聚乙烯（PE）瓶和旋转瓶在55℃下30分钟在球磨机烘箱在30rpm。
- 倾从PE瓶浆料成圆柱形的铝（Al）的模具，其直径为60毫米和60毫米的高度。密封每个铝模具与相应的A1盖玻片并旋转在球磨机烘箱模具以30rpm的速度在55℃下进行10分钟。
- 随后，降低球磨机烘箱的温度升高到44℃，并连续旋转模具以30rpm的速度在44℃进行12小时的恒温。
- 取出模具从球 -磨炉之后附加地旋转所述模具在RT 1小时的冷却过程。从使用Al柱塞铝模具中取出固化的钛/莰生坯。
- 将固化的钛/莰生坯在一橡胶袋通过手和完全由捆扎袋的口用字符串密封橡胶袋。将橡胶袋在冷等静压（CIP），机的水槽中，并应用为200MPa的等静压力10分钟。从橡胶袋中取出压缩坯体。
- 上手工传送的Ti-莰生坯氧化铝坩埚放置在坩埚中的冷冻干燥机。冷冻干燥该生坯升华莰相在生坯在 - 40℃下放置24小时。
- 接着，关闭该坩埚有氧化铝盖玻片并将封闭坩埚在真空炉中（低于10 -6托 ）于RT。然后，增加了炉的温度升高到1300℃，在一个加热ř吃了5℃/分钟并保持温度在1300℃进行2小时。
- 热处理后，保持烧结多孔钛在炉为6-7小时，直至炉完全冷却至室温。
注意：在6小时的冷却过程中，400℃以上的熔炉的平均冷却速度为〜15℃/分钟和400℃以下的熔炉的平均冷却速度为2〜℃/分钟。 - 如果需要的话，切割烧结的多孔钛的块到盘形样品，直径为通过放电加工16个毫米（EDM）。27
注意：根据所述Al模具的大小，需要通过加工过程（图2A）进行修改的烧结多孔的Ti的大小。 - 放置在高压釜中的多孔钛样品的玻璃烧杯中，并灭菌样品在121℃下进行15分钟。从高压釜中取出样品。洗多孔钛样品用蒸馏水洗涤两次，然后用70％乙醇两次。最后，离开多孔钛到培养皿并空气干燥在RT样品上在UV光下净化台。
支架的2浸涂与生物活性剂
- 通过混合1毫升的GFP用9ml的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS，pH7.4）中的溶液在10毫升灭菌的从1毫克/毫升，以在清洁台上100微克/毫升稀释商用绿色荧光蛋白（GFP）的聚苯乙烯（PS）管，如表1所示。
- 通过将钛样品到PS管在RT将GFP溶液和放置在净化台浸没灭菌致密或多孔钛在10毫升稀释的GFP溶液（100微克/毫升）。
- 放置在PS管在真空干燥器并撤离干燥器10分钟，以确保将GFP溶液更有效地渗入多孔钛的孔中。
- 除去使用镊子将PS管上的多孔钛。将GFP-涂覆的多孔钛成直径为10cm的聚乙烯三道菜和风干O / N在室温在一个干净的长椅上。
- 用在玻璃烧杯中10个ml的Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中冲洗多孔钛两次，并使用镊子和风干移动多孔钛成直径为10cm的培养皿在RT上的净化台。
3.致密多孔支架的
- 放置在一个圆柱形钢模具的GFP-涂覆的多孔钛的样品不同的高度，并插入了一组冲头进入钢模具（图3A）的顶部和底部的孔。
- 用压制机以0.05〜0.1秒的中间应变率压缩所述多孔钛在RT中的样品（图3A）的z方向上的钢模具组件内-1针对在表2所示的预定的施加应变。握持压力卸货前1分钟。
- 从钢模具去除致密的Ti样品。用10毫升的DPBS洗涤两次致密样品在一个干净的长椅的烧杯中，空气干燥O / N在室温。
绿色荧光蛋白涂层支架4释放测试
- 沉浸三种试样（GFP涂覆致密的Ti（后步2），绿色荧光蛋白涂覆的多孔钛（后步骤1和2）和GFP-涂覆致密多孔的Ti（后步骤1-3））的5ml DPBS（pH值7.4）在37℃下在清洁台上所载10ml的灭菌的PS管溶液。
- 吸出所有来自每个PS管的DPBS溶液与GFP-涂覆的样品和补充与使用根据预定的次数的1，2，3，5，8，12的吸移管新5 ml的DPBS溶液（pH 7.4），浸泡后15，22和29天。
- 取GFP涂覆样品的荧光图像浸渍（第0天）前，用共聚焦激光扫描光谱（CLSM）后22天，浸泡。
