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JoVE Journal Neuroscience
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Neuroscience

Der Bau der Zellbasierte Neurotransmittern Fluorescent Engineered Reporter (CNiFERs) zur optischen Erfassung von Neurotransmittern Published: May 12, 2016 doi: 10.3791/53290
Automatic Translation
1, 2, 1, 2,3, 1
1Department of Neuroscience, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Physics, University of California, San Diego, 3Section of Neurobiology, University of California, San Diego

Summary

Wir stellen ein Protokoll zellbasierten Neurotransmitter fluoreszierenden Reportern engineered (CNiFERs) zur optischen Erfassung der volumetrischen Neurotransmitter-Freisetzung zu schaffen.

Abstract

Zell-basierte Neurotransmitter fluoreszierende entwickelt Reporter (CNiFERs) bieten ein neues Werkzeug für die Neurowissenschaftler die Freisetzung von Neurotransmittern im Gehirn in vivo zu optisch erfassen. Eine spezifische CNiFER wird aus einer humanen embryonalen Nierenzelle geschaffen , die stabil mit einer spezifischen G Protein-gekoppelten Rezeptor, der Paare G q / 11 G - Proteine ​​und ein FRET-basierten Ca 2+ -Detektor, TN-XXL ausdrückt. Aktivierung des Rezeptors führt zu einer Erhöhung in der Signal FRET. CNiFERs haben nM Empfindlichkeit und eine zeitliche Reaktion von Sekunden , weil ein CNiFER Klon mit dem nativen Rezeptor für einen bestimmten Neurotransmitter verwendet, zum Beispiel D2R für Dopamin. CNiFERs werden direkt in das Gehirn implantiert, so dass sie die Freisetzung von Neurotransmittern mit einer räumlichen Auflösung von weniger als hundert & mgr; m, so dass sie ideal zur Messung der Volumentransmissions in vivo zu erfassen. CNiFERs kann auch für mögliche andere Arzneimittel zu screenen Kreuzreaktivität in vi verwendet werdenvo. Wir vor kurzem erweitert die Familie der CNiFERs GPCRs , dass Paar G i / o G - Proteine ​​enthalten. CNiFERs zum Erfassen Acetylcholin (ACh), Dopamin (DA) und Norepinephrin (NE) verfügbar. Da jede GPCR verwendet werden kann, ein neues CNiFER zu schaffen, und dass es etwa 800 GPCRs im menschlichen Genom sind, beschreiben wir hier das allgemeine Verfahren zu entwerfen, zu erkennen und zu testen, jede Art von CNiFER.

Introduction

Um vollständig zu verstehen , wie Nervenzellen im Gehirn zu kommunizieren, ist es notwendig , ein Verfahren zu haben , die Freisetzung von Neurotransmittern in vivo zu messen. Es gibt mehrere gut etablierte Techniken für Neurotransmitter in vivo zu messen. Eine üblicherweise verwendete Technik besteht darin , Mikrodialyse, in denen eine Kanüle in das Gehirn eingeführt wird , und ein kleines Volumen von Liquor wird gesammelt und analysiert unter Verwendung von Hochleistungs-Flüssigkeits - Chromatographie und elektrochemische Nachweis 1. Microdialysis hat eine räumliche Auflösung in der Größenordnung von wenigen Durchmesser der Sonde, zB ~ 0,5 mm für einen 200 & mgr; m Durchmesser Mikro. Die zeitliche Auflösung dieses Verfahrens ist jedoch langsam aufgrund Abtastintervalle , die typischerweise dauern ~ 5 min oder länger 1. Darüber hinaus werden Analysen nicht in Echtzeit durchgeführt. Eine andere Technik ist schnelles Scannen cyclischer Voltammetrie (FSCV), die eine Kohlenstoff-Fasersonde verwendet, die in das Gehirn eingeführt ist. FSCV hat eine ausgezeichnete Temperaturorale Auflösung (Subsekunden), hohe Empfindlichkeit (nanomolar) und räumliche Auflösung mit Sondendurchmesser von 5 bis 30 um. Allerdings ist FSCV auf Sender begrenzt , die eine charakteristische Oxidations- und Reduktionsprofil mit Spannung auf einem Kohlenstoff - potentiometrischen Sonde 2 herzustellen.

Eine dritte Technik Neurotransmitter zu messen , ist direkt über genetisch kodierten Neurotransmitter (NT) Biosensoren 3. Mit diesem Verfahren wird ein Fusionsprotein geschaffen , das eine Liganden-Bindungsdomäne für einen Sender enthält , der mit einem Fluoreszenz - Resonanz - Energietransfer (FRET) basierende Paar von Fluorophoren 4 oder einem permutierten GFP 5. Im Gegensatz zu den vorherigen beiden Verfahren werden diese Biosensoren genetisch codiert und exprimiert auf der Oberfläche einer Wirtszelle, wie beispielsweise ein Neuron, durch die Produktion von transgenen Tieren oder akut mit der Verwendung von viralen Mitteln Zellen zu infizieren. Bis heute genetisch kodierten Biosensoren nur wurden für detectin entwickeltg Glutamat und GABA 3-5. Einschränkungen mit diesen Techniken haben die geringe Empfindlichkeit, im nM - Bereich gewesen, und die Unfähigkeit , den Nachweis der großen Anzahl von Sendern, zum Beispiel klassische Neurotransmitter, Neuropeptide und Neuromodulatoren, die durch G - Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) Signal zu erweitern. In der Tat gibt es fast 800 GPCRs in das menschliche Genom.

Um diese Defizite ansprechen, haben wir ein innovatives Werkzeug zur optischen Messung Freisetzung von Neurotransmitter entwickelt, die einen GPCR-Signale durch. CNiFERs (zellbasierten Neurotransmitter fluoreszierenden Reportern engineered) sind klonale Zellen HEK293 engineered einen bestimmten GPCR zu exprimieren, der , wenn er stimuliert, eine Erhöhung der intrazellulären auslöst [Ca 2+], die durch eine genetisch kodierte FRET-basierten Ca 2+ Sensor erfasst wird, TN-XXL. So verwandeln CNiFERs Neurotransmitter-Rezeptor in eine Veränderung der Fluoreszenz-Bindung, eine direkte und Echtzeit-optischen r die Bereitstellungead-out der lokalen Neurotransmitteraktivität. Durch Verwendung des nativen Rezeptors für einen bestimmten Neurotransmitter, behalten CNiFERs die chemische Spezifität, Affinität und zeitliche Dynamik der endogen exprimierter Rezeptoren. Bis heute haben wir geschaffen drei Arten von CNiFERs, einer zum Detektieren Acetylcholin unter Verwendung des M1 - Rezeptor, einer zum Detektieren Dopamin Verwendung des D2 - Rezeptors, und ein zur Erfassung des & alpha; 1A - Rezeptor 6,7 Noradrenalin verwenden. Die CNiFER Technologie ist leicht erweiterbare und skalierbare es zugänglich für jede Art von GPCR machen. In diesem JoVE Artikel, wir beschreiben und veranschaulichen die Methodik zu entwickeln, erkennen, und in vivo Test CNiFERs für jede Anwendung.

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Protocol

Alle Tierverfahren in dieser Studie durchgeführt, sind in Übereinstimmung mit Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) Richtlinien und wurden von den IACUCs an der Icahn School of Medicine am Berg Sinai und der University of California, San Diego genehmigt.

1. Generieren Sie GPCR-exprimierenden Lentivirus für Transforming HEK293 Zellen

  1. Erhalten , die cDNA für einen bestimmten GPCR aus einer kommerziellen Quelle, beispielsweise cdna.org. Alternativ verstärken das GPCR-Gens aus einer cDNA-Bibliothek unter Verwendung von PCR. Besorgen Sie sich einen Lentivirus-exprimierenden Vektor, wie pcdh-CMV-MCS-EF1-Puro (pcdh). Verwenden Sie diesen Vektor, der die DNA als auch zu propagieren als Lentiviren zu erzeugen.
  2. Klonen Sie die GPCR-cDNA in den Lentiviren-exprimierenden Vektor durch PCR. Siehe Lorenz 8, Einzelheiten über PCR Subklonierung.
  3. Erweitern und die GPCR-pcdh DNA unter Verwendung eines Endotoxin-frei "maxi" Prep-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu reinigen. Bestätigen Sie, dass die GPCR-cDNA subkloniert in pcdh mutations istfrei durch DNA-Sequenzierung.
    Hinweis: Vor der DNA für die Virusproduktion einreichen, verdauen eines aliquoten mit Enzym geeigneten Restriktions Größe des Einsatzes zu bestätigen und die Reinheit der DNA.
  4. Generieren Sie Lentiviren ein Virus Core Facility verwenden, wie man am Salk Institute, University of Penn., Oder University of North Carolina, usw., oder generieren Sie im Haus 9. Verwenden etwa 25 & mgr; g (> 1 ug / ul) von Endotoxin-freie DNA für die Transfektion von HEK-Zellen in einem T75-Kolben. Stellen Sie sicher , dass die DNA von hoher Reinheit ist, ein Absorptionsverhältnis (A 260 / A 280) von ~ 1,8.
    Anmerkung: Virustiter ~ 10 11 -10 12 GC / ml optimal sind für die Transduktion von HEK293 - Zellen.

2. Die Wahl HEK293 / TN-XXL Backbone Zellentyp für In - vitro - Kultivierung

Hinweis: Bestimmen der G - Protein - Spezifität Kopplungs, beispielsweise G i / o, G q / 11 oder G s G - Proteine, der GPCR, da dies dictates, ob ein G-Protein-Chimäre für die CNiFER benötigt wird. Muskarinrezeptors Für G q -gekoppelter Rezeptoren, zB M1, wählen HEK293 / TN-XXL (# 3G8) als Rückgrat HEK293 Zelltyp. Für G i / o -gekoppelter Rezeptoren wird die chimären G - Protein G qi5 10 benötigt. Für G s -gekoppelter Rezeptor, wird die G qs5 Chimäre 10 benötigt. In diesem Protokoll wird die Konstruktion eines D2R CNiFER als Beispiel verwendet. D2R Signale über G i / o G - Proteine ​​und erfordert HEK293 - Zellen, die die chimären G - Protein, G qi5 stabil exprimieren, zB HEK293 / TN-XXL / G qi5 _ # qi5.6.

  1. Besorgen Sie sich die HEK293 / TN-XXL / G qi5 _ # qi5.6 klonalen Zellen , die aus einem Forschungslabor. Hinweis: Die folgenden klonalen Zellen, HEK293 / TN-XXL (# 3G8) für G q -gekoppelter Rezeptoren, HEK293 / TN-XXL / G qi5 (# qi5.6) für G i / o -gekoppelter Rezeptoren und HEK293 / TN -XXL / G qs5 (# qs5.47) für G s -gekoppelter reRezeptoren, sind frei verfügbar auf Anfrage 6,7.
  2. Wachsen und zu expandieren HEK293 / TN-XXL / G qi5 _ # qi5.6 zu ~ 90% Konfluenz in einem T25 - Kolben mit 5 ml HEK293 Wachstumsmedium (Tabelle 1). Wachsen die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C mit 5% (v / v) CO 2.
    Hinweis: Alle Arbeiten mit HEK293 Kultivierung von Zellen werden unter Verwendung von Standard sterilen Gewebekulturtechniken durchgeführt.
  3. Ernten Sie die HEK293-Zellen durch erste Medien von T25-Flasche abgesaugt. Waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 5 ml PBS Zugabe und Schaukelkolben.
  4. Entfernen Sie die PBS und 1 ml 0,05% (w / v) Trypsin / EDTA (Tabelle 2). Inkubieren für 1 bis 2 min bei 37 ° C mit 5% (v / v) CO 2.
  5. Sammeln Zellen und Transfer 15 ml konischen Röhrchen zu steril. Zentrifuge für 5 min bei 1000 xg in einer Zellkultur-Zentrifuge. Den Überstand aspirieren.
  6. Resuspendieren des Zellpellets in 5 ml HEK293 Wachstumsmedien. Zählen Sie die Zellen in einem Hämozytometer unter Verwendung vonTrypanblau. Berechnen Sie die Zelldichte und gehen Sie zu Schritt 3.

3. Lentivirale Transduktion von HEK293 / TN-XXL / Gqi5 Zellen

  1. Seed einen T25 - Kolben mit 0,7 x 10 6 HEK293 / TN-XXL / G qi5 Zellen. Wachsen die Zellen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C mit 5% (v / v) CO 2 , bis ~ 50% konfluent, nach ca. 1 Tag. Frieren verbleibenden Zellen (Schritte 8,2-8,3). Diese Zellen dienen als CNiFER Steuerung, dh ein CNiFER, die den GPCR fehlt.
  2. Am Tag der Infektion, verdünnen das GPCR exprimiert Lentivirus (Schritt 1,4) zu einer Endkonzentration von ~ 10 9 GC / ml in einem Gesamtvolumen von 2 ml HEK293 Wachstumsmedium (Tabelle 1). Fügen Sie zum Beispiel 20 & mgr; l 10 11 GC / ml Virus zu 2 ml Medium in einem T25 - Kolben.
    Hinweis: Der Virustiter Informationen sollten durch das Virus Core Facility zur Verfügung gestellt werden. Kombinieren Lentivirus und Medien in ein Zentrifugenröhrchen und verreiben sanft. Hohe Titer von lentivirus sind Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2).
  3. Saugen Sie das Medium aus dem T25-Flasche. Fügen Sie die 2 ml Virus / Medien Mischung aus Schritt 3.2. Inkubieren Sie die T25 - Flasche O / N bei 37 ° C mit 5% (v / v) CO 2.
  4. Nach einem Tag der Infektion, das Virus / Medium - Gemisch absaugen und ersetzen sie durch HEK293 Wachstumsmedien mit Puromycin (2 ug / ml; Tabelle 1). Puromycin wählt für die transduzierten Zellen. Inkubieren der Kolben bei 37 ° C mit 5% (v / v) CO 2 , bis etwa 90% konfluent, nach ca. 1-2 Tagen.
  5. Bereiten Sie eine 96-Well-Platte (schwarz mit durchsichtigem Boden) mit Fibronektin beschichtet, zur Erzeugung eines 10-Punkte-Agonist / Aktivierungskurve in Schritt 4.1. In einer sterilen Haube, fügen Sie 50 ul Fibronektin (5 ug / ml) pro Vertiefung in den Reihen A und B der 96-Well-Platte. Die Platte bei Raumtemperatur für 1 Stunde. Spülen Sie zweimal für 5 Minuten pro Spülung mit PBS. Je 50 ul HEK293 Wachstumsmedien und Inkubieren O / N bei 37 ° C mit 5% (v / v) CO 2.
    Hinweis: Fibronectin behandelten Platten sind im Handel erhältlich.
  6. Ernte der Zellen in T25 - Kolben wie in den Schritten 2,3-2,6 (Tabelle 2).
  7. Resuspendieren des Zellpellets in 5 ml HEK293 Wachstumsmedien. Samen ein T25-Kolben mit 1,5 ml der Zellen für die FACS-Analyse. Auch eine T75-Kolben mit 1 ml der Zellen für das Einfrieren und Lagerung von Saatgut (siehe Schritte 8,2-8,3)
  8. Für die 10-Punkt-Agonist Kurve, Saatgut den ersten beiden Reihen (A und B) eines Fibronektin-beschichteten 96-Well-Platte (aus Schritt 3.5) mit 100 ul der Zellsuspension pro Vertiefung.
  9. Inkubieren HEK293 - Zellen in einem T25 - Kolben wachsen, einem T75 - Kolben und einer Platte mit 96 Vertiefungen bis zu ~ 90% konfluent bei 37 ° C mit 5% (v / v) CO 2, nach ca. 1-2 Tagen.

4. FACS und Isolierung einzelner CNiFER Clones

  1. Verwenden Sie die 96-Well-Platte einen 10-Punkte-Agonist Aktivierungskurve zu erzeugen.
    Hinweis: Vor dem fluoreszenzaktivierten Zellstartsortierung (FACS) -Analyse, es wichtig ist, die zur BestätigungExpression des GPCR von transduzierten Zellen für einen Agonisten Antwort Test (10-Punkte-Agonisten Kurve). Dieser Test wird mit einem fluorimetrischen Plattenleser.
    1. Bereiten Sie eine Droge Platte für die 10-Punkte-Agonisten Aktivierungskurve. Wählen , 10 verschiedene Agonisten Konzentrationen , die die vorhergesagte Halterung 50 EG, die aus der Literatur bestimmt werden kann.
      Hinweis: Die Droge Platte enthält 3-fache jeder Konzentration (in zweifacher Ausfertigung) für die 1 einzustellen: 3 Verdünnung in der CNiFER Platte. Beispielsweise enthält das Medikament Platte eine D2 CNiFER zum Testen von 10 verschiedenen Konzentrationen von Dopamin bei 3-facher Konzentration; 0,2, 0,5, 1, 3, 5, 10, 20, 30, 50 und 1000 nM. In der CNiFER Platte, daher sind die Endkonzentrationen von Dopamin 0,067, 0,167, 0,333, 1,00, 1,67, 3,33, 6,67, 10,0, 16,7 und 333 nM.
    2. Bereiten Sie die Agonisten - Lösungen unter Verwendung von künstlichen Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) (Tabelle 1). Verwenden Sie zwei Brunnen für 'ACSF', zB A1 und A2,und zwei Brunnen für 'ohne Zellen ", zum Beispiel, B1 und B2.
      Hinweis: Bereiten verschiedenen Konzentrationen von Medikamenten mit einer Reihenverdünnungsverfahren. Erstellen Sie eine Vorlage Spur von CNiFER Klone zu halten und die Wirkstoffkonzentrationen (Abbildung 3).
    3. Verwenden Sie die Software, um die 96-Well-fluorometrische Plattenleser zu programmieren für FRET Messung und Lösungstransfers durchführen.
      1. Stellen Sie den Plattenleser Temperatur auf 37 ° C.
      2. FRET mit TN-XXL Zur Messung, stellen Sie die Anregungswellenlänge auf 436 ± 4,5 nm (Mitte ± HWHM). Stellen Sie die Emissionsfilter auf 485 ± 7,5 nm für eCFP und auf 527 ± 7,5 nm für Citrine. Stellen Sie den Cutoff-Filter 475 und 515 nm für eCFP und Citrine sind.
      3. Programmieren der Plattenleser Emission bei 485 nm und 527 nm alle 4 Sekunden für insgesamt 180 Sekunden zu messen. Wählen Sie die Option 50 & mgr; l aus dem 3-fach Arzneimittel Platte zu den 100 & mgr; l in der CNiFER Platte zu liefern, nach dem Sammeln von 30 Sekunden vonBaseline-Fluoreszenz.
    4. Saugen Sie das Medium aus Reihen A und B und fügen 100 ul ACSF auf die 96-Well-Platte, die CNiFER ~ 90% konfluent (Schritt 3.9) ist.
    5. Laden Sie die 96-Well-CNiFER Platte und die "3-fach" Drogenplatte in den Plattenleser. Erlauben ~ 30 min, die Platten bei 37 ° C äquilibrieren. Dann starten Sie das Programm.
    6. Um Plattenleser Daten exportieren die Fluoreszenzwerte in eine Tabelle zu analysieren. Erstellen Sie eine Formel, um die Hintergrundmessungen zu subtrahieren (für jedes Signal aus Vertiefungen ohne Zellen aufgenommen) aus Brunnen mit CNiFERs. Normalisieren Fluoreszenzintensitäten Pre-Stimulus Basislinien, F Citrine (t) / F Citrine (Baseline), und berechnen Sie die FRET - Verhältnis (& Delta; R / R;. Eqn 1) die Spitzenantworten bei 527 nm und 485 nm Emissions (siehe Schritt 11 ).
      Hinweis: Wenn in & Delta; R / R mit dem Agonisten eine wesentliche Änderung ist, dann zeigt dies die Expression des GPCR und man kann auf die FACS-Analyse (Schritt 4.2) um fortzufahren. Wenn there ist kein FRET Reaktion mit Agonisten, zu beheben , indem ein Ca 2+ Ionophor unter Verwendung von zB A21387, die Ca 2+ Reaktion zu testen , und dass FRET-basierten Sensor bestätigen arbeitet. Wenn der Ionophor funktioniert, dann wurde der Rezeptor nicht wahrscheinlich, ausgedrückt.
  2. Am Tag vor FACS, bereiten vier 96-Well-Platten mit Fibronektin beschichtet (siehe Schritt 3.5) für die sortierten Zellen zu sammeln. Je 50 ul HEK293 Wachstumsmedien und Inkubieren O / N bei 37 ° C mit 5% (v / v) CO 2.
  3. Bereiten 5% (w / v) BSA in PBS (5 g / 100 ml) und Filter (0,2 um) in eine sterile Flasche.
  4. Ernten Sie die Zellen in der T25 - Kolben gezüchtet (siehe Schritte 2,3-2,5, Tabelle 2). Resuspendieren des Zellpellets in 4 ml von 5% (w / v) BSA in PBS. Zentrifugieren der Zellen bei 1000 × g für 5 min.
  5. Aspirieren die Medien und Zellpellet in ~ 5 ml von 5% (w / v) BSA in PBS zu einer Endkonzentration von ~ 5 × 10 6 Zellen / ml zu ergeben.
    Hinweis: Prüfen Sie mit der FACS Core Facility für spezifische Anforderungen an die Zelldichte und Sortierbedingungen.
  6. Filtern Sie die resuspendierten Zellen mit einer 40 & mgr; m Zelle Sieb, um die Klumpen zu entfernen. Übertragung der Zellen auf eine 5 ml Polypropylen-Rundbodenröhrchen. Das Röhrchen auf Eis für den Transport zur FACS-Anlage.
  7. Sortieren Sie die transduzierten HEK 293-Zellen in einer FACS-Anlage. Programm die Parameter auf einem FACS Durchflußzytometer wie folgt: Satz 4 ° C für den Probenhalter, 100 & mgr; m für die Düse und 20 psi. Basierend auf der Pre-Sortieranalyse, markieren Sie die Zellen, das heißt, wählen Sie ein "Tor", die eine große eCFP Fluoreszenz haben (eCFP Anregung, eCFP Emission) und große FRET (eCFP Anregung, Citrine Emission) Fluoreszenz (siehe Ergebnisse unten, Abbildung 2 ).
  8. Deposit einzelnen, sortierten Zellen in eine 96-Well-Platte, hergestellt in Schritt 4.2, mit einem Klon pro Vertiefung 50 ul HEK293 Wachstumsmedien mit Puromycin enthält. In 50 ul HEK293 Wachstumsmedien mit Puromycin (Table 1) für eine Gesamtmenge von 100 & mgr; l pro Vertiefung. Pflegen Zellen O / N bei 37 ° C mit 5% (v / v) CO 2.
    Hinweis: HEK293 Nährmedien Puromycin für die Selektion von transduzierten Zellen enthält.

5. Die Anzucht und Erweiterung der Sorted, Geklonte CNiFERs

  1. Pflegen Sie die CNiFERs in den 96-Well - Platten mit 50 ul alten Medien aus jeder Vertiefung entfernt und ersetzt mit 50 ml frisches HEK293 Wachstumsmedien enthält Puromycin (Tabelle 1). Wiederholen Sie diesen Vorgang alle 5 bis 7 Tage, bis ~ 90% konfluent, nach 2-3 Wochen.
  2. Ernte CNiFER Zellen durch sanft die Medien abgesaugt und einmal vorsichtig mit PBS spülen. Entfernen Sie die PBS und fügen Sie 20 ul von 0,05% (w / v) Trypsin / EDTA. Inkubieren für 1 bis 2 min bei 37 ° C mit 5% (v / v) CO 2.
  3. Füge 100 & mgr; l Wachstumsmedium HEK293 Trypsin-behandelten Zellen und die Zellen zu resuspendieren. Übertragen Inhalt auf eine 24-Well-Platte mit 400 & mgr; l frisch HEK293 Nährmedien with Puromycin. In der 24-Well-Platte, pflegen Zellen durch 250 ul HEK293 Wachstumsmedium ersetzt alle 5-7 Tage bis Brunnen sind ~ 90% konfluent.

6. Identifizieren Candidate CNiFERs Basierend auf FRET Antwort Mit Fluorometrische Plate Reader

Hinweis: Mit vier 96-Well-Platten FACS folgende, sollte es> 100 prüfbar Klone, die an die 24-Well-Platte Bühne überleben und zu erweitern, da viele der ursprünglichen Klone wachsen scheitern. Zur Identifizierung potentieller Kandidat CNiFERs, verwenden Sie einen 3-Punkt - Analyse für die FRET - Reaktion mit artverwandten Agonisten, zum Beispiel Dopamin für D2R.

  1. Wenn die Zellen sind ~ 90% konfluent in der 24-Well-Platte, aspirieren sanft den Medien. Hinzufügen ~ 100 & mgr; l 0,05% (w / v) Trypsin / EDTA und Inkubation für 1-2 min bei 37 ° C mit 5% (v / v) CO 2. In 400 ul HEK293 Wachstumsmedien zu Trypsin-behandelten Zellen und mischen Sie die Zellen durch vorsichtiges Zerreiben.
  2. Richten Sie die 3-Punkt-Agonisten Kurve für die ersten Screening des CLOang. Für jeden CNiFER Klon, das heißt, einer der Vertiefungen der Platte mit 24 Vertiefungen, Aliquot 100 ul der Zellsuspension (ca. 4 x 10 3 Zellen / Vertiefung) in jede von drei Vertiefungen, beispielsweise A1, A2, A3, der eine Fibronektin-beschichteten 96-Well-Platte (schwarz mit durchsichtigem Boden) (siehe Schritt 3.5).
  3. Übertragung der verbleibenden ~ 200 & mgr; l der Zellsuspension in eine 12-Well-Platte mit 1000 & mgr; l Wachstumsmedium HEK293 (1,2 ml Endvolumen). Inkubieren beide Platten bei 37 ° C mit 5% (v / v) CO 2, bis ~ 90% konfluent. Die 96-Well-Platte für die fluorometrische Assay und die 12-Well-Platte ist für den Anbau und die Klone expandiert.
  4. Für die 3-Punkt - Analyse, bestimmen drei verschiedenen Konzentrationen von Agonisten , die 0,1- sind, 1,0- und 10-fachen der 50 EG für die spezifische GPCR. Bereiten Agonisten Konzentrationen in einer Droge Platte als 4.1.1-4.1.2 in Schritten beschrieben. Führen Sie einen fluorimetrischen Plattenleser Assay als 4.1.3-4.1.5 in Schritten beschrieben.
  5. Berechnen Sie die FRET-Verhältnis (& Delta; R / R), wie in Schritt 4.1.6 beschrieben. Wählen Sie CNiFERs die entsprechende Empfindlichkeit und größte FRET Antwort für die Expansion haben, das Einfrieren zurück, und umfassendere Analysen (Schritt 7).
  6. Für die Klone, die in Schritt ausgewählt wurden 6,5 und werden in der 12-Well-Platte wachsen, zu entfernen und 600 ul der HEK293 Nährmedien konfluenten alle 5 bis 7 Tage, bis ~ 90% ersetzen.
  7. Erweitern den Klonen aus einer 12-Well - Platte zu einer 6-Well - Platte, und dann in einen T25 - Kolben (Schritte von 2,3 bis 2,6 und Tabelle 2). Wenn die T25-Flasche ist ~ 90% konfluent, Ernten der Zellen, wie beschrieben (Schritte 2,3-2,5). Resuspendieren des Zellpellets in 5 ml HEK293 Wachstumsmedien.
  8. 1 ml der Zellsuspension in einem T75-Kolben mit 9 ml HEK293 Wachstumsmedien. Verwenden Sie die restlichen 4 ml der Zellsuspension für Kryokonservierung und Lagerung in flüssigem N 2 (Schritte 8,2-8,3). Bereiten Sie acht 1,5 ml Kryoröhrchen und auf Eis.
  9. In dem T75-Kolben aufrechtzuerhalten Zellen durch Ersetzen der Medien with frischen HEK293 Wachstumsmedien, zB 10 ml alle 3-5 Tage bis 70-80% konfluent, nach ca. 1-2 Wochen.

7. Die endgültige Auswahl des CNiFER Klone Mit Fluorometrische Plate Reader

  1. Am Tag vor dem Plattenleser Test:
    1. Ernten Sie die Zellen aus einer ~ 90% konfluent T75 - Flasche (siehe Schritte 2,3-2,6, Tabelle 2). Samen ein 96-Loch - Fibronektin-beschichtete Platte (schwarz mit durchsichtigem Boden) bei 5 x 10 4 / Vertiefung mit ~ 100 & mgr; l der Zellsuspension. Hinweis: Ein Klon wird verteilt in einer einzigen 96-Well-Platte.
  2. Bereiten Sie eine Droge Platte für die umfassende Überprüfung von CNiFER Klone, spezifischen Agonisten Antworten von unspezifischen CNiFER Antworten zu unterscheiden.
    1. Um eine volle Dosis-Wirkungs-Kurve zu erzeugen, wählen Sie 10 verschiedene Agonisten Konzentrationen um den vorhergesagten EC 50. Verwenden Sie zwei Vertiefungen für "ohne Zellen" und zwei Brunnen für 'ACSF'.
    2. unspezifische Reaktionen zur Bestimmung wählen three Konzentrationen von 12 verschiedenen Neurotransmittern oder Modulatoren (72 Vertiefungen) (Abbildung 3). Wie der Agonist enthält die Arzneimittelplatte 3-fach-Konzentrationen in zweifacher Ausfertigung. Beispielsweise 100 & mgr; l von drei verschiedenen Konzentrationen von Acetylcholin, Glutamat, Orexin, VIP, Adenosin, Serotonin, Norepinephrin, GABA, Substance P, Melatonin, Somatostatin und Histamin, die jeweils mit einer 3-fach-Konzentration von 50, 1.000 und 3.000 nM werden in die Platte mit 96 Vertiefungen Wirkstoff beladen.
  3. Stellen Sie die Parameter auf dem fluorimetrischen Plattenleser für FRET Messung und Durchführung Lösung Transfers wie 4.1.3-4.1.5 in Schritten beschrieben.
  4. Für die volle Dosis-Wirkungs-Kurve zu analysieren, berechnen die Spitzen FRET-Verhältnis (& Delta; R / R) (Schritt 4.1.6), die Handlung als Funktion der log-Agonisten-Konzentration und passen mit der Hill-Gleichung (Schritt 11.4). Bestimmen Sie die EC 50, Hill - Koeffizient, und die maximale FRET - Verhältnis. Für die 12 anderen Neurotransmittern / Modulatoren, Grundstück Spitzen & Delta; R / R als Funktion of Wirkstoffkonzentration.
  5. Wählen ~ 10 CNiFER Klone , die eine große FRET - Verhältnis aufweisen, eine entsprechende EC 50 für die kognate Agonist, und wenig oder keine Hintergrundantworten auf andere Neurotransmitter - Agonisten (unspezifische Antwort).

8. Gefrier zurück Ausgewählte CNiFER Clones

  1. Verwenden Sie eine ~ 90% konfluent T75-Flasche eines einzelnen CNiFER Klon. Ernte Zellen wie beschrieben (Schritte 2,3-2,5, Tabelle 2). Für Zellen, Einfrieren, Resuspendieren in 5 ml Wachstumsmedium HEK293 Zellpellet. Beschriften zehn 1,5 ml Kryoröhrchen und setzen auf Eis.
  2. Zur Kryoprotektion, Mischungs Zellen 1: 1 mit 20% (v / v) DMSO in HEK293 Wachstumsmedien, beispielsweise 5 ml der 20% (v / v) DMSO / Medium - Gemisch vorsichtig mit 5 ml der Zellsuspension vermischt wird (endgültige Konzentration von DMSO beträgt 10%).
  3. Aliquot 1 ml in jede der Kryoröhrchen. Gefriert Röhrchen mit Zellen in einem -80 ° C Gefrierschrank O / N, in einem schaumisolierten Box (siehe Materialien). Transfer Kryoröhrchen zu LIQUid Stickstoff zur Langzeitlagerung.

9. CNiFER Implantierung in Maus Cortex

  1. Sterilisieren alle chirurgische Instrumente in einem Autoklaven vor der Operation. Bereiten Sie eine semi-sterilen Bereich für die Operation, indem sie mit 70% Ethanol abgewischt und zur Schaffung eines sauberen Labor Windel nach unten.
  2. Bereiten Sie die CNiFER Injektionspipette durch eine Glaskapillare (id von 0,53 mm) Ziehen an einer vertikalen Elektrode Abzieher. Verwenden Sie ein Paar nicht. 5 Feinspitze Zange die Spitze der Elektrode mit einem Durchmesser von ~ 40 & mgr; m zu brechen.
    Hinweis: Dies wird am besten unter einem Stereo-Zoom-Mikroskop mit einem Raster durchgeführt.
  3. Anästhesieren einen Erwachsenen (postnataler Tag 60-90) C57BL / 6-Maus mit Isofluran: 4% (v / v) für die Induktion und 1,5 bis 2,0% (v / v) für die Wartung. Verwenden Schwanz oder Zehen Prise, um sicherzustellen, dass die Maus vollständig betäubt.
    Hinweis: Re-Pinch in regelmäßigen Abständen und Whisker Zucken im gesamten Operation beurteilen Narkosetiefe neu zu bewerten.
  4. Decken Sie die Augen mit Augensalbe zu prevent Trocknen. Montieren Sie die Maus in einem stereotaktischen Rahmen mit Ohr-Bars. Pflegen Sie die Maus Körpertemperatur bei 37 ° C ein Heizkissen durch eine rektale Sonde geregelt werden.
  5. Shave eine Fläche von etwa 5 mm bis 12 mm mit einem Tier Elektrorasierer. Apply Betadine um 70% (v / v) Isopropanol. Verwenden Sie ein Skalpell zu schneiden und die Haut über der Schädeloberfläche zu entfernen. Verwenden, um eine Skalpellklinge das Periost von der Oberfläche des Schädels zu entfernen. Expose und reinigen Sie die Oberfläche des Schädels, wie für stereotaktische Operation 11 beschrieben.
  6. Senken Sie eine leere Glaspipette zu Bregma und die anteroposteriore (A / P) und mediolaterale (M / L) Koordinaten aufzeichnen. Bezugnehmend auf die Mausgehirnatlas, die Berechnung der Position der Injektionsstelle. Verschieben Sie die Pipette an den Zielort und markieren Sie den Schädel für nachfolgende Fenster Bildung. Siehe Cetin et al. Einzelheiten zur stereotaktischen Injektionen mit Nagetieren 11.
    Hinweis: Die Injektionsstelle und Fenster sind abhängig von der Ausrichtungion untersucht und die Verteilung von Neurotransmittern oder Peptid freisetzende Vorsprünge in der Hirnrinde werden. Beispielsweise in einer neueren Veröffentlichung 7 koordiniert die stereotaxische 1,0-2,0 mm A / P und 1,0 bis 2,0 mm M / L verwendet wurden CNiFER Zellen in frontalen Kortex für in vivo Bildgebung von Dopamin - Freisetzung während der klassischen Konditionierung einzuspritzen .
  7. Bilden Sie einen 2 mm x 3 mm ausgedünnten Schädel Fenster wie zuvor 12,13 beschrieben.
    Hinweis: Die Knochen im Fenster sollte 15-20 um dick sein. Die kleinen weißen Flecken in den Knochen sollte nicht sichtbar sein , wenn die Schädeloberfläche befeuