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Bioengineering

Fabbricazione di meccanicamente Tunable e Bioactive metallo Ponteggi per applicazioni biomediche

doi: 10.3791/53279 Published: December 8, 2015

Introduction

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Mentre biomateriali metallici sono stati ampiamente utilizzati come protesi portanti e dispositivi di fissaggio interni a causa della loro ottima resistenza meccanica e la resistenza, 1-3 coinvolgono due sfide cruciali: 1) non corrispondente meccanico perché i metalli sono molto più rigido rispetto ai tessuti biologici, provocando danni indesiderati ai tessuti circostanti e 2) bassa bioattività che spesso si traduce in scarsa interfaccia con i tessuti biologici, spesso provocando reazioni da corpo estraneo (ad esempio, infiammazione o trombosi). 4-6 ponteggi metallici porosi sono state proposte per promuovere la crescita ossea nelle strutture, migliorando . contatto osso-impianto, mentre gli effetti dello scudo di stress vengono soppressi a causa della loro rigidità ridotta 7-9 Inoltre, varie modifiche di superficie sono stati applicati per migliorare le attività biologiche di impianti metallici; tali modifiche comprendono il rivestimento della superficie metallica con molecole bioattive (ad esempio, la crescita factori) o farmaci (ad esempio, vancomicina, tetracicline). 10-12 Tuttavia, problemi come la riduzione delle proprietà meccaniche dei ponteggi metallici porosi, diminuito la rigidità e il rilascio veloce degli strati di rivestimento bioattivi restano irrisolti. 13-16

In particolare, titanio (Ti) e leghe di Ti sono uno dei più diffusi sistemi Biometal causa delle loro eccellenti proprietà meccaniche, stabilità chimica e buona biocompatibilità. 13,17-19 loro applicazioni a forma di schiuma hanno attirato un crescente interesse perché il 3D reti porosi promuovere crescita ossea in aggiunta alle proprietà meccaniche simile all'osso. 20-22 sforzi sono stati fatti per migliorare le proprietà meccaniche sviluppando nuove tecniche di produzione inclusi replica di spugna polimerica, sinterizzazione di particelle metalliche, prototipazione rapida metodo (RP), e Metodo titolare spazio per controllare le varie caratteristiche dei pori (ad esempio, la frazione dei pori,forma, dimensione, di distribuzione, e la connettività) e proprietà dei materiali (ad esempio, di fase metallici e impurità). 23-25 ​​Recentemente, il casting congelamento dei a base di acqua metallo liquami ha guadagnato una notevole attenzione per la produzione di forme avanzate meccanicamente TI con pori ben allineati strutture, utilizzando la unidirezionale ghiaccio crescita dei dendriti durante la solidificazione; tuttavia, la contaminazione di ossigeno causata dal contatto di polveri di metallo con l'acqua richiede una particolare attenzione per ridurre al minimo la fragilità di ponteggi Ti. 14,15

Pertanto, abbiamo sviluppato un nuovo approccio verso la fabbricazione di impalcature Ti porosi bioattive e meccanicamente accordabili. 25 Le impalcature hanno inizialmente strutture porose con una porosità superiore al 50%. Gli scaffold porosi fabbricati sono stati rivestiti con molecole bioattive e poi compressi utilizzando una pressa meccanica in cui la porosità finale, proprietà meccaniche e comportamenti rilascio del farmaco erano controllati dal appliceppo ed. Gli impianti addensate Ti porosi hanno dimostrato bassa porosità con buona resistenza nonostante la bassa rigidità paragonabile a quella dell'osso (3-20 GPa). 2 A causa dello strato di rivestimento, la bioattività del addensato porosa Ti è significativamente migliorata. Inoltre, a causa delle particolari strutture a pori piane indotte dal processo di densificazione, le molecole bioattive rivestiti sono stati osservati essere gradualmente rilasciato dal ponteggio, mantenendo la loro efficacia per un periodo prolungato.

In questo studio, abbiamo introdotto il nostro metodo stabilito per fabbricare densificati scaffold Ti porosi per uso potenziale in applicazioni biomediche. Il protocollo include colata congelamento dinamico con fanghi metallo e densificazione di scaffold porosi. In primo luogo, per fabbricare scaffold porosi TI con buona duttilità è stato introdotto il metodo freeze fusione dinamica come mostrato nella Figura 1A. Polvere ti è stata dispersa in camphene liquido; quindi, diminuendo la temperatura,la fase liquida è solidificato, causando la separazione di fase tra la rete polvere Ti e cristalli canfene solidi. Successivamente, il corpo verde solidificato Ti-canfene stato sinterizzato in cui le polveri di Ti sono stati condensati con continue puntoni Ti, e la fase canfene stato completamente rimosso per ottenere una struttura porosa. Il rivestimento e processo densificazione con scaffold porosi ottenuti è stato impiegato, variando il grado di addensamento e porosità iniziale. Lo strato di rivestimento ed il suo comportamento rilascio sono stati visualizzati e quantificati tramite la proteina fluorescente verde (GFP) Rivestiti poroso Ti con e senza densificazione rispetto alla GFP rivestite denso Ti. Infine, impalcature Ti funzionalmente graduati che hanno due diverse strutture porose sono stati proposti e dimostrate variando il grado di addensamento delle parti interne ed esterne dei scaffold porosi.