- 测量所释放的GFP在1ml溶液中的荧光信号强度从总共5毫升DPBS溶液从每个试管的PS在节4.2绘制使用紫外光谱在215纳米的波长。的强度值转换成利用标准曲线将GFP溶液的浓度。
注意：在测量之前，通过测量在0纳克/毫升的浓度范围将GFP溶液的荧光信号强度绘制的GFP溶液的标准曲线 - 10微克/毫升。
5.制造分级多孔钛支架的
- 通过重复步骤1.1至步骤1.7产生烧结多孔Ti的块。
- 机根据预定结构设计 （如， 图5a和 5d）通过电火花烧结多孔的Ti块。
- 放置加工的Ti样品高度分布在一个钢模其中多孔钛的直径为〜小于模具的直径0.1毫米小，并插入了一组冲头进入钢模具的顶部和底部的孔。
- 执行步骤3.2和3.3。
6.孔隙率我钛支架的asurement
- 衡量的Ti支架的质量（m 多个）。
- 计算的表观容积（V S），通过测量钛支架长度，宽度和高度。
- 使用下列公式计算孔隙率：
其中P是总孔隙率，ρTi为钛和米S的理论密度/ V S是样品的测量的密度。
注意：钛样品的孔隙率可以从显微图像来直接检索后显微成像是使用微计算机断层扫描仪。
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Representative Results
用于生产多孔钛的支架的制造方法示于图1A。钛粉末被保持在莰均匀分散由容器的连续旋转在44℃下12小时和，而液体莰被完全固化，相对较重的Ti粉末的任何沉积物最小化。其结果是，将均匀的Ti-莰生坯使用动态冷冻浇铸方法生产，如图1B所示，在其中三维地相互连接的大莰孔隙由钛粉末相（图1C）所包围。然而，不正确的容器的转动经常导致Ti和莰烯相的在生坯中不均匀分布，引起畸变或多孔支架的下列热处理开裂。转速的最佳条件被发现是每分钟30转，这是能够产生均匀的坯体在大多数情况下。在继续荷兰国际集团与热处理，莰烯的广泛生长是通过观察在Ti-莰生坯的横截面，如图1C证实。如果莰相是不连续的微细孔的一个显著尺寸分布，动态冷冻浇铸的温度和时间需要复位。通常，所述的Ti-莰生坯的莰相被认为是发达的后12小时动态冷冻浇铸，其中莰相成为连续因为大的球形孔是在相互接触。在多孔钛的孔的大小，形态和连通使用显微CT分析热处理后进一步评估。
烧结在1300℃后，将多孔的Ti块通过放电加工（图2A）切割成多个圆柱形样品。将得到的圆筒形试样没有显示出裂缝或缺陷。所述porou的代表性显微CT图像š通过常规（顶部）制造的Ti支架和动态冷冻浇铸（底部）示于图2B。从常规的冷冻浇铸的钛样品的孔结构显示定向孔对准与冷冻过程中的不规则形状的孔，因为莰烯的枝晶生长的。另一方面，从动态冷冻浇铸样品显示几乎球形孔与随机的孔隙分布。此外，该多孔钛支架各种孔隙度（初始孔隙率（IP）= 50，60，和70体积％）的更高分辨率的显微图像清楚地显示的球形孔在Ti网络（图2C）内随机分布的。多孔钛支架的孔径下降为莰烯的数量减少。
接着，将制造的多孔钛的支架是通过改变所施加的应变，如图3A涂覆有生物分子和致密的模具内。对于六在Ti样品生物活性涂层的sualization，绿色荧光蛋白（GFP）用于这项研究。所施加的应变（εZZ），其对应于所述压力（P ZZ），被发现以改变致密化的程度，如图3B所示。孔形状变得平坦化的致密化程度的增加，并且作为结果，在最高致密化，孔隙几乎消失，因为邻近的孔是在相互接触。然而，从我们以前的研究中，我们证实，致密化样品的孔隙通道仍然是开放的，以几乎相同的表面积，同样的多孔性的多孔钛。25为了评价具有不同的起始孔隙率的致密化的样品中， z高度应该取决于初始孔隙率，以使致密化的样品具有相同的最终孔隙度而变化。 表2还提供了预测施加菌株获得目标，最终的Porosity具有不同的初始孔隙致密多孔支架（FP）。例如，以产生致密多孔试样FP = 5％，使用IP的多孔支架= 70％需要的大约0.7的菌株，而具有IP = 50％，支架需要大约0.5。因此，多孔支架的初始高度，根据以获得样品致密化之后的同一最终高度的初始孔隙被仔细计算。 如图3C所示，四个试样与来自IP不同的孔隙率= 40％〜70％显示不同的初始高度致密化之前，然后在结束时，以2mm几乎相同的高度。
