Summary
Vi præsenterer en protokol til at skabe celle-baserede neurotransmitter fluorescerende manipuleret reportere (CNiFERs) til optisk detektion af volumetrisk neurotransmitter frigørelse.
Abstract
Cell-baserede neurotransmitter fluorescerende manipuleret reportere (CNiFERs) give et nyt værktøj til neuroforskere til optisk at detektere frigivelse af neurotransmittere i hjernen in vivo. Et specifikt CNiFER er skabt ud fra en human embryonal nyrecelle, som stabilt udtrykker et specifikt G-protein-koblede receptorer, som kobler til G q / 11 G-proteiner, og et FRET-baserede Ca2 + -detector, TN-XXL. Aktivering af receptoren fører til en stigning i FRET signal. CNiFERs har nM følsomhed og en tidsmæssig respons sekunder, fordi en CNiFER klon udnytter den native receptor for en bestemt neurotransmitter, f.eks D2R for dopamin. CNiFERs direkte implanteret i hjernen, så de kan fornemme neurotransmitter frigørelse med en rumlig opløsning på mindre end et hundrede um, hvilket gør dem ideelle til at måle volumen transmission in vivo. CNiFERs kan også anvendes til at screene andre lægemidler til potentiel krydsreaktivitet i VIvo. Vi har for nylig udvidet familien af CNiFERs at omfatte GPCR'er som kobler til G i / o G-proteiner. CNiFERs er tilgængelige til påvisning acetylcholin (ACh), dopamin (DA) og noradrenalin (NE). Eftersom enhver GPCR kan bruges til at skabe et hidtil ukendt CNiFER og at der findes omkring 800 GPCR'er i det humane genom, vi beskriver her den generelle fremgangsmåde til at designe, realisere og teste enhver type CNiFER.
Introduction
For helt at forstå, hvordan neuroner kommunikere i hjernen, er det nødvendigt at have en metode til at måle frigivelsen af neurotransmittere in vivo. Der er flere veletablerede teknikker til måling neurotransmittere in vivo. En almindeligt anvendt teknik er mikrodialyse, i hvilken en kanyle er indsat ind i hjernen og et lille volumen af cerebrospinalvæske opsamles og analyseres under anvendelse af højtydende væskekromatografi og elektrokemisk detektion 1. Mikrodialyse har en rumlig opløsning i størrelsesordenen nogle få diametre af proben, fx ~ 0,5 mm for en mikrosonde 200 um diameter. Den midlertidige opløsning af denne teknik er imidlertid langsom på grund af prøveudtagning intervaller, typisk varer ~ 5 min eller længere 1. Desuden er analyser ikke foretages i realtid. En anden teknik er hurtig scanning cyklisk voltammetri (FSCV), som bruger en carbon-fiber probe, der indsættes i hjernen. FSCV har fremragende temporal opløsning (subsecond), høj følsomhed (nanomolær), og rumlig opløsning med sondens diameter på 5 til 30 um. Imidlertid er FSCV begrænset til sendere, der producerer en karakteristisk oxidation og reduktion Profilen med spænding på et carbonatom potentiometrisk føler 2.
En tredje teknik til at måle neurotransmittere er direkte gennem genetisk kodet neurotransmitter (NT) biosensorer 3. Med denne metode er et fusionsprotein skabt, der indeholder en ligand-bindende domæne til en sender koblet til en fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) -baseret par fluoroforer 4 eller et permuteret GFP 5. I modsætning til de to foregående metoder, er disse biosensorer genetisk kodet og udtrykt på overfladen af en værtscelle, såsom en neuron, gennem produktion af transgene dyr eller akut med anvendelsen af virale midler til at inficere celler. Til dato er genetisk kodet biosensorer kun blevet udviklet til detecting glutamat og GABA 3-5. Begrænsninger med disse teknikker har været lav følsomhed, i nM-området, og den manglende evne til at udvide påvisningen af det store antal sendere, f.eks klassiske neurotransmittere, neuropeptider og neuromodulatorer, som signalerer gennem G-protein-koblede receptorer (GPCR'er). I virkeligheden er der næsten 800 GPCR'er i det humane genom.
For at løse disse mangler, har vi udviklet et innovativt redskab til optisk foranstaltning frigivelse af enhver neurotransmitter, der signalerer gennem en GPCR. CNiFERs (cellebaseret neurotransmitter fluorescerende manipuleret reportere) er klonale HEK293-celler manipuleret til at udtrykke et specifikt GPCR, at når stimuleres, udløser en stigning i intracellulær [Ca2 +], der detekteres af en genetisk kodet FRET-baserede Ca2 + sensor, TN-XXL. Således CNiFERs omdanne neurotransmitter receptorbinding til en ændring i fluorescens, der direkte og real-time optisk rEAD-out af lokale neurotransmitter aktivitet. Ved at udnytte den native receptor for en given neurotransmitter, CNiFERs bevarer kemisk specificitet, affinitet og tidsmæssige dynamik endogent udtrykte receptorer. Til dato har vi skabt tre typer CNiFERs, en for detektering acetylcholin ved anvendelse af M1-receptoren, en for påvisning dopamin ved hjælp af D2-receptoren, og en til detektering noradrenalin ved hjælp af a1a receptor 6,7. Den CNiFER teknologien er let udvides og skalerbar, hvilket gør det muligt at foretage en hvilken som helst form for GPCR. I denne JOVE artikel beskriver vi og illustrere den metode til at designe, realisere og test in vivo CNiFERs for enhver ansøgning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg udført i denne undersøgelse er i overensstemmelse med Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) retningslinjer, og er blevet godkendt af de IACUCs ved Icahn School of Medicine på Mount Sinai og University of California, San Diego.
1. Generer GPCR-udtrykkende lentivirus for Transforming HEK293-celler
- Finde et cDNA for en specifik GPCR fra en kommerciel kilde, f.eks cdna.org. Alternativt amplificere GPCR genet fra et cDNA-bibliotek under anvendelse af PCR. Anskaf en lentivirus udtrykker vektor, såsom pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro (pCDH). Brug denne vektor til at udbrede DNA'et samt at generere lentivirus.
- Klone GPCR cDNA i lentivirus-udtrykkende vektor ved PCR. Se Lorenz 8, for detaljer om PCR-subkloning.
- Udvid og rense GPCR-pCDH DNA ved hjælp af et endotoksin-fri "maxi" prep kit som pr fabrikantens anvisninger. Bekræft, at GPCR cDNA subklonet i pCDH er mutation-fri ved DNA-sekventering.
Bemærk: Inden den fremlægger sin DNA for virus produktion, fordøje en portion med passende restriktionsenzym at bekræfte størrelse insert og renhed af DNA. - Generer lentivirus ved hjælp af en virus core facilitet, såsom en på The Salk Institute, University of Penn., Eller University of North Carolina, etc., eller generere in-house 9. Bruge ca. 25 ug (> 1 pg / pl) af endotoksin-frit DNA til transfektion af HEK-celler i en T75 kolbe. Sikre at DNA'et er af høj renhed, der har en absorbans forhold (A260 / A280) på ~ 1,8.
Bemærk: Titre på virus ~ 10 11 -10 12 GC / ml er optimale for transduktion af HEK293-celler.
2. Valg af HEK293 / TN-XXL Backbone Cell type til dyrkning in vitro
Bemærk: Bestem G-protein kobling specificitet, fx G i / o, G k / 11, eller G s G-proteiner, af GPCR'en, da dette dictates om der er behov for en G-protein kimære for CNiFER. For G q -coupled receptorer, fx M1 muskarin receptor, vælge HEK293 / TN-XXL (# 3G8) som rygraden HEK293 celletype. For G i / o -coupled receptorer, er det kimære G-protein G qi5 behov 10. For G s -coupled receptor er G qs5 kimæren behov 10. I denne protokol, er konstruktionen af en D2R CNiFER brugt som et eksempel. D2R signaler gennem G I / O-G-proteiner og kræver HEK293 celler, som stabilt udtrykker det kimære G-protein, G qi5 fx HEK293 / TN-XXL / G qi5 _ # qi5.6.
- Få de HEK293 / TN-XXL / G qi5 _ # qi5.6 klonede celler fra et forskningslaboratorium. Bemærk: Følgende klonede celler, HEK293 / TN-XXL (# 3G8) til G q -coupled receptorer, HEK293 / TN-XXL / G qi5 (# qi5.6) for G i / o -coupled receptorer, og HEK293 / TN -XXL / G qs5 (# qs5.47) for G s -coupled reReceptorerne, er frit tilgængelige efter anmodning 6,7.
- Vokse og udvide HEK293 / TN-XXL / G qi5 _ # qi5.6 til ~ 90% sammenflydning i en T25 kolbe med 5 ml HEK293 vækstmedier (tabel 1). Grow cellerne i en fugtig inkubator ved 37 ° C med 5% (v / v) CO2.
Bemærk: Alt arbejde med dyrkning af HEK293 celler bør udføres ved hjælp af standard sterile vævskultur teknikker. - Høste HEK293-celler ved først opsugning medier fra T25-kolbe. Vask cellerne forsigtigt ved tilsætning af 5 ml PBS og rokkende kolbe.
- Fjern PBS, og der tilsættes 1 ml 0,05% (vægt / volumen) trypsin / EDTA (tabel 2). Der inkuberes i 1 til 2 minutter ved 37 ° C med 5% (v / v) CO2.
- Saml celler og overføre til sterile 15 ml koniske rør. Centrifuger i 5 minutter ved 1.000 xg i en cellekultur centrifuge. Aspirere supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 5 ml HEK293 vækstmedie. Tæl cellerne i et hæmocytometer under anvendelse aftrypanblåt. Beregn celledensiteten og fortsæt til trin 3.
3. Lentiviral transduktion af HEK293 / TN-XXL / Gqi5 Cells
- Seed en T25 kolbe med 0,7 x 10 6 HEK293 / TN-XXL / G qi5 celler. Grow cellerne i en fugtig inkubator ved 37 ° C med 5% (v / v) CO2 indtil ~ 50% sammenflydende, efter ca. 1 dag. Frys resterende celler (trin 8,2-8,3). Disse celler vil tjene som CNiFER kontrol, dvs en CNiFER der mangler GPCR.
- På dagen for infektionen, fortyndes GPCR'en udtrykkende lentivirus (trin 1.4) til en slutkoncentration på ~ 10 9 GC / ml i et samlet volumen på 2 ml HEK293 vækstmedier (tabel 1). For eksempel tilsættes 20 pi 10 11 GC / ml virus til 2 ml medier i en T25 kolbe.
Bemærk: virustiter oplysninger skal leveres af virus core facilitet. Kombiner lentivirus og medier i et centrifugerør og udriv forsigtigt. Høje titere af lentivIrus er biosikkerhed niveau 2 (BSL-2). - Aspirer mediet fra T25 kolben. Tilsæt 2 ml virus / media blanding fra trin 3.2. Inkubér T25 kolbe O / N ved 37 ° C med 5% (v / v) CO2.
- Efter en dag med infektion, aspireres virus blandingen / medier og erstatte det med HEK293 vækstmedier indeholdende puromycin (2 pg / ml; tabel 1). Puromycin selekterer for de transducerede celler. Inkuber kolben ved 37 ° C med 5% (v / v) CO2 indtil omkring 90% sammenflydende, efter ~ 1-2 dage.
- Der fremstilles en 96-brønds plade (sort med klar bund) overtrukket med fibronectin, til generering af en 10-punkts-agonist / aktivering kurve i trin 4.1. I en steril hætte, tilsættes 50 pi fibronectin (5 pg / ml) pr brønd i række A og B i 96-brønds plade. Inkubér pladen ved stuetemperatur i 1 time. Skyl to gange i 5 min pr skylning med PBS. Der tilsættes 50 pi HEK293 vækstmedier og inkuberes O / N ved 37 ° C med 5% (v / v) CO2.
Bemærk: Fibronectin-behandlede plader er kommercielt tilgængelige. - Høst cellerne i T25 kolbe som beskrevet i trin 2,3-2,6 (tabel 2).
- Resuspender cellepelleten i 5 ml HEK293 vækstmedie. Seed et T25-kolbe med 1,5 ml celler til FACS-analyse. Også frø en T75 kolbe med 1 ml celler til frysning og opbevaring (se trin 8,2-8,3)
- For 10-punkts-agonist kurve, frø de to første rækker (A og B) af en fibronectin-coatet 96-brønds plade (fra trin 3.5) med 100 pi af cellesuspensionen per brønd.
- Inkuber HEK293-celler, der vokser i en T25 kolbe, en T75 kolbe og en 96-brønds plade indtil omkring ~ 90% konfluente ved 37 ° C med 5% (vol / vol) CO2, efter ~ 1-2 dage.
4. FACS og Isolering af Single CNiFER kloner
- Brug 96-brønds plade til generering af en 10-punkts agonistaktivering kurve.
Bemærk: Før start fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) analyse, er det vigtigt at bekræfteekspression af GPCR'en ved at teste transducerede celler for en agonist respons (10-punkts-agonist kurve). Denne test udføres ved anvendelse af en fluorometrisk pladelæser.- Forbered et lægemiddel plade til 10-punkts agonistaktivering kurve. Vælg 10 forskellige agonist koncentrationer, beslag den forudsagte EF 50, som kan bestemmes ud fra litteraturen.
Bemærk: Det stof plade indeholder 3-fold af hver koncentration (in duplo) for at justere for 1: 3-fortynding i CNiFER plade. For eksempel er lægemidlet plade til afprøvning af et D2 CNiFER indeholder 10 forskellige koncentrationer af dopamin ved 3-fold koncentrationer; 0,2, 0,5, 1, 3, 5, 10, 20, 30, 50, og 1.000 nM. I CNiFER plade derfor slutkoncentrationerne af dopamin er 0,067, 0,167, 0,333, 1,00, 1,67, 3,33, 6,67, 10,0, 16,7, og 333 nM. - Forbered agonist løsninger ved hjælp af kunstigt cerebrospinalvæske (ACSF) (tabel 1). Brug to brønde til 'ACSF «, f.eks A1 og A2,og to brønde til "ingen celler", fx B1 og B2.
Bemærk: Forbered forskellige koncentrationer af lægemidler ved hjælp af en seriel fortynding metode. Lav en skabelon til at holde styr på CNiFER kloner og de medikamentkoncentrationer (figur 3). - Brug softwaren til at programmere 96 brønde fluorometrisk pladelæser til måling FRET og udføre løsning overførsler.
- Indstil pladelæser temperaturen til 37 ° C.
- Til måling FRET med TN-XXL, indstille excitationsbølgelængden til 436 ± 4,5 nm (center ± HWHM). Indstil emission filtre til 485 ± 7,5 nm for ECFP og til 527 ± 7,5 nm for Citrine. Indstil cutoff filter til 475 og 515 nm for ECFP og citrin hhv.
- Programmere pladelæser at måle emission ved 485 nm og 527 nm hver 4 sek for i alt 180 sek. Vælg at levere 50 pi fra 3-fold drug pladen til 100 pi i CNiFER plade efter indsamling 30 sek afbasisliniefluorescensen.
- Aspireres mediet fra rækker A og B, og der tilsættes 100 pi ACSF til 96-brønds CNiFER plade, der er ~ 90% konfluente (trin 3.9).
- Læg 96 brønde CNiFER pladen og »3-fold 'drug plade i pladen læseren. Tillad ~ 30 min til ækvilibrering pladerne ved 37 ° C. Derefter starte programmet.
- For at analysere pladelæser data, eksportere fluorescensværdierne til et regneark. Opret en formel til at trække baggrunden målinger (taget for hvert signal fra brønde uden celler) fra brønde med CNiFERs. Normalisere fluorescensintensiteter til at pre-stimulus basislinjer, F Citrine (t) / F Citrine (baseline), og beregne FRET ratio (ΔR / R;. Eqn 1) ved hjælp af peak reaktioner ved 527 nm og 485 nm emissioner (se trin 11 ).
Bemærk: Hvis der er en væsentlig ændring i ΔR / R med agonisten, så indikerer dette ekspression af GPCR'en og man kan fortsætte til FACS-analyse (trin 4.2). Hvis thDer findes ikke FRET respons med agonist, fejlfinding ved anvendelse af en Ca2 + ionophor, f.eks A21387, at teste Ca2 + respons og bekræfte, at FRET-baserede sensor virker. Hvis ionoforen virker, så receptoren blev ikke sandsynligt udtrykkes.
- Forbered et lægemiddel plade til 10-punkts agonistaktivering kurve. Vælg 10 forskellige agonist koncentrationer, beslag den forudsagte EF 50, som kan bestemmes ud fra litteraturen.
- På dagen før FACS, forberede fire plader med 96 brønde overtrukket med fibronektin (se trin 3.5) til indsamling af sorterede celler. Der tilsættes 50 pi HEK293 vækstmedier og inkuberes O / N ved 37 ° C med 5% (v / v) CO2.
- Forbered 5% (vægt / volumen) BSA i PBS (5 g / 100 ml) og filtreres (0,2 um) i en steril flaske.
- Høst cellerne dyrket i T25 kolbe (se trin 2,3-2,5, tabel 2). Resuspender cellepelleten i 4 ml 5% (vægt / volumen) BSA i PBS. Centrifuger cellerne ved 1000 xg i 5 min.
- Aspireres medierne og resuspender cellepelleten i ~ 5 ml 5% (vægt / volumen) BSA i PBS til opnåelse af en endelig koncentration på ~ 5 x 10 6 celler / ml.
Bemærk: Check med FACS core facilitet for specifikke krav til celle tæthed og sortering forhold. - Filtrere resuspenderede celler med en 40 um cellefilter at fjerne klumper. Overfør cellerne til en 5 ml polypropylen rundbundet rør. Glasset anbringes på is til transport til den FACS facilitet.
- Sortere de transducerede HEK293-celler ved en FACS facilitet. Program parametrene på en FACS flowcytometer som følger: sæt 4 ° C for prøve indehaver, 100 um for dysen og 20 psi på. Baseret på den præ-sortering analyse vælge celler, dvs vælge en "gate", der har en stor ECFP fluorescens (ECFP excitation, ECFP emission) og store FRET (ECFP excitation, Citrine emission) fluorescens (se Resultater under, figur 2 ).
- Deposit individ, sorterede celler i en plade med 96 brønde fremstillet i trin 4.2, med én klon per brønd indeholdende 50 pi HEK293 vækstmedie med puromycin. Der tilsættes 50 pi HEK293 vækstmedie med puromycin (Table 1) for i alt 100 pi per brønd. Opretholde celler O / N ved 37 ° C med 5% (v / v) CO2.
Bemærk: HEK293 vækstmedier indeholder puromycin til selektion af transducerede celler.
5. Kulturcenter og udvidelse af Sorteret, Klonale CNiFERs
- Vedligehold CNiFERs i plader med 96 brønde ved at fjerne 50 pi gamle medier fra hver brønd og erstatte med 50 pi frisk HEK293 vækstmedium indeholdende puromycin (tabel 1). Gentag denne hver 5. til 7. dag, indtil ~ 90% konfluente, efter 2-3 uger.
- Harvest CNiFER celler ved forsigtigt at aspirere medierne og skylning en gang forsigtigt med PBS. Fjern PBS og tilsættes 20 pi 0,05% (vægt / volumen) trypsin / EDTA. Der inkuberes i 1 til 2 minutter ved 37 ° C med 5% (v / v) CO2.
- Tilsæt 100 pi HEK293 vækstmedie for trypsin-behandlede celler og cellerne resuspenderes. Overfør indholdet til en 24-brønds plade indeholdende 400 pi frisk HEK293 vækstmedie with puromycin. I 24-brønds plade, opretholde celler ved at erstatte 250 pi HEK293 vækstmedier hver 5-7 dage, indtil brønde er ~ 90% konfluente.
6. Identificer Ansøgerlandene CNiFERs Baseret på FRET respons Brug Fluorometric Plate Reader
Bemærk: Med fire 96-brønds plader efter FACS, bør der være> 100 testbare kloner, der overlever og udvide til 24-brønds plade stadium, eftersom mange af de oprindelige kloner ikke vokser. For at identificere potentielle kandidatlande CNiFERs, bruge en 3-punkts analyse for FRET respons med beslægtet agonist, fx dopamin til D2R.
- Når cellerne er ~ 90% konfluente i 24-brønds plade, forsigtigt aspireres medierne. Tilføj ~ 100 pi af 0,05% (vægt / volumen) trypsin / EDTA og inkuberes i 1-2 min ved 37 ° C med 5% (v / v) CO2. Der tilsættes 400 pi HEK293 vækstmedie for trypsin-behandlede celler og blandes cellerne ved forsigtig triturering.
- Opsæt 3-punkts-agonist kurve for den indledende screening af cloian. For hver CNiFER klon, dvs. en af brøndene fra 24-brønds plade, aliquot 100 pi af cellesuspensionen (~ 4 x 10 3 celler / brønd) i hver af tre brønde, fx A1, A2, A3, af en fibronectin-coatet 96-brøndsplade (sort med klar bund) (se trin 3.5).
- Overfør de resterende ~ 200 pi af cellesuspensionen til en 12-brønds plade indeholdende 1.000 pi HEK293 vækstmedie (1,2 ml slutvolumen). Inkubér begge plader ved 37 ° C med 5% (vol / vol) CO2, indtil ~ 90% konfluente. Pladen med 96 brønde er for fluorometrisk assay og den 12-brønds plade er til dyrkning og udvidelse af kloner.
- For 3-punkts analyse, fastlægge tre forskellige koncentrationer af agonist, der er 0,1-, 1,0- og 10-gange EF 50 for det specifikke GPCR. Forbered agonist koncentrationer i et lægemiddel plade som beskrevet i trin 4.1.1-4.1.2. Udfør en fluorometrisk pladelæser assay som beskrevet i trin 4.1.3-4.1.5.
- Beregn FRET-forhold (ΔR / R) som beskrevet i trin 4.1.6. Vælg CNiFERs der har passende følsomhed og største FRET respons for ekspansion, indefrysning tilbage, og mere omfattende analyser (trin 7).
- For klonerne, der blev udvalgt i trin 6.5 og vokser i 12-brønds plade, fjerne og udskifte 600 pi af HEK293 vækstmedier hver 5 til 7 dage, indtil ~ 90% konfluente.
- Gradvist udvide klonerne fra en 12-brønds plade til en plade med 6 brønde, og derefter til en T25 kolbe (trin 2.3 - 2,6 og tabel 2). Når T25 kolben er ~ 90% konfluente, høst celler som beskrevet (trin 2,3-2,5). Resuspender cellepelleten i 5 ml HEK293 vækstmedie.
- Der tilsættes 1 ml cellesuspension til en T75 kolbe med 9 ml HEK293 vækstmedie. Brug de resterende 4 ml af cellesuspensionen til kryobeskyttelse og opbevaring i flydende N2 (trin 8,2-8,3). Forbered otte 1.5 ml cryorør og placere på is.
- I T75 kolbe, opretholde celler ved at erstatte medierne wi'te frisk HEK293 vækstmedier, fx 10 ml hver 3-5 dage indtil 70-80% sammenflydende, efter ~ 1-2 uger.
7. Endelig udvælgelse af CNiFER kloner Brug Fluorometric Plate Reader
- På dagen før pladelæser assay:
- Harvest celler fra en ~ 90% sammenflydende T75 kolbe (se trin 2,3-2,6, tabel 2). Seed en 96-brønds fibronectin-overtrukne plade (sort med klar bund) ved 5 x 10 4 / brønd med ~ 100 pi cellesuspension. Bemærk: En klon fordeles i en enkelt plade med 96 brønde.
- Forbered et lægemiddel plade til den omfattende screening af CNiFER kloner, der skelnes specifikke agonist svar fra ikke-specifikke CNiFER reaktioner.
- For at generere en fuld dosis-respons-kurve, vælger 10 forskellige agonist koncentrationer omkring den forudsagte EF 50. Brug to brønde til "ingen celler" og to brønde for 'ACSF «.
- Til bestemmelse ikke-specifikke reaktioner, vælger three koncentrationer af 12 forskellige neurotransmittere eller modulatorer (72 brønde) (figur 3). Ligesom agonist, indeholder lægemidlet pladen 3-fold koncentrationer i dobbeltbestemmelse. For eksempel 100 pi tre forskellige koncentrationer af acetylcholin, glutamat, orexin, VIP, adenosin, serotonin, noradrenalin, GABA, substans P, melatonin, somatostatin og histamin, hver i en 3-fold koncentration på 50, 1.000 og 3.000 nM indlæses i 96-brønd lægemiddel plade.
- Indstil parametrene på den fluorometriske pladelæser til måling FRET og udføre løsning overførsler som beskrevet i trin 4.1.3-4.1.5.
- Til analyse af fuld dosis-respons-kurve, beregne peak FRET ratio (ΔR / R) (trin 4.1.6), plottet som funktion af log agonist koncentration og passe med Hill-ligningen (trin 11.4). Bestem EF 50, Hill koefficient, og maksimal FRET-forholdet. For 12 andre neurotransmittere / modulatorer, plot peak ΔR / R som en funktion of lægemiddelkoncentration.
- Vælg ~ 10 CNiFER kloner, der har en stor FRET ratio, en passende EC50 for den beslægtede agonist, og lidt eller ingen baggrund reaktioner på andre neurotransmitter-agonister (ikke-specifik reaktion).
8. Freeze-back Udvalgte CNiFER Clones
- Brug en ~ 90% konfluente T75 kolbe af en individuel CNiFER klon. Harvest celler som beskrevet (trin 2,3-2,5, tabel 2). Til frysning celler, resuspender cellepelleten i 5 ml HEK293 vækstmedie. Label ti 1,5 ml cryorør og sæt på is.
- For kryobeskyttelse, bland celler 1: 1 med 20% (v / v) DMSO i HEK293 vækstmedium, f.eks 5 ml af 20% (v / v) blanding DMSO / medium forsigtigt blandet med 5 ml cellesuspension (endelig koncentration af DMSO er 10%).
- Alikvot 1 ml i hver af de kryorør. Frys rør med celler i en -80 ° C fryser O / N, i et skum-isoleret boks (se Materialer). Transfer kryorør at liquid kvælstof til langtidsopbevaring.
9. CNiFER Implantation ind Mouse Cortex
- Sterilisere alle kirurgiske værktøjer i en autoklave før operation. Forbered en semi-sterile område til operation ved aftørring med 70% ethanol og om en ren lab ble.
- Forbered CNiFER injektion pipette ved at trække et glas kapillarrør (id på 0,53 mm) på en lodret elektrode aftrækker. Brug et par no. 5 fine-tip pincet til at bryde spidsen af elektroden til en diameter på ~ 40 um.
Bemærk: Dette opnås bedst under en stereo zoom mikroskop med en stregglas. - Bedøver en voksen (postnatal dag 60-90) C57BL / 6 mus med isofluran: 4% (v / v) til induktion og 1,5 til 2,0% (v / v) til vedligeholdelse. Brug hale eller tå knivspids for at sikre, at musen er fuldt bedøvet.
Bemærk: Re-knivspids periodisk og vurdere knurhår trækninger i hele kirurgi til at revurdere dybde af anæstesi. - Dæk øjnene med oftalmologiske salve til pRevent tørring. Monter musen i en stereotaktisk ramme med øre barer. Opretholde muse kropstemperatur ved 37 ° C under anvendelse af en varmepude reguleret af en rektal sonde.
- Barber et område på ca. 5 mm ved 12 mm med et dyr barbermaskine. Anvend Betadine efterfulgt af 70% (v / v) isopropanol. Brug en skalpel til at skære og fjerne huden over kraniet overflade. Brug en skalpel for at fjerne periosteum fra overfladen af kraniet. Expose og rengøre overfladen af kraniet, som beskrevet for stereotaktisk kirurgi 11.
- Sænk en tom glas pipette til bregma og registrere antero-posterior (A / P) og medio-lateral (M / L) koordinater. Idet der henvises til muse hjerneatlas, beregne positionen af injektionsstedet. Skift pipetten til målområdet og markere kraniet til efterfølgende vindue formation. Se Cetin et al. For detaljer om stereotaksiske injektioner med gnavere 11.
Bemærk: Injektionsstedet og vindue afhænger af region, der skal undersøges, og fordelingen af neurotransmitter eller peptid frigive fremskrivninger i cortex. For eksempel i en nylig publikation 7, stereotaktisk koordinater +1,0 til +2,0 mm A / P og +1,0 til +2,0 mm M / L blev anvendt til at injicere CNiFER celler i frontale cortex til in vivo-billeddannelse af dopaminfrigivelse under klassisk konditionering . - Form en 2 mm x 3 mm tyndet-kranium vindue som tidligere beskrevet 12,13.
Bemærk: Knoglen i vinduet skal være 15-20 um tyk. De små hvide pletter i knoglen skulle ikke være synlig, når kraniet overflade fugtes, hvis knoglen er tilstrækkeligt fortyndet 12,13. - Placer en ACSF gennemblødt svamp på vinduet for at holde den fugtig, mens forbereder celler til at injicere.
- Harvest CNiFER klon, der blev dyrket i en T75 kolbe til ~ 80% sammenflydning. Aspireres medierne og vask af cellerne med sterilt PBS.
Bemærk: Trypsin er udeladt for disse trin. - Fjern PBS og bruge 10 ml of ACSF at løsne cellerne fra bunden af kolben. Mal celler at adskille celleklumper. Centrifuger og pellet resuspenderes i 100 ul ACSF. Centrifuger i 30 sekunder ved 1400 xg og fjern supernatanten, hvilket efterlader en pellet dækket i ACSF. Dette trin giver en klump af celler i suspension.
- Efterfylde indsprøjtning pipette forberedt i trin 9.2 med mineralolie, indlæse pipette på en nanoinjector, og fremføre stemplet for at skubbe en lille perle af olie. Sætte 5 pi CNiFER cellesuspension på en strimmel af plast paraffin film nær fremstillingen mus. Udarbejde enten CNiFERs eller styre CNiFER celler i trukket pipette.
- Flyt pipetten til målet X og Y-koordinater, dvs. A / P og M / L noteret i trin 9.5. Sænk pipette, piercing den indsnævrede kraniet, og fortsætte med at ~ 200-400 um under kraniet overflade til at deponere CNiFER celler i lag 2/3 af cortex.
- Sprøjt ~ 4.6 nl af CNiFER celler på det dybeste sted med nanoinjector, note bevægelse i olien og celle interface og derefter vente i 5 min for cellerne at dispensere. Træk pipette ~ 100 um og injicere en anden ~ 4.6 nl af CNiFER celler, vent 5 min. Derefter trække pipetten langsomt og forsigtigt for at forhindre tilbagestrømning af CNiFERs. Gentag injektion ved et eller flere tilstødende steder.
- Gentag injektion trin 9,8-9,12 med kontrol HEK293 celler (dvs. HEK293 / TN-XXL / G qi5 klon mangler GPCR). Adskil CNiFER og styre celle injektionssteder ved ~ 200 um.
- Efter at have afsluttet celle implantationer, skylles den tyndet-kraniet vindue med ACSF og vente på kraniet til tørre. Påfør en dråbe cyanoacrylatlim (se Materialer) over vinduet og hurtigt placere en pre-cut sterilt dækglas på toppen af limen. Skub forsigtigt dækglasset mod kraniet i et par sekunder. Lad limen tørre i 2 minutter 12,13.
- Forsegle kanterne af dækglasset med dentalcement og formen awell omkring vinduet til at holde vand til dypning mål.
- For at immobilisere musens hoved under billedbehandling, vedhæfte en specialbygget head-bar med en lille dråbe cyanoacrylat lim bag vinduet (se 14 for detaljer om dimension og materialer). Lad limen tørre grundigt og derefter tilføje ekstra dental cement til yderligere at styrke den specialbyggede head-bar.
- Dække resten af kraniet overflade, bortset fra vinduet, med et lag af dental cement. Sørg kanterne af huden er dækket af cement og lad det tørre i 20 min.
- Efter operationen, stop isofluran administration og overlade musen på en varmepude i et bur, indtil det er kommet sig fuldstændigt fra anæstesi. Injicer 5% (w / v) glucose i saltvand (sc) for rehydrering og 0,05 til 0,1 mg / kg buprenorphin (ip, instant release) for postoperativ analgesi.
Bemærk: For at minimere potentiel immunologisk reaktion på de menneskelige CNiFERs, injicere mus dagligt med 20 pi / 100 g cyclosporine (ip) startende dagen før injektion af CNiFERs. - Retur musen til sit hjem bur til mad og vand.
10. In Vivo Imaging of CNiFER Clones
Bemærk: Levende billedbehandling udføres med mus ved hjælp af en to-foton mikroskop og et hoved-fast apparatur. Der kræves ingen anæstesi under de billeddannende sessioner. Når billeddannelse dyr i vågen tilstand, begrænser nakkestøtten til kun et par timer ad gangen for at reducere stressniveauet. Retur dyret til det hjem bur mellem billeddiagnostiske sessioner for mad og vand. Potentiel stress minimeres ved mørkere værelse lysene og omgivende del af musen i et kabinet.
- På dagen efter kirurgi, montere musen på et billeddannende platform ved at skrue metal hoved-bar implanteret på kraniet i hovedet-fiksering ramme.
Bemærk: Når billeddannelse vågen mus, bør imaging session ikke overstige et par timer på grund af den potentielle stress fremkaldt af enheden head-tilbageholdenhed den. - Placer imaging platform med head-behersket mus i et to-foton billedbehandling mikroskop udstyret med en 10X (0,30 NA) og 40X (0,80 NA) nedsænkning vand målsætninger.
- Indsæt filter terning for FRET billeddannelse (ECFP og Citrine), som har et dikroisk spejl ved 505 nm og båndpasfiltre, der spænder 460 nm til 500 nm til måling ECFP og 520 nm til 560 nm til måling Citrine.
- Føj ACSF til brønden indeholder tyndet-kranie vinduet og sænke nedsænkning i vand mål ind i ACSF. Brug okularet sammenholdt med kviksølvlampe og GFP filter terning at lokalisere overfladen af cortex og vaskulaturen under vinduet.
Bemærk: Mønstret af vaskulaturen hjælper lokalisere og billede i samme region i løbet af gentagne dage billeddannelse. Skift til 40X ved nedsænkning i vand mål at lokalisere CNiFERs ved manuelt at fokusere på overfladen af cortex over cellerne under anvendelse af GFP filter terning og en kviksølvlampe. - Opsætning for to-foton billedbehandling. Vælg apmæssig strålegang for to-foton billedbehandling. For en typisk kommercielt system, bruge softwaren til at skifte til to-foton imaging mode og omdirigere lys til fotomultiplikatorrør (PTM'er) i de ikke-descanned detektorer. Tænd nærinfrarøde femtosekund pulseret laser, vælg bølgelængde på 820 nm og en effektindstilling på 5-15%. Bemærk: 5% effekt typisk giver ~ 25 mW ved prøven.
- Indstil PMT1 & PMT2 spænding tæt på den maksimale værdi, typisk 700-1.000 V afhængigt af PMT. Indstil forstærkningen til en for hver kanal og nul Z position for målet.
- Sænk målet ~ 100 til 200 um fra kortikale overflade og starte xy scanning. Juster lasereffekten, forstærkning og PMT spænding for hver kanal, dvs., ECFP og citrin, for at optimere signal-til-støj-forholdet for CNiFER fluorescens.
- Brug zoomfunktionen i softwaren for at begrænse billedet til en region, der indeholder CNiFER celler såvel som en background region. Brug en scanningshastighed ingen langsommere end én ramme hver 2 sek (0,5 Hz) ved 4 mikrosekunder per pixel. Juster linje gennemsnit for passende signal-til-støj-forhold, f.eks Kalman 2 linie gennemsnit.
- Tegn en region af interesse (ROI) omkring CNiFER celler, der omgiver omkring 3 til 4 celler pr flyet. Opsæt real-time analyse af ROI gennemsnitlige intensiteter. Start erhvervelse at overvåge CNiFER fluorescens over tid.
- Saml fluorescens fra CNiFERs før og under eksperimentelle manipulationer, fx, elektrisk stimulation, CHR2 stimulation, adfærd, som bestemmes af brugeren.
- Når afbildningseksperiment er fuldført, returnerer musen til sit eget bur. Gentag billedbehandling tværs dage, som ønskes. Når re-billeddannelse af cellerne henvise til tidligere opnåede lavforstørrende vaskulatur billede for at orientere tilbage til den samme Billedfeltet (trin 10.4).
Bemærk: Implanterede CNiFERs kan afbildes i mindst 7 dage.
11. Dataanalyse
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En CNiFER er afledt fra en human embryonal nyre (HEK293) celle, der er konstrueret til stabilt at udtrykke mindst to proteiner: et specifikt G-protein-koblet receptor (GPCR) og en genetisk kodet [Ca2 +] sensor, TN-XXL. TN-XXL undergår fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) mellem cyan og gul fluorescerende proteiner, ECFP og citrin henholdsvis som reaktion på Ca2 + -ioner 6,15. Aktivering af GPCR'er at par endogen G q G-proteiner udløser en stigning i cytosolisk [Ca2 +] gennem PLC / IP 3-vejen, som fører til en stigning i FRET fra TNXXL Ca2 + detektor (figur 1).
Figur 1:. Ordning for Udviklingslande CNiFERs Top, GPCR-Ca 2+ signalvejen kræves for at skabe enCNiFER celle. Bottom, de grundlæggende trin til konstruktion CNiFERs hjælp HEK293 celler. Trin 1. transducere med genetisk kodet FRET-baserede Ca2 + -detector (TN-XXL). Trin 2. transducere Ga G-protein-kimære, dvs. G qs5, G qi5, hvis det er nødvendigt. Trin 3. transducere unik GPCR at skabe CNiFER. To-foton excitation lys (rød) ophidser ECFP, som undergår FRET, der producerer både en ECFP emission (cyan) og Citrine emission (gul). Klik her for at se en større version af dette tal.
Stigningen i FRET tilvejebringer en hurtig optisk udlæsning af ændringen i neurotransmitterniveauer. At udvikle en CNiFER for en bestemt type neurotransmitter, først afgøre, hvilken type G-protein, som par i GPCR. For G q -coupled GPCR'er, GPCR'en bruger Gq proteiner endogent udtrykt iHEK293-celler. For G i / o -coupled GPCR'er, en klonal HEK293 linje først skabt, der udtrykker et kimærisk G-protein, der omdirigerer GPCR'en til G q -PLC / IP 3-vejen. Dette opnås med et kimært G-protein, G qi5, som primært indeholder Ga q sekvens og fem aminosyrer af carboxylterminus af Gi. Disse fem aminosyrer er tilstrækkelige til G qi5 at kommunikere med G i / o -coupled GPCR'er, men signalere via G q pathway. For G s -coupled GPCRs, er en G qs5 kimære anvendt 10. Den generelle strategi til fremstilling af en CNiFER er at: 1) oprette en klonal HEK293 celle, der stabilt udtrykker en optisk Ca2 + detektor, dvs. TN-XXL, under anvendelse af en lentivirus transduktion af HEK-celler, 2) stabilt udtrykker en G-protein-kimære om nødvendigt i HEK293 celle klon udtrykker TN-XXL, og 3) at skabe et stabilt udtrykker GPCR klon i HEK293 celleklone udtrykker TN-XXL og det kimære G-protein. Den klonale HEK293 linje, der mangler GPCR men har TN-XXL og kimære G-protein tjener som "kontrol CNiFER«. Styringen CNiFER er nødvendig for at bekræfte, at CNiFER respons skyldes specifikt til aktivering af de konstruerede receptorer, dvs. D2R og ikke til aktivering af andre receptorer endogent udtrykt i HEK293-celler.
For at generere lentivirus, anvendes en lentivector ekspressionssystem, f.eks pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro, som indeholder de genetiske elementer, der er ansvarlige for emballage, transduktion, stabil integration af det virale ekspressionskonstruktion i genomisk DNA, og ekspression af målet gensekvens. At producere en høj titer af viruspartikler, ekspression og pakkevektorer transient cotransficeres ind i producent- pattedyrceller og virus opsamles. Der er flere virale core faciliteter i USA, der kan generere høj ti ter lentivirus. Efter infektion af HEK293-celler, Puro genet tilvejebringer antibiotikaresistens til identifikation transducerede HEK293-celler.
For at identificere specifikke klonale linjer, transducerede HEK293-celler sorteres under anvendelse af en fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) system. Formålet er at isolere en klon, der indeholder et højt ekspressionsniveau af FRET-baserede Ca2 + detektor og evnen til at undergå FRET. I dette eksempel på FACS-analyse, er fluorescensen af ECFP emission afbildet mod FRET signal (ECFP excitation og Citrine emission). Kasserne markerer regioner (P2 og P3), som efterfølgende vil blive udvalgt ( "gated") til sortering i 96-brønds plader (figur 2). Generelt omkring fire plader med 96 brønde er tilstrækkelige til at screene for vellykket skabelse af CNiFERs. Fra disse 4 plader, ca. 100 kloner er egnede til fluorometrisk pladelæser analyse.
e_content "fo: holde-together.within-side =" 1 ">
Figur 2: Eksempel på FACS-analyse En prøve af produktionen efter en FACS-analyse.. Grafen plots ECFP emission ( "475/20-A") som funktion af Citrine emission ( "FRET V-530/30-A"), under anvendelse ECFP excitation for hver celle. Regioner P2 og P3 viser områder valgt, dvs, gated, til sortering i individuelle celler. Farver er vilkårlige. Klik her for at se en større version af dette tal.
Når de sorterede celler er vokset til tilstrækkelig tæthed, er FRET respons efter agonist-aktivering bestemmes ved anvendelse af en 96-brønds fluorometrisk pladeaflæser systemet udstyret med opløsning håndtering. For at indsnævre antallet af kloner at studere, er en "3-punkts" agonist kurve bruges til at screene ~100 kloner og vælge CNiFERs med de bedste svar. Ca. 10 kloner analyseres derefter yderligere med bestemmelse af den fuldstændige dosis-respons med det beslægtede agonist, og ikke-specifikke reaktioner, probet med 12 andre neurotransmittere eller modulatorer. En 96-brønd lægemiddel plade fremstilles som tre-fold koncentration (slutkoncentration fortyndes 1: 3 i plade) af lægemidler (f.eks agonister, antagonister, etc.) i ACSF. I dette eksempel er et lægemiddel plade sat op til at teste en D2 CNiFER med dets beslægtede agonist, dopamin og potentielle uspecifikke reaktioner med en række andre neurotransmitter og peptidagonister (figur 3). Rygraden CNiFER, som mangler GPCR, tjener som en vigtig kontrol for det nyoprettede CNiFER.
Figur 3:. Eksempler på layout til plader med 96 brønde Top, tabel af layout for at indlæse en 3x lægemiddel plade til fluorometrisk pladelæser under anvendelse tre-fold koncentrationer af forskellige neurotransmittere og peptider. Bund, eksempler på klar plast 96 brønde narkotika plade og sort 96-brønds plade til såning CNiFERs og måling i plade-læser. Klik her for at se en større version af dette tal.
Stimulering af GPCR forventes at øge FRET respons, som følge af en højde af intracellulært [Ca2 +] og påvisning ved TN-XXL. Under disse betingelser er FRET produceret af ECFP og Citrin rykker tættere, så excitation af ECFP producerer en mindre ECFP emission og større Citrine emission. I dette eksempel er excitation indstillet til 436 nm og emission filtre er indstillet til 485 ± 7,5 nm for ECFP og 527 ± 7,5 nm for Citrine (figur 4). Tredive sekunder af baSeline fluorescens måles og derefter 50 pi fra "tre-fold" agonist i ACSF plade leveres til hver brønd indeholdt 100 pi ACSF (1: 3 fortynding). ECFP og Citrine emission fluorescens måles hvert 3,8 sekunder i 180 sek. Baggrund målinger er taget fra brønde uden celler og trækkes, hvis det er nødvendigt. Fluorescensintensiteter normaliseres til præ-stimulus basislinjer (F (t) / F (baseline)), og peak responser måles til beregning af FRET ratio (ΔR / R) under anvendelse af F (t) / F (baseline) i 527 nm og 485 nm kanaler (ligning 1). En dosis-respons-kurve konstrueres derefter ved at plotte FRET-forholdet som en funktion af forskellige agonist koncentrationer og passer med Hill-ligningen til at bestemme EC50 og Hill-koefficient (figur 5) (ligning 2). En optimal CNiFER udviser en stor FRET-forhold og en passende EC50 for den beslægtede agonist og udviser ringe eller ingen baggrund reaktioner på andre neurotransmitter agonister. Derimod bør styringen CNiFER viser ringe reaktion på den beslægtede agonist.
Figur 4: Eksempel på agonistinduceret FRET respons D2R CNiFER FRET respons målt på en pladelæser med en opløsning leveringssystem.. (A) Et plot af FRET respons, dvs ECFP excitation med ECFP og Citrin emissioner, under anvendelse af dopamin (rød bjælke) til D2 CNiFERs. Bemærk, at falder ECFP emission mens Citrin emission stiger med agonist (dopamin). (B) Et plot af FRET ratio (ligning 1) for den respons i (A) Figur modificeret fra Muller et al., 2014 7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:. Eksempler på dosisresponskurver for D2 CNiFER (A) Dosis respons kurver for respons af D2 CNiFERs til dopamin (DA, sort) og for noradrenalin (NE, grøn). Desuden er reaktionen af "kontrol" CNiFERs mangler D2R vist. (B) Søjlediagrammet viser FRET-forholdet respons for andre neurotransmittere og modulatorer ved 50 nM og 1 uM. Værdier er middelværdi ± SEM. Figur modificeret fra Muller et al., 2014 7. Klik her for at se en større version af dette tal.
CNiFER kloner kan vurderes yderligere for mulig receptor-afhængige desensibilisering og for deres tidsmæssige opløsning, diskriminere præsentationenaf to forskellige agonist impulser (for detaljer se Muller et al., 2014 7). Efter at have konstrueret en CNiFER klon, det næste trin er at afprøve dens funktion in vivo. At overvåge fluorescens in vivo, er det nødvendigt at anvende et to-foton mikroskop. Efter fremstilling af en fortyndet-kranium vindue, er CNiFERs indlæses i en glaspipette og injiceres i lag 2/3 af cortex. Musen fremstilles derefter til in vivo billeddannelse ved at fastgøre et dækglas til den indsnævrede kraniet, og implanteres en hovedstang til fiksering af hovedet under imaging (figur 6).
For at bestemme, at de implanterede CNiFERs er levedygtige in vivo, kan kendte koncentrationer af agonist injiceres nær stedet for implantation og FRET forholdet bestemt 7. For yderligere at validere aktiviteten af implanterede CNiFERs, stimulerende input neuroner bør undersøges. For eksempel med D2 CNiFER, virkningen afelektrisk stimulation af midthjernen dopamin neuroner, der projicerer til cortex blev undersøgt. En 0,1 MOhm wolfram bipolær stimulerende elektrode med en spids separation af 500 um blev implanteret i substantia nigra (-3.2 mm A / P, -1,3 mm M / L, -4,4 mm D / V). Figur 6 viser et eksempel på elektrisk stimulere substantia nigra ved forskellige intensiteter og observere en stigning i FRET ratio for D2 CNiFERs 7. Bemærk, at systemisk (ip) injektion af en D2-receptor-antagonist, eticloprid (1 mg / kg), blokerer D2 CNiFER respons intraperitoneal. På den anden side, injektion af kokain (15 mg / kg), som blokerer genoptagelse af dopamin, forbedrer den elektrisk fremkaldte D2 CNiFER respons 7.
Figur 6: Eksempel på D2 CNiFER respons I
ftp_upload / 53.290 / 53290table1.jpg "/>
Tabel 1: Liste over kemikalier og reagenser for at gøre HEK293 vækstmedium og ACSF.
Tabel 2: Mængder til Høst celler fra forskellige størrelse Kultur plader eller Kolber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oprettelsen af CNiFERs giver en innovativ og unik strategi for optisk måling frigivelse af neurotransmittere i hjernen in vivo. CNiFERs er ideelt egnede til måling ekstrasynaptiske frigivelse, dvs., volumen ledning, for neurotransmittere. Vigtigt er det, hver CNiFER besidder egenskaberne af det native GPCR, hvilket giver en fysiologisk optisk måling af ændringerne i niveauerne af neurotransmittere i hjernen. Til dato er der blevet oprettet CNiFERs til påvisning acetylcholin (M1-CNiFER) 6, dopamin (D2-CNiFER) 7 og noradrenalin (a1a-CNiFER) 7.
I princippet kan en CNiFER laves til enhver neurotransmitter, der signalerer gennem en GPCR. For det tilfælde, hvor GPCR signaler via G q G-proteiner, er yderligere modifikation er nødvendig til HEK293 celle. GPCRs der signalerer gennem G i / o, dog kræver coekspression af en G qi5 kimære G-proteintil at koble GPCR til Gq / PLC-vejen 7,10. Tilsvarende vil GPCR'er, som signalerer gennem G s kræver coekspression af et kimært G qs5 G-protein 10. Når den er færdig, er hver CNiFER klon screenes og kun de CNiFER kloner, der har en affinitet sammenlignelig med den native receptor, udviser ringe eller ingen desensibilisering og tilvejebringe et signal-til-støj-forhold, der er egnede til at måle med in vivo to-foton mikroskopi, udvælges til in vivo undersøgelser.
For in vivo-undersøgelser, er det stærkt anbefales at behandle mus med cyclosporin at minimere enhver potentiel immunologisk reaktion. Der er mulighed for afvisning eller en immunologisk reaktion med implantere humane CNiFER celler i gnaverhjerne. Dette er tidligere blevet undersøgt ved at undersøge ekspression af GFAP og MAC1 7, efter CNiFER implantation. CNiFERs syntes ikke at producere gliale ar eller generere nogen signisentlig MAC1 farvning 7.
To store spørgsmål at overveje at konstruere CNiFERs er følsomhed og desensibilisering. Hvis EC50 er for høj, dvs. lav affinitet, i forhold til det native receptor, så CNiFER muligvis ikke tilstrækkelig følsom til at påvise frigørelse af neurotransmitter in vivo. En løsning er at screene kloner og vælge en anden CNiFER klon, der har højere affinitet. En alternativ strategi ville være at teste andre typer af genetisk indkodede fluorescerende Ca2 + -detectors, der kan have en højere Ca2 + følsomhed, som kan ændre EC50 for GPCR-aktivering. Fordi CNiFER design er modulopbygget, er det let tilpasses til andre typer af genetisk indkodede Ca2 + -detectors, såsom GCaMP 16. Isolering CNiFER kloner med den samme receptor, men forskellige EF 50 s kunne være fordelagtigt for at udvide det dynamiske område for påvisning frigivelse af endogent neurotransmitters in vivo.
Desensibilisering af CNiFER vil også begrænse dens anvendelse in vivo. Hvis spidsresponsen gradvist aftager med hver puls af agonist, så receptoren kan desensibilisering. I dette tilfælde undersøger andre kloner og afgøre, om de reagerer på samme måde. Modifikationer af receptor aminosyresekvens, eller brug af en anden subtype af receptoren kan være nødvendigt at behandle agonistafhængig desensibilisering. Hvis der er kendte steder for phosphorylering eller aminosyrer identificeret, associeret med G-protein receptor kinaser (GRK'er), ville det være tilrådeligt at konstruere en ikke-desensibiliserende variant af GPCR'en ved at mutere et eller flere steder. skal bestemmes den mekanisme af desensibilisering for hver receptor fra sag til sag.
Indtil videre har CNiFERs kun blevet implanteret i overfladiske lag af cortex 6,7, på grund af spektroskopiske begrænsninger med billedbehandling fluoroforer med to-foton microscopy 17,18. I fremtiden kan det være muligt at tilpasse CNiFER teknologi med fiberbaserede målinger af fluorescens 19, således at CNiFERs kan implanteres i subcorticale hjerneområder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker B. Conklin (University of California, San Francisco) for at levere de G qi5 og G qs5 cDNA'er A. Schweitzer for assistance med elektronik, N. Taylor for at få hjælp med screening af kloner, Ian Glaaser og Robert Rifkin til korrekturlæsning , og Olivier Griesbeck for TN-XXL. Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger gennem det amerikanske National Institute on Drug Abuse (Nida) (DA029706, DA037170), National Institute of Biomedical Imaging og Bioengineering (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) og "Neuroscience relateret til Drugs af misbrug "uddannelse tilskud gennem Nida (DA007315).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro | System Biosciences | CD510B-1 | Cloning: for generating lentivirus |
| 12 x 75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube | BD Biosciences | 352063 | FACS |
| BD 40 um Falcon cell strainers | BD Biosciences | 352340 | FACS |
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200056 | FACS |
| 96 Well Plate, flat bottom, clear | Corning | 3596 | FACS |
| 96 well cell culture plates | Corning | CLS3997 | Flexstation |
| Optilux black clear bottom | Corning | 3603 | Flexstation |
| Flexstation pipet tips | Molecular Devices | 9000-0911 | Flexstation |
| Acetylcholine Chloride | Sigma-Aldrich | A2661 | Flexstation |
| Norepinephrine | Sigma-Aldrich | A7256 | Flexstation |
| Dopamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | PHR1090 | Flexstation |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | Flexstation |
| Histamine | Sigma-Aldrich | H7125 | Flexstation |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | Flexstation |
| Epinephrine | Sigma-Aldrich | E4642 | Flexstation |
| Somatostatin | Sigma-Aldrich | S1763 | Flexstation |
| 5HT | Sigma-Aldrich | H9523 | Flexstation |
| VIP | Alpha Diagnostics Inc. | SP-69627 | Flexstation |
| Orexin A | Alpha Diagnostics Inc. | 12-p-01 | Flexstation |
| Substance P | Sigma-Aldrich | S6883 | Flexstation |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Flexstation |
| Melatonin | Sigma-Aldrich | M5250C | Flexstation |
| Fluorescence Plate Reader & software | Molecular Devices | Flexstation 3 | Flexstation |
| DMEM (high glucose) with Glutamax | Life Technologies | 10569-010 | Tissue culture |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-139 | Tissue culture |
| Pen/Strep antibiotics | Life Technologies | 15140-122 | Tissue culture |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | Tissue culture |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Tissue culture |
| CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box | Bioexpress | D-3508) | Tissue culture |
| cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite no. 495 | surgery and stereotaxic injection |
| plastic paraffin film | VWR | Parafilm® | surgery and stereotaxic injection |
| Nanoinjector | Drummond | 3-000-204 | surgery and stereotaxic injection |
| Glass electrodes | Drummond | 3-000-203G | surgery and stereotaxic injection |
| hand held drill | OSADA | Exl-M40 | surgery and stereotaxic injection |
| Burrs for drill | Fine Scientific | 19007-05; 19007-07) | surgery and stereotaxic injection |
| Sterilizing bath | FST | 18000-45, Hot Bead Sterilizer | surgery and stereotaxic injection |
| isoflurane chamber/mask | Highland Medical Equipment | 564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm | surgery and stereotaxic injection |
| 3D scope with arm | Zeiss | surgery and stereotaxic injection | |
| fiber optic light | surgery and stereotaxic injection | ||
| Betadine | surgery and stereotaxic injection | ||
| 70 % (v/v) isopropyl alcohol | surgery and stereotaxic injection | ||
| Povidone-Iodine Prep Pads | dynarex | 1108 | surgery and stereotaxic injection |
| NaCl 0.9% (injection, USP, 918610) | surgery and stereotaxic injection | ||
| CYCLOSPORINE (INJECTION, USP) | surgery and stereotaxic injection | ||
| Buprenex (injection) buprenorphine (0.03 μg per g rodent) | Sigma-Aldrich | surgery and stereotaxic injection | |
| Ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | surgery and stereotaxic injection |
| Surgifoam | Ethicon | surgery and stereotaxic injection | |
| Grip dental cement | Dentsply | #675571, 675572 | surgery and stereotaxic injection |
| Instant SuperGlue | NDindustries | surgery and stereotaxic injection | |
| LOCTITE 4041 | surgery and stereotaxic injection | ||
| METABOND | C&B | surgery and stereotaxic injection | |
| no. 0 cover glass | Fisher | surgery and stereotaxic injection | |
| stereotaxic frame | Kopf | surgery and stereotaxic injection | |
| Rectal probe and heating pad | FHC | 40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe | surgery and stereotaxic injection |
| optical breadboard for imaging | Thorlabs | surgery and stereotaxic injection | |
| Mineral oil | Fisher | S55667 | surgery and stereotaxic injection |
| Kwik-Cast (Silicone elastomer) | World Precision Instruments | surgery and stereotaxic injection | |
| Suture | Ethicon | 18’’, 1667, 4-0 | surgery and stereotaxic injection |
| Scissors | Fine Scientific Tools | 91500-09, 15018-10 | surgery and stereotaxic injection |
| Forcepts | Fine Scientific Tools | 11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10 | surgery and stereotaxic injection |
| Student Halsted-Mosquito Hemostats | Fine Scientific Tools | 91308-12 | surgery and stereotaxic injection |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Scientific Tools | 18000-00 | surgery and stereotaxic injection |
| Hot Bead Sterilizers | Fine Scientific Tools | 18000-45 | surgery and stereotaxic injection |
| Instrument Case with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20311-21 | surgery and stereotaxic injection |
| Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20810-01 | surgery and stereotaxic injection |
| 2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging | Olympus | FV1200 MPE | in vivo imaging |
| Multiphoton laser | SpectraPhysics | Mai Tai DeepSee | in vivo imaging |
| Green Laser | Olympus | 473 nm Laser | in vivo imaging |
| xy translational base | Scientifica | MMBP | in vivo imaging |
| FRET filter cube for YFP and CFP | Olympus | in vivo imaging | |
| 10x and 40x water immersion objectives | Olympus | in vivo imaging | |
| air table | Newport | in vivo imaging | |
| custom built light-tight cage | Thorlab | in vivo imaging |
References
- Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems. Methods. 23, 21-39 (2001).
- Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo. Clin Chem. 49, 1763-1773 (2003).
- Liang, R., Broussard, G. J., Tian, L. Imaging Chemical Neurotransmission with Genetically Encoded Fluorescent Sensors. ACS Chem Neurosci. , (2015).
- Okubo, Y., et al. Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 6526-6531 (2010).
- Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10, 162-170 (2013).
- Nguyen, Q. T., et al. An in vivo biosensor for neurotransmitter release and in situ receptor activity. Nat Neurosci. 13, 127-132 (2010).
- Muller, A., Joseph, V., Slesinger, P. A., Kleinfeld, D. Cell-based reporters reveal in vivo dynamics of dopamine and norepinephrine release in murine cortex. Nat Methods. 11, 1245-1252 (2014).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. , e3998 (2012).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. , (2009).
- Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Gjα. Nature. 363, 274-276 (1993).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1, 3166-3173 (2006).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. , (2012).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat Methods. 7, 981-984 (2010).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1277-1309 (2012).
- Yamauchi, J. G., et al. Characterizing ligand-gated ion channel receptors with genetically encoded Ca2+ sensors. PLoS One. 6, e16519 (2011).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Cui, G., et al. Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation. Nature. 494, 238-242 (2013).