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Protocol

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1. Realizzazione di metallo poroso Ponteggi

  1. Preparare fanghi Ti-canfene mescolando disponibile in commercio in polvere Ti, canfene, e KD-4 dopo aver valutato l'ammontare adeguato di materiali come descritto nella tabella 1 per porosi ponteggi TI con quattro porosità iniziale (40, 50, 60, e 70). Versare fanghi in 500 ml di polietilene (PE) e ruotare le bottiglie bottiglie a 55 ° C per 30 minuti in un forno di macinazione a 30 rpm.
  2. Versare fanghi dalle bottiglie PE in alluminio cilindrico (Al) stampi con un diametro di 60 mm ed un'altezza di 60 mm. Sigillare ogni stampo Al con la corrispondente copertura di slittamento Al e ruotare gli stampi in forno di macinazione ad una velocità di 30 giri al minuto a 55 ° C per 10 min.
    1. Successivamente, diminuire la temperatura del forno di macinazione a 44 ° C, e continuamente ruotare gli stampi ad una velocità di 30 giri al minuto a temperatura costante di 44 ° C per 12 ore.
  3. Togliere lo stampo dal palla-mulino forno dopo inoltre ruotare gli stampi a temperatura ambiente per 1 ora per il processo di raffreddamento. Rimuovere il titanio / canfene corpo verde solidificato dallo stampo di Al con un pistone di Al.
  4. Posizionare il titanio / canfene corpo verde solidificato in un sacchetto di gomma a mano e completamente sigillare il sacchetto di gomma legando la bocca del sacco con una stringa. Posizionare il sacchetto di gomma nel serbatoio di una pressatura isostatica (CIP) Macchina fredda e applicare una pressione isostatica di 200 MPa per 10 min. Rimuovere il corpo verde compressa dal sacchetto di gomma.
  5. Trasferire il corpo verde Ti-canfene su un crogiolo di allumina a mano e posizionare il crogiolo nella macchina liofilizzatore. Liofilizzare il corpo verde sublimare fase canfene nel corpo verde a - 40 ° C per 24 ore.
  6. Successivamente, chiudere il crogiolo con una copertura di slittamento allumina e posizionare il crogiolo chiuso in un forno sotto vuoto (inferiore a 10 -6 Torr) a temperatura ambiente. Quindi, aumentare la temperatura del forno a 1300 ° C ad un riscaldamento rate di 5 ° C / min e mantenere la temperatura a 1300 ° C per 2 ore.
  7. Dopo il trattamento termico, mantenere la sinterizzato poroso Ti nel forno per 6-7 ore finché il forno è completamente raffreddata a RT.
    Nota: Durante 6 hr del processo di raffreddamento, la velocità di raffreddamento media del forno sopra 400 ° C è di ~ 15 ° C / min e la velocità di raffreddamento media del forno inferiore a 400 ° C è ~ 2 ° C / min.
  8. Se necessario, tagliare il blocco di sinterizzato poroso Ti in campioni a forma di disco con un diametro di 16 mm mediante elettroerosione (EDM). 27
    Nota: A seconda delle dimensioni degli stampi Al, la dimensione del sinterizzato poroso Ti deve essere modificata durante il processo di lavorazione (Figura 2A).
  9. Posizionare un bicchiere di vetro con i campioni porosi Ti in autoclave e sterilizzare i campioni a 121 ° C per 15 min. Rimuovere i campioni dall'autoclave. Lavare i campioni porosi TI con acqua distillata e quindi due volte con etanolo al 70% per due volte.Infine, lasciare la porosa Ti in una capsula di Petri e aria asciugare i campioni a temperatura ambiente su una panchina pulita sotto raggi UV.

2. Immergere Rivestimento di impalcature con gli agenti bioattivi

  1. Diluire il commerciale verde Fluorescence Protein (GFP) da 1 mg / ml a 100 pg / ml in un banco pulito mescolando 1 ml di GFP con 9 ml di soluzione di Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS, pH 7.4) in 10 ml-sterilizzati polistirene (PS) tubo come indicato nella Tabella 1.
  2. Immergere il sterilizzato densa o porosa Ti in 10 ml di soluzione diluita GFP (100 mcg / ml) ponendo i campioni di Ti nel tubo PS con la soluzione GFP a RT e mettendo su un banco pulito.
  3. Posizionare il tubo PS in un essiccatore a vuoto ed evacuare l'essiccatore per 10 minuti per assicurare la soluzione GFP penetra più efficacemente i pori del porosa Ti.
  4. Rimuovere il titanio poroso dal tubo di PS con una pinzetta. Posizionare la GFP rivestite poroso Ti in un diametro di 10 centimetri Pepiatto tri e asciugare O / N a RT su un banco pulito.
  5. Sciacquare la porosa Ti due volte con 10 ml di Dulbecco tampone fosfato (DPBS) in un bicchiere di vetro, e spostare il porosa Ti in un diametro di Petri piatto 10 centimetri con una pinzetta e aria secca a temperatura ambiente su una panchina pulita.

3. densificazione porosi Ponteggi

  1. Porre i campioni Ti porosi GFP rivestite con diverse altezze in uno stampo cilindrico di acciaio, e inserire una serie di punzoni nei fori superiori e inferiori dello stampo in acciaio (Figura 3A).
  2. Comprimere il porosa Ti nell'assieme stampo di acciaio a temperatura ambiente nella direzione z del campione (Figura 3A) utilizzando una pressa a velocità di deformazione intermedie di 0,05 ~ 0,1 sec -1 contro le sollecitazioni applicate predeterminati illustrati nella Tabella 2. Tenere la pressione per 1 min prima di scarico.
  3. Rimuovere i campioni Ti densificati dallo stampo in acciaio. Lavare i campioni addensate due volte con 10 ml di DPBSin un becher e asciugare O / N a RT su un banco pulito.

4. Prova Rilascio di Ponteggi GFP rivestite

  1. Immergere tre tipi di campioni (GFP rivestite denso Ti (dopo i passaggi da 2), rivestito GFP-poroso Ti (dopo i punti 1 e 2) e GFP-rivestito addensato poroso Ti (dopo i passi 1-3)) in 5 ml DPBS (pH 7.4) soluzione contenuta in una provetta da 10 ml sterilizzato PS a 37 ° C su un banco pulito.
  2. Aspirazione su tutta la soluzione DPBS da ciascuna provetta PS con il campione GFP rivestite e riempite con una soluzione nuova 5 ml DPBS (pH 7,4) usando una pipetta secondo i tempi prestabiliti di 1, 2, 3, 5, 8, 12, 15, 22 e 29 giorni dopo l'immersione.
  3. Prendete le immagini di fluorescenza dei campioni GFP rivestite prima immersione (giorno 0) e dopo 22 giorni-immersion utilizzando la spettroscopia confocale a scansione laser (CLSM).
  4. Misurare l'intensità del segnale di fluorescenza della GFP rilasciato in 1 ml di soluzione da un totale di 5 ml di soluzione DPBS disegnata da ciascuna provetta PS nella sezione 4.2 usandoSpettroscopia UV alla lunghezza d'onda di 215 nm. Convertire il valore di intensità nella concentrazione della soluzione GFP utilizzando la curva standard.
    Nota: Prima della misurazione, tracciare la curva standard di soluzione GFP misurando l'intensità segnale di fluorescenza della soluzione GFP in un intervallo di concentrazione da 0 ng / ml - 10 mg / ml.

5. Realizzazione di Graded porosi Ti Ponteggi

  1. Produrre un blocco del sinterizzato poroso Ti ripetendo il punto 1.1 al punto 1.7.
  2. Macchina del blocco poroso sinterizzato Ti secondo i disegni struttura predeterminata (ad esempio, la figura 5a e 5d) di EDM.
  3. Porre i campioni lavorati TI con distribuzione dell'altezza in uno stampo in acciaio, dove il diametro porosa Ti è ~ 0,1 mm inferiore al diametro dello stampo e inserire una serie di punzoni nei fori superiori e inferiori dello stampo in acciaio.
  4. Eseguire i passi 3.2 e 3.3.

6. porosità Measurement di Ti Ponteggi

  1. Misurare la massa (m s) di ponteggi Ti.
  2. Calcolare il volume apparente (V s), misurando la lunghezza, la larghezza e l'altezza di scaffold Ti.
  3. Calcolare la porosità utilizzando la seguente equazione:
    Equazione 1
    dove P è la percentuale totale di porosità, ρ Ti è la densità teorica del titanio e m S / V S è la densità misurata del campione.
    Nota: La porosità dei campioni di Ti può essere recuperato direttamente dalle immagini microCT dopo l'imaging microCT viene effettuata utilizzando una tomografia scanner micro-calcolata.

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Representative Results

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Il processo di fabbricazione utilizzata per produrre scaffold porosi Ti è illustrato nella Figura 1A. Polvere di Ti è mantenuto disperso omogeneamente in canfene dalla rotazione continua del contenitore a 44 ° C per 12 ore e, mentre canfene liquido è completamente solidificato, eventuali sedimenti di relativamente pesante polvere Ti possono essere minimizzati. Come risultato, il corpo verde omogeneo Ti-canfene stato prodotto utilizzando il processo di congelamento colata dinamica come mostrato nella Figura 1B, in cui 3-dimensionalmente interconnessi grandi pori canfene sono circondati dalla fase polvere Ti (Figura 1C). Tuttavia, la rotazione non corretta dei contenitori si traduce spesso in una distribuzione non omogenea di Ti e fasi canfene nel corpo verde, causando la distorsione o screpolature della scaffold poroso seguente trattamento termico. La condizione ottimale della velocità di rotazione è risultato essere 30 rpm, che era in grado di produrre un corpo verde omogeneo nella maggioranza dei casi. Prima di procederere con trattamento termico, la crescita estensiva di canfene è confermato osservando la sezione trasversale del corpo verde Ti-canfene come mostrato nella Figura 1C. Se la fase canfene è discontinuo con una distribuzione di dimensione significativa dei pori, la temperatura ed il tempo del getto congelamento dinamico deve essere resettato. Tipicamente, è stata trovata la fase canfene dei corpi verdi Ti-canfene essere ben sviluppata dopo 12 ore di congelamento dinamico di colata, in cui la fase canfene divenne continuo dal grandi pori sferici sono in contatto tra loro. Le dimensioni, la morfologia e la connettività di pori in poroso Ti sono state ulteriormente valutate analisi micro-CT dopo il trattamento termico.

Dopo sinterizzazione a 1300 ° C, i blocchi Ti porosi vengono tagliati in campioni multipli di forma cilindrica per elettroerosione (Figura 2A). I provini cilindrici ottenuti non mostrano crepe o difetti. Rappresentante immagini micro-TC del Porous impalcature Ti fabbricati da convenzionale (in alto) e congelare dinamica casting (in basso) sono illustrati nella Figura 2B. La struttura dei pori dei campioni Ti dal gelo getto convenzionale mostra allineamento pori direzionale con pori di forma irregolare a causa della crescita dendritica di canfene durante il congelamento. D'altra parte, il campione dalla colata freeze dinamica presenta pori quasi sferiche con distribuzione dei pori casuale. Inoltre, maggiore risoluzione delle immagini microscopiche scaffold Ti poroso con diverse porosità (Porosità iniziale (IP) = 50, 60, e 70% vol) mostrano chiaramente pori sferici distribuiti in modo casuale all'interno della rete Ti (Figura 2C). La dimensione dei pori di scaffold porosi Ti diminuito il volume di canfene diminuito.

Successivamente, i ponteggi Ti porosi fabbricati sono rivestite con biomolecole e densificato all'interno dello stampo variando la tensione applicata come mostrato nella Figura 3A. Per la visualization dello strato di rivestimento bioattivo sui campioni di Ti, proteina fluorescente verde (GFP) è stato utilizzato in questo studio. La deformazione applicata (ε zz), che corrisponde alla pressione (P zz), si trova a variare il grado di addensamento, come mostrato nella Figura 3B. La forma dei pori appiattimento come aumenta il grado di addensamento e, di conseguenza, alla massima densificazione, pori quasi scomparire perché pori confinanti sono in contatto tra loro. Tuttavia, dal nostro studio precedente, abbiamo confermato che i canali dei pori dei campioni addensate sono ancora aperti, con quasi la stessa superficie come quella del porosa Ti della stessa porosità. 25 Per valutare i campioni addensate con diverse porosità partenza, la z-altezza dovrebbe variare a seconda della porosità iniziale per per il campione densificato avere la stessa porosità finale. Tabella 2 fornisce inoltre le sollecitazioni applicate previsti avere la p finali miratiorosity (FP) degli scaffold porosi addensate con diverse porosità iniziali. Ad esempio, per produrre i campioni porosi addensate con FP = 5%, lo scaffold poroso con IP = 70% richiede un ceppo di circa 0,7, mentre il ponteggio con IP = 50% necessita di circa 0,5. Pertanto, le altezze iniziali dei scaffold porosi sono stati accuratamente calcolati in funzione della porosità iniziale per ottenere campioni con la stessa altezza finale dopo densificazione. Come mostrato in Figura 3C, quattro campioni con diverse porosità da IP = 40% al 70% mostrano diverse altezze iniziali prima della densificazione e poi alla fine, con altezze quasi identiche di 2 mm.

GFP è stato utilizzato per visualizzare lo strato di rivestimento sulla poroso (IP = 70%) e densificato poroso Ti (IP = 70%, FP = 7%) rispetto ai campioni commerciali Ti denso come mostrato in Figura 4A. Tutti e tre i campioni mostrano chiaramente la morfologia della superficie rivestita corrispondente a thmicrostrutture EIR. La superficie completamente densa Ti è completamente ricoperto da uno strato di rivestimento verde, mentre i campioni porosi porosi e addensate hanno colore verde Ti pavoneggia con pori chiaro. Utilizzando questi tre campioni rivestiti mostrati nella Figura 4A, è stato osservato il comportamento di rilascio (Figura 4B). La quantità di GFP rilasciata da ciascun campione è stata espressa come media ± deviazione standard (n = 3) ed è stata monitorata fino a un mese misurando l'intensità della fluorescenza. Sia densa e porosa Ti sono stati trovati ad avere un comportamento rilascio GFP veloce con effetto iniziale di rottura, con la maggior parte rilasciato entro una settimana. Tuttavia, addensato poroso Ti presenta rilascio continuo fino a un mese, mostrando chiaramente GFP in superficie anche dopo un mese (immagini CLSM di figura 4B).

Il processo di densificazione può essere applicato anche alla fabbricazione di funzionalmente graduati scaffold Ti porosi come introdotto nella Figura 5. I due potschemi progettuali prefe- strutture gradiente sono stati scelti, i cui strati interni ed esterni di un ponteggio cilindrica hanno differenti porosità. Per la struttura con un nucleo denso mostrato in Figura 5A, la parte esterna del ponteggio Ti è stato ridotto di lavorazione meccanica, come illustrato nella Figura 5B. Dopo densificazione selettiva della parte interna superiore, la struttura del gradiente è stato ottenuto. Le informazioni strutturali dettagliate delle figure 5BB e 5E misurata dal micro CT è fornita in Tabella 3 L'immagine micro CT della Figura 5C mostra chiaramente le parti interne ed esterne del ponteggio con diverse porosità (interno:. FP = ~ 60%, esterno: FP = ~ 70%). In alternativa, una struttura con strato esterno più denso può essere prodotto modificando il dislivello tra le parti interne ed esterne (Figura 5D). Il Ti porosa con le parti superiori e inferiori esterne interne risultati in una o più densoparte uter dopo densificazione (Figura 5E), in cui la porosità della parte esterna è stata abbassata a ~ 45%, con la parte interna avente porosità iniziale conservato (IP = 70%), come indicato in Figura 5F.

Figura 1
Figura 1. Fabbricazione di Ti-canfene corpo verde mediante colata blocco dinamico. (A) Rappresentazione schematica del processo di rivestimento blocco dinamico per ottenere Ti-canfene corpo verde solidificato prima del trattamento termico (Adattato su autorizzazione di Elsevier, Jung et al., 2013). (B) di una immagine ottica Ti-canfene corpo verde rappresentante dopo il completamento del processo di congelamento colata dinamico. Immagine (C) a sezione trasversale del corpo Ti-canfene verde in cui la fase solida viene canfene distribuito casualmente all'interno delle continue PHA polvere Tie. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 1
Figura 2. scaffold porosi Ti con varie porosità iniziali dopo il trattamento termico. (A) le immagini ottiche di un blocco completamente sinterizzato poroso Ti prima e dopo la lavorazione e un cilindrico poroso Ti patibolo ottenuto dalla lavorazione. (B) sezionali immagini micro-TC dei ponteggi Ti porosi fabbricati da congelamento convenzionale casting (in alto) e dinamica freeze fusione (in basso). Frecce gialle sull'immagine superiore della Figura 2B indicano l'allineamento dei pori nella direzione radiale. (C) immagini trasversali degli scaffold Ti porosi ottenuti mediante congelamento dinamico colata con la porosità iniziale (IP) del 70% (in alto), 60%(al centro) e il 50% (in basso), dove inserti sono le immagini ottiche delle corrispondenti scaffold Ti porosi (Adattato con il permesso di Elsevier, Jung et al., 2013). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 1
Figura 3. Dip-rivestimento e densificazione di porosi ponteggi Ti. (A) Rappresentazione schematica del processo di fabbricazione di un addensato porosa ponteggio metallico (Ti) rivestito con biomolecole (ad esempio, GFP) (Adattato con il permesso di Elsevier, Jung et al. , 2015). (B) le immagini delle sezioni trasversali delle addensate scaffold Ti porosi (IP = 70%) alla tensione applicata (ε zz) = 0, 0.53, 0.63, 0.68, con conseguente porosità finale (FP = 70, 33, 19, 7%). (C Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 1
Figura 4. In comportamento di rilascio vitro densificati scaffold porosi Ti GFP-caricato. (A) immagini tipiche CLSM di GFP caricate sulla superficie di dense, porosi e densificati ponteggi Ti. (B) Importi cumulativi di GFP rilasciati da densa, porosa e densificazione Ti ponteggi fino a 29 giorni (n = 3) con le immagini CLSM di questi tre campioni dopo immersione in PBS per 24 giorni (scala bar = 200 micron). Deviazione standard (SD) è noied per la barra di errore descrittive di ogni punto di dati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 1
Figura 5. Realizzazione di ponteggi metallici funzionalmente graduati poroso. (A) Schema di un disegno impalcatura porosa classificato con una parte interna più densa. (B) Graded poroso Ti patibolo con la parte interna più densa fabbricato attraverso densificazione. Immagine di micro-CT graduata poroso Ti scaffold (C) 2-D ricostruito con la parte interna più densa. (D) Schema di un disegno scaffold con porosità gradiente con la parte esterna più densa. (E) Graded poroso Ti scaffold con la parte esterna densa fabbricata attraverso densificazione in cui il ponteggio possiede un nucleo interno porosacircondata dallo strato esterno addensato. Micro-CT immagine di graduato poroso impalcatura Ti con la parte esterna più densa (F) 2-D ricostruita. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Campione mirato Ti-canfene liquami Soluzione Coating
Ti polvere (g) Canfene (g) KD-4 (g) GFP (ml) PBS (ml)
Ti patibolo con IP = 40% 204.3 90 0,294 1 9
Ti patibolo con IP = 50% 171.4 97 </ td> 0,268
Ti patibolo con IP = 60% 136.5 103 0,239
Ti patibolo con IP = 70% 100 110 0.21

Tabella 1. Informazioni dettagliate di Ti-canfene slurry e soluzione di rivestimento per la fabbricazione di bersaglio porosi scaffold Ti (IP = 40, 50, 60, 70%) ricoperti con GFP. (IP sta per porosità iniziale).

Porosità iniziale (%) Porosità finale (%)
60 50 40 30 20 10 5
50 0.17 0.29 0.38 0.44 0.47
60 0.20 0,33 0.43 0.50 0.56 0.58
70 0.25 0.40 0.50 0.57 0.63 0.67 0.68

Tabella 2. Predicted deformazione applicata (ε zz) di scaffold porosi (IP = 50, 60, 70%) in termini di porosità finale mirata (FP) utilizzando l'equazione, FP = 1 - (1- IP) / (1- ε zz).

fig. 5b
Campione Prima della densificazione Dopo densificazione
Altezza (mm) Porosità (%) Dimensione dei pori (micron) Altezza (mm) Porosità (%) Dimensione dei pori (micron)
Parte interna 18 ± 1 70 ± 1 370 ± 100 13 ± 1 57 ± 5 285 ± 100
Parte esterna 14 ± 1 70 ± 5 365 ± 110
Impalcatura Graded di fig. 5e Parte interna 14 ± 2 12 ± 1 70 ± 8 315 ± 110
Parte esterna 18 ± 1 45 ± 8 230 ± 80

Tabella 3. Le informazioni strutturali delle parti interne ed esterne di scaffold porosi graduati (Figura 5B e Figura 5E) prima e dopo addensamento in termini di z-altezza, porosità e dimensione media dei pori misurata da micro-CT.

Porosità iniziale poroso Ti (%) Prima della densificazione Dopo densificazione (FP = 5%)
Rigidità (GPa) Snervamento (MPa) Rigidità (GPa) Snervamento (MPa)
50 19 143 44 > 370
60 13 130 42 > 370
70 5 58 35 > 370

Tabella 4. Rigidità e resistenza allo snervamento di porosi impalcature Ti (IP = 50, 60, 70%) prima e dopo densificazione (Adattato su autorizzazione di Elsevier, Jung et al., 2015).

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Discussion

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Mentre i sistemi Biometal sono stati ampiamente utilizzati per applicazioni biomediche, in particolare, come materiali portanti, elevata rigidità e bassa bioattività dei metalli sono stati considerati come grandi sfide. In questo studio, abbiamo stabilito il metodo di fabbricazione di un nuovo sistema di metallo, una impalcatura metallo poroso addensato che ha biomimetici proprietà meccaniche e di superficie bioattiva con comportamento rilascio sostenibile. I principali vantaggi del nostro metodo di fabbricazione includono 1) nessun cambiamento nel metodo di fusione di congelamento dinamico precedente, che abbiamo già sviluppato, 28 2) il controllo di un parametro grado di densificazione-per ottenere sia la valorizzazione meccanica e il comportamento rilascio sostenibile delle biomolecole da porosa ponteggi metallici e 3) potenziale applicazione a materiali classificati funzionalmente.

Una delle fasi critiche necessarie per produrre il metallo poroso densificato è la fabbricazione di porosa Ti, che possiede due importanti features: 1) la duttilità per controllare la velocità di rilascio di molecole bioattive e le proprietà meccaniche e 2) ad alta porosità interconnettività per caricare e rilasciare biomolecole. Tuttavia, precedentemente riportato scaffold porosi di titanio prodotte con il metodo titolare spazio, metodo template spugna e metallurgia delle polveri hanno dimostrato sia interconnettività poro limitato o duttilità. 14,24,29 In particolare, le impurità create dalla reazione di polveri metalliche con altri circostanti materiali durante il processo di trattamento termico sono noti per ridurre significativamente la duttilità del materiale perché polveri metalliche sono in contatto con il secondo materiale (ad esempio, titolare spazio o template polimero), con conseguente rottura fragile sotto test meccanici. 14,24,29 Così , per fabbricare densificato metallo poroso, le impurità devono essere ridotti al minimo per la maggior parte dei metodi di fabbricazione convenzionali. Per evitare questa complicazione, abbiamo studiato la morfologia porosa e comportamenti meccanici of scaffold porosi di titanio fabbricati usando il metodo di colata con freeze canfene in modo da minimizzare l'interazione tra polveri metalliche e la fase liquida. 26,28,30-33

Uno svantaggio del metodo freeze fusione convenzionale è che spesso si traduce in pori canali direzionali (Figura 2B, immagine in alto). D'altra parte, con colata congelamento dinamico, la forma e le dimensioni dei pori sono risultati più uniformi rispetto a quelli del blocco colata convenzionale e la distribuzione dei pori nell'intervallo scaffold è quasi casuale. . Queste caratteristiche strutturali di scaffold porosi di congelamento dinamico colata spettacolo isotropo comportamento meccanico, consentendo così densificazione in uno stampo confinato sotto pressione uniassiale 26,28 Durante il casting blocco dinamico, due importanti eventi si verificano all'interno della poltiglia del metallo: 1) la crescita di cristalli della fase canfene e 2) la ridistribuzione di polveri metalliche e solidificato canfene nel restante evitando s fase liquidaedimentation. La gravità fa sì che le polveri di metallo per separare fino a quando il canfene liquido è completamente solidificato. La rotazione continua del fango vicino alla temperatura di fusione del canfene dà il tempo sufficiente per cristalli canfene sferici a crescere omogeneamente, consentendo la distribuzione casuale e uniforme delle polveri di Ti e cristalli canfene come mostrato nella Figura 1C.

Dopo il processo di raffreddamento, completamente solidificato Ti-canfene bifasico corpo verde (Figura 1B) è stata ottenuta. Al fine di rimuovere completamente il canfene dal corpo verde solidificato senza collassare la struttura, canfene stato sublima in un essiccatore sotto vuoto a -20 ° C. Dopo la rimozione della fase canfene, il corpo verde divenne porosa, formato unicamente polvere Ti. Poiché non vi è alcuna interazione tra le particelle di Ti, il corpo verde Ti poroso è fragile così è necessario che una gestione attenta. Per evitare qualsiasi manipolazione diretta del corpo verde con le mani prima di trattamento termicozione, un crogiolo ceramico è stata scelta per il contenitore del corpo verde per liofilizzazione e sinterizzazione. Il contenitore con il corpo verde è stato posto in un forno sotto vuoto immediatamente dopo la liofilizzazione e trattamento termico a 1300 ° C, che permette al corpo verde sia pienamente addensato senza difetti significativi di montanti metallici. Per la valutazione dei campioni, blocchi Ti porosi sono stati tagliati in piccoli cilindri porosi Ti perchè la geometria e le dimensioni dei campioni porosi devono essere identici (Figura 2A). Tutti i campioni sono stati lavorati con successo senza difetti significativi (figure 2b e 2c). A seconda della quantità di potenza Ti nella poltiglia, scaffold TI con diverse porosità sono stati ottenuti con forme sferiche e pori distribuiti casualmente (Figura 2C).

Dopo i ponteggi Ti porosi sono stati ottenuti con il metodo di colata congelamento dinamico come riportato nel nostro precedente study, 28 biomolecole sono state rivestite in superficie Ti e densificazione del poroso rivestito Ti è stata eseguita come illustrato nella Figura 3A. Per evitare qualsiasi contaminazione o denaturazione delle biomolecole, il processo di rivestimento è stato condotto su un banco pulito a RT entro 24 ore dopo le scaffold porosi sono stati sterilizzati in autoclave e accuratamente ripulito. Per ridurre al minimo la perdita delle biomolecole rivestite prima della densificazione, il processo di pulizia è stato minimizzato dopo l'esecuzione del processo di rivestimento. Il processo di densificazione era controllata dalla deformazione applicata dei campioni porosi Ti nella direzione z, trasformato in ceppo, ε zz. 26 A seconda della porosità iniziale dei ponteggi Ti, il ceppo applicata e corrispondente porosità finale erano varia (Tabella 2 ). Per garantire scaffold porosi addensate con differenti porosità iniziali avuto geometrie e dimensioni finali identici, la deformazione applicata del individual ponteggi è stato calcolato e l'altezza totale del campione (lunghezza in direzione z) di ogni campione è stato poi previsto prima della densificazione. Figura 3D indica che diverse altezze dei singoli campioni porosi con diverse porosità potrebbero portare al campione poroso densificazione in altezza finale identica al stesso porosità finale.

Controllando il grado di addensamento, scaffold porosi addensate hanno un comportamento meccanico unico con rilascio prolungato delle biomolecole rivestiti. Il ceppo applicata cambia due parametri importanti dei ponteggi Ti porosi: porosità finale e la dimensione dei pori. Le impalcature porose con minore porosità mostrano una maggiore rigidità e resistenza. Il nostro studio precedente ha segnalato il comportamento sforzo-deformazione di scaffold porosi densificati con una maggiore resistenza rispetto al poroso Ti (Tabella 4) e significativamente ridotto la rigidità rispetto al commerciale denso Ti. 26 In questo studio, abbiamo anche osservato °comportamento e rilascio di densificato poroso Ti rispetto sia densa e porosa Ti attraverso il rilevamento visualizzato dello strato GFP-coating, come mostrato in Figura 4. I risultati erano coerenti con il nostro studio precedente, 26 nelle quali scaffold porosi addensate possiedono significativamente migliorato comportamento rilascio di materiali rivestiti, prolungando il tempo di rilascio fino a quattro mesi a causa di un aumento torturosity degli scaffold con dimensioni dei pori diminuiti. La prova 30 giorno release corrente mostra chiaramente la GFP che rimane sulla superficie del addensato porosa Ti in contrasto con alcun residuo GFP sia su superfici Ti dense o porose.

Infine, il metodo densificazione è stato applicato alla produzione di scaffold porosi funzionalmente graduati in cui le parti interne ed esterne hanno differenti porosità. Per l'impalcatura cilindrica, differenziando le z-altezze delle parti interne ed esterne può facilmente portare a scaffold porosi classificati come mostrato nella Figura 5. La deformazione applicata (ε zz) sulla parte interna del porosa scaffold Ti mostrato nella Figura 5B è ~ 0,27, che ha provocato la porosità finale del ~ 57%, mentre nessun ceppo è stato applicato alla parte esterna. D'altra parte, la tensione applicata (ε zz) sulla parte esterna nella porosa scaffold Ti in Figura 5B è ~ 0,33, che ha provocato la porosità finale del ~ 45% mentre la parte interna era quasi intatto, preservando la porosità iniziale (Tabella 3). Tuttavia, due grandi sfide per i ponteggi porosi graduati sono stati osservati da questo esperimento. Innanzitutto, le parti interne ed esterne continue sollecitazioni indotte incoerente e distribuzione delle deformazioni all'interno scaffold; pertanto, la densificazione verificato disomogeneamente, dove le regioni attorno alle superfici superiore e inferiore erano più denso quelli intorno alla superficie interna. Questa tendenza era critica come la differenza di altezza delle due parti è aumentato. Inoltre, il poro classificatonoi ponteggio con la parte interna densa era più difficile da produrre rispetto al ponteggio con la parte esterna densa perché la densificazione della parte interna deve essere effettuata, essendo confinati con la parte esterna, che ha provocato la deformazione disomogenea all'interno delle due parti. Per risolvere l'addensamento disomogeneo del ponteggio graduata, abbiamo sviluppato due parti separate che possono essere assemblati durante il processo di densificazione. Anche se in questo documento, la condizione ottimale per produrre la struttura porosa graduata perfettamente fabbricato non è stato ancora completamente trovato, il potenziale del processo densificazione per la produzione della struttura graduata era ben confermato. Il metodo di fabbricazione ottimizzato della struttura porosa classificato è in corso, e come ulteriore lavoro, selettivo droga carico alla struttura classificato sarà indagato per il comportamento rilascio funzionale del patibolo.

I vantaggi del metodo proposto in questo studio includono 1) migliore meccompatibilità hanical con i tessuti biologici con buona potenza e 2) bioattività prolungato per migliorare le prestazioni biologica. Tuttavia, uno dei principali svantaggi è la dimensione dei pori ridotta che non può promuovere osseo attraverso la rete di pori di ponteggi metallici per un'interfaccia osso-impianto migliore. Per risolvere questo problema, sono state proposte strutture pori classificati, in cui le parti porosi e densi coesistono; in tal modo, le parti porose consentono osseo, mentre le parti dense forniscono stabilità meccanica e bioattività prolungata. Pertanto, gli impianti Ti funzionalmente graduati attraverso vari disegni strutturali saranno realizzati e testati, in particolare, concentrandosi sul miglioramento della capacità di integrazione ossea. Inoltre, un'altra limitazione dovrebbe essere la realizzazione di impianti con geometria complessa. Al fine di ottenere un impianto a forma complessa (per esempio, cono femorale Augment), il processo di lavorazione addizionale richiesto dopo densificazione, imponendo due principali inconvenienti sullail prodotto finale: utilizzo inefficiente e antieconomico materiale perché il volume significativo di blocco Ti porosa viene spesso rimosso durante il processo, e potenziale contaminazione e la perdita di biomolecole rivestiti durante la lavorazione. Miglioramento del processo di fabbricazione degli scaffold Ti porose con geometria complessa è in corso. I ponteggi metallici porosi addensate possono essere applicati a varie applicazioni ortopediche, ad esempio, la sostituzione disco artificiale, sostituendo impianti metallici sia sfusi o porosi, e agisce come un supporto di carico e un veicolo per medicamenti.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Titanium powder Alfa Aesar #42624 -325 mesh, 99.5% (metals basis)
Camphene SigmaAldrich #456055 95%, C10H16
KD-4 Croda ­ Hypermer, polymeric dispersant
Phosphate Buffer Solution (PBS) Welgene ML 008-01 ­
Green Fluorescent Protein (GFP) Genoss Co. - >98% purity, 1 mg/ml
Ball mill oven SAMHENUG ENERGY SH-BDO150 ­
Freeze dryer Ilshin Lab. PVTFD50A ­
Cold isostatic pressing (CIP) machine SONGWON SYSTEMS CIP 42260 ­
Vaccum furnace JEONG MIN INDUSTRIAL JM-HP20 ­
electical chaege machine FANUC robocut 0iB External use
Press machine CG&S AJP-200 ­
Confocal laser scanning spectroscopy (CLSM) Olympus FluoView FV1000 External use

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Fabbricazione di meccanicamente Tunable e Bioactive metallo Ponteggi per applicazioni biomediche
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Jung, H. D., Lee, H., Kim, H. E., Koh, Y. H., Song, J. Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (106), e53279, doi:10.3791/53279 (2015).More

Jung, H. D., Lee, H., Kim, H. E., Koh, Y. H., Song, J. Fabrication of Mechanically Tunable and Bioactive Metal Scaffolds for Biomedical Applications. J. Vis. Exp. (106), e53279, doi:10.3791/53279 (2015).

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