GFP转用于可视化在涂层上的多孔（IP = 70％）和致密化的多孔钛（IP = 70％，FP = 7％）相比，商业致密Ti作为如图 4A所示的样品。所有这三个样本清晰地显示对应TH涂层表面形貌EIR的微观结构。的完全致密的Ti表面完全覆盖有绿色涂层，而多孔和致密化的多孔样品具有的绿色的Ti支柱具有明确的孔。利用图 4A中所示这三个涂层样品，释放行为观察（图4B）。从每个样品释放的GFP的量表示为平均值±标准偏差（n = 3）和被跟踪达一个月，通过测量荧光强度。既致密和多孔的Ti中发现有与初始爆裂效应快速GFP释放行为，与大多数一周内释放。然而，致密化的多孔钛示出连续释放长达一个月，甚至后一个月清楚表示GFP的表面上（ 图4B的 CLSM图像）。
致密化过程可以也可以应用到功能梯度多孔钛支架的制造如在图5中引入的两锅梯度结构的无穷区间设计电路图被选中，其中的圆筒形支架的内层和外层具有不同的孔隙率。 与图5A中所示的致密核心的结构，使Ti支架的外部部分通过机械加工被缩短，如图5B所示。较高的内部部分的选择性致密化后，得到的梯度结构。 图5BB和 5E的通过显微CT测量的详细的结构信息在表3中提供图5C所述的显微CT图像清楚地示出了具有不同的孔隙率（内支架的内层和外层部分：FP =〜60％，外： FP =〜70％）。可替代地，与致密外层的结构可以通过改变内部和外部部件（图5D）之间的高度差来制造。具有较高外，下内部分导致更致密Ô所述多孔钛uter部分后致密化（图5E），其中，所述外部部分的孔隙率降至〜45％，与具有保存初始孔隙率（IP = 70％），为在图5F中所示的内部部分。
图动态冷冻铸造1.制作钛莰烯坯体 。 （A）的动态冷冻套管过程中获得的示意图凝固的Ti-莰坯体热处理前（改编自爱思唯尔，荣格权限等 ，2013）。 （B）的有代表性的Ti-莰生坯完成动态冷冻铸造过程之后的光学图像。在Ti-莰生坯，其中固体莰相位是随机的连续的Ti粉末PHAS内分布（C）的横截面图像即请点击此处查看该图的放大版本。
图2.多孔钛支架与不同初始孔隙度热处理后 。 （A）一种完全烧结多孔的Ti块之前和加工和所获得的圆筒形多孔钛支架从加工后的光学图像。 （B）的多孔钛支架通过常规的冷冻浇铸（顶部）和动态冷冻浇铸（底）制造的截面显微CT图像。 图2B的顶部图像对黄色箭头指示在径向方向上的孔对准。 （c）该多孔钛支架由动态冷冻制造与初始孔隙率的70％（IP）的（顶部）铸造的截面图像，60％（中）和50％（下图），其中的插图是相应的多孔钛支架的光学图像（改编自爱思唯尔，荣格权限等 ，2013年）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3.浸涂和多孔钛支架致密化。（A）一种致密化多孔金属支架（Ti）的涂有生物分子（例如，绿色荧光蛋白）的制造工艺的示意图（改编自爱思唯尔，Jung等权限。 ，2015年）。 （B）中的致密化的多孔钛支架的横截面图（IP = 70％）在所施加的应变（εZZ）= 0，0.53，0.63，0.68，得到最终的孔隙率（FP = 70，33，19， 7％）。 （C 请点击此处查看该图的放大版本。
GFP的图4. 在 GFP-装致密多孔钛支架体外释放行为。（一）典型的激光共聚焦显微镜图像加载致密，多孔和致密的钛支架表面上。 （B）中从致密，多孔和致密的Ti释放累积量的GFP脚手架至29天（N = 3）与三个样品的CLSM图像浸没在PBS中24天（比例尺= 200微米）之后。标准偏差（SD）是我们ED每个数据点的描述性错误吧。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5.制造功能梯度多孔金属支架。的分级多孔支架设计更密的内部（ 一）示意图 。 （二）分级多孔钛支架与密集内部通过致密化制造。 （C）的2-D重建分级多孔的Ti支架的显微CT图像与致密内部部分。 （D）示意图的支架设计与密集外侧部分梯度孔隙度。 （ 五）分级多孔钛支架与密集外侧部分通过致密化制造，其中支架具有多孔的内部核心包围致密外层。 （F）2-D重建分级多孔钛支架与密集外侧部分的显微CT图像。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 目标样本 | 钛莰烯浆料 | 涂装解决方案 | |||
| 钛粉（G） | 莰烯（G） | KD-4（G） | GFP（毫升） | PBS（ml）的 | |
| 钛支架与IP = 40％ | 204.3 | 90 | 0.294 | 1 | 9 |
| 钛支架与IP = 50％ | 171.4 | 97 </ TD> | 0.268 | ||
| 钛支架与IP = 60％ | 136.5 | 103 | 0.239 | ||
| 钛支架与IP = 70％ | 100 | 110 | 0.21 | ||
表1的Ti莰浆料和涂布溶液为目标多孔钛支架（IP = 40，50，60，70％）涂覆有GFP的制造的详细信息。 （IP代表初始孔隙率）。
| 初始孔隙率（％） | 最终的孔隙率（％） | ||||||
| 60 | 50 | 40 | 三十 | 20 | 10 | 五 | |
| 50 | 0.17 | 0.29 | 0.38 | 0.44 | 0.47 | ||
| 60 | 0.20 | 0.33 | 0.43 | 0.50 | 0.56 | 0.58 | |
| 70 | 0.25 | 0.40 | 0.50 | 0.57 | 0.63 | 0.67 | 0.68 |
表2.预测外加应变多孔支架（εZZ）（IP = 50，60，70％），在目标的最终孔隙率（FP）使用等式FP = 1方面- （1- IP）/（1- εZZ）。
| 标本 | 致密化之前， | 致密化后， | |||||
| 高度（mm） | 孔隙率（％） | 孔的尺寸（微米） | 高度（mm） | 孔隙率（％） | 孔的尺寸（微米） | ||
| 内部 | 18±1 | 70±1 | 370±100 | 13±1 | 57±5 | 285±100 | |
| 外部分 | 14±1 | 70±5 | 365±110 | ||||
| 图分级支架。 5E | 内部 | 14±2 | 12±1 | 70±8 | 315±110 | ||
| 外部分 | 18±1 | 45±8 | 230±80 | ||||
表之前和致密化后分级多孔支架（图5B和图5E）的内部和外部部分中由显微CT测定的z高度，孔隙度和平均孔径的术语3.结构信息。
| 多孔钛的初始孔隙率（％） | 致密化之前， | 致密化后（FP = 5％） | ||
| 刚度（GPA） | 屈服强度（兆帕） | 刚度（GPA） | 屈服强度（兆帕） | |
| 50 | 19 | 143 | 44 | > 370 |
| 60 | 13 | 130 | 42 | > 370 |
| 70 | 五 | 58 | 35 | > 370 |
表4.刚度和多孔钛支架屈服强度（IP = 50，60，70％）之前和之后的致密化（改编自爱思唯尔，荣格权限。等，2015年）。
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Discussion
而biometal系统已被广泛地用于生物医学应用，特别是，作为承重材料，高刚度和金属的低生物活性已被视为重大的挑战。在这项研究中，我们建立了一个新的金属系统，致密多孔金属支架具有仿生机械性能以及生物活性表面与可持续释放行为的制造方法。我们的制作方法的主要优点包括：1）在前面的动态冷冻的铸造方法没有变化，我们已经开发，28 2）中的一个参数度的控制致密化-实现机械增强和从多孔生物分子的持续释放行为都金属支架和3）潜在的应用功能梯度材料。
之一的生产所需的致密化多孔金属的关键步骤是多孔钛，其具有两个重要功能个人的制造水库：1）延展性，以控制生物活性分子和机械性能的释放速率和2）高的孔互连性加载和释放的生物分子。然而，先前报道的多孔钛支架使用空间保持器方法制造，海绵模板法，和粉末冶金表明要么限定孔互连性或延展性。14,24,29尤其是，通过金属粉末与其它周围反应产生的杂质在热处理过程中的材料是已知的显著降低材料的延展性，因为金属粉末是在与第二材料相接触（例如，空间保持器或聚合物模板），导致下机械试验脆性破坏。14,24,29因此，为了制造致密的多孔金属，杂质需要被最小化对大多数的常规制造方法。为了避免这种麻烦，我们调查了多孔形态和力学行为Ø˚F多孔钛支架使用冷冻浇铸法用莰以尽量减少金属粉末和液相之间的相互作用制造。26,28,30-33
常规的冷冻铸造方法的缺点是，它经常导致定向孔隙通道（图2B，顶图）。另一方面，与动态冷冻浇铸，孔的形状和尺寸被发现是比常规冷冻浇铸的并且在支架内的孔分布几乎是随机的更均匀。从动态冷冻多孔支架的铸造显示各向同性机械性能，从而使压实在密闭模具单轴压力26,28在动态冷冻浇铸这些结构特征，所述金属浆料内出现两个主要事件：1）晶莰烯相的生长和2）再分配金属粉末和固化将剩余液相避免秒内莰edimentation。重力使金属粉末偏析直到液体莰被完全固化。邻近莰烯的熔融温度的浆料的连续旋转给出足够的时间，球形莰晶体均匀地生长，从而使随机和均匀分布的Ti粉末和莰烯结晶作为如图 1C所示。
以下的冷却过程中，完全固化，得到双相生坯（图1B）的Ti-莰。为了从固化生坯完全除去莰而不塌陷的结构，莰烯在-20℃下升华，在真空干燥器中。除去莰相后，将坯体变得多孔，仅由钛粉末。既然有钛粒子之间没有相互作用，多孔钛坯体是脆弱的，这样小心处理是必需的。为了避免任何直接处理生坯与热处理前手换货，陶瓷坩埚被选为生坯的容器冷冻干燥和烧结。与生坯的容器中的冷冻干燥和热处理在1300℃，这使得生坯是没有在金属支杆显著缺陷完全致密后，立即放入一个真空炉中。为样品的评价，多孔钛的块被切成更小的多孔钛汽缸由于多孔样品的几何形状和大小应该是相同的（图2A）。所有的试样成功地加工，没有任何显著缺陷（ 图2B和2C）。取决于钛功率的淤浆中的量，钛的支架与不同孔隙率与球形形状和随机分布的孔（图2C）产物。
后多孔钛支架采用动态冷冻铸造的方法，得到报道在我们以前的STU镝，28的生物分子包被在涂覆多孔钛的钛表面和致密化进行，如图3A所示。为了避免生物分子的任何污染或变性，涂层过程在24小时内于室温进行了净化台的多孔支架高压灭菌后，小心地清理。为了尽量减少致密化前的涂布生物分子的损失，清洗过程最小化，进行包衣过程后。致密化过程是由在z方向上的多孔钛样品所施加的变形的控制，转换成应变，εZZ 26根据钛支架的初始孔隙度，所施加的应变及相应的最终孔隙率变化（表2 ）。为了确保与不同的初始孔隙率的致密化的多孔支架具有相同的最终几何形状和大小，的是个人所施加应变双支架，计算和各样品的总样品高度（长度在z方向上），然后预测致密化之前。 图3D表示具有变化的孔隙率从个人多孔样品的不同的高度可能会导致与在相同最终高度致密多孔样品同样的最终孔隙度。
通过控制致密化的程度，所述致密化的多孔支架与延长释放涂覆生物分子的独特的机械行为。所施加的应变改变了多孔钛支架的两个重要参数：最后的孔隙率和孔尺寸。具有较低孔隙率的多孔支架表现出更高的刚度和强度。我们先前的研究报道了具有改进的强度致密多孔支架的应力-应变行为相比多孔钛（表4），以及显著降低刚度相比商业致密的Ti 26在这项研究中，我们还观察到第致密化的多孔的Ti与两个通过可视化检测GFP的涂布层的致密和多孔的Ti相比，如图4 E释放行为。此结果与我们先前的研究，26，其中，致密化的多孔支架具有显著改善释放行为一致的涂层材料，通过延长由于具有降低孔径支架的增加torturosity四个月释放时间。目前的30天释放测试清楚地显示了致密化的多孔钛在对比无GFP残余上是致密的或多孔的Ti表面的表面上的剩余的绿色荧光蛋白。
最后，该致密化方法应用于生产功能梯度多孔支架，其中，内和外部分有不同的孔隙率。为圆筒形的支架，分化的z的高度的内部和外部的部件可以很容易导致分级多孔支架，如图5。在图 5B中所示的多孔钛支架的内部部分所施加的应变（εZZ）是〜0.27，这产生了〜57％的最终的孔隙率，而没有应变施加到外部部分。另一方面，就在多孔钛支架在图5B的外部施加的应变（εZZ）是〜0.33，这产生了〜45％的最终孔隙度，而内部分几乎完好无损，保留初始孔隙率（表3）。然而，对于分级多孔支架两大挑战从该实验进行观察。首先，连续的内和外部分诱导不一致应力和支架内的应变分布;因此，致密化发生不均匀，其中围绕顶和底表面的区域较所述内表面周围致密。这种倾向是至关重要的，因为这两个部分的高度差增加。此外，分级波罗我们提供了更致密内部部分脚手架更难产生比与致密外部的支架，因为内部部件的致密化应进行，被限制与外部分，这导致在这两个部分内不均匀变形。要解决该梯度支架的不均匀增密，我们开发了能够在致密化过程进行装配两个单独的部分。即使在本文的最佳条件，以产生完美制造的梯度多孔结构尚未充分发现，在致密化工艺进行生产的分级结构的电位被很好证实。该梯度多孔结构的优化制造方法是正在进行，而作为进一步的工作，选择药物加载到分级结构将追究支架的功能性释放行为。
在这项研究中所提出的方法的优点包括：1）更好的MEC与良好的强度和2）延长生物活性更好的生物性能生物组织hanical兼容性。然而，其主要缺点之一是，无法通过金属支架的一个更好的骨 - 植入物界面的孔隙网络促进骨向内生长的缩小孔径。要解决此问题，分级孔隙结构已经被提出，其中，多孔和致密份共存;由此，多孔质部允许骨向内生长，而致密部件提供机械稳定性和延长的生物活性。因此，通过不同的结构设计功能梯度钛植入物将被制造和测试，特别是注重对骨整合的改善能力。此外，另一个限制应的植入物具有复杂的几何形状的制造。为了获得一个复杂形状的植入物（ 例如 ，股骨锥形增大），致密化后，需要额外的加工过程中，上施加两个主要的缺点最终产品：低效率和不经济的材料使用，因为多孔钛块的显著体积的过程中常常被除去，在加工过程中潜在的污染和涂覆生物分子的损失。改善在多孔钛支架具有复杂几何形状的制造过程正在进行。致密多孔金属支架可以应用于各种矫形应用中，例如，人工椎间盘置换，替换或者散装或多孔金属植入物，并且作为一个负载支持，以及作为药物载体。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Titanium powder | Alfa Aesar | #42624 | -325 mesh, 99.5% (metals basis) |
| Camphene | SigmaAldrich | #456055 | 95%, C10H16 |
| KD-4 | Croda | | Hypermer, polymeric dispersant |
| Phosphate Buffer Solution (PBS) | Welgene | ML 008-01 | |
| Green Fluorescent Protein (GFP) | Genoss Co. | - | >98% purity, 1 mg/ml |
| Ball mill oven | SAMHENUG ENERGY | SH-BDO150 | |
| Freeze dryer | Ilshin Lab. | PVTFD50A | |
| Cold isostatic pressing (CIP) machine | SONGWON SYSTEMS | CIP 42260 | |
| Vaccum furnace | JEONG MIN INDUSTRIAL | JM-HP20 | |
| electical chaege machine | FANUC robocut | 0iB | External use |
| Press machine | CG&S | AJP-200 | |
| Confocal laser scanning spectroscopy (CLSM) | Olympus | FluoView FV1000 | External use |
References
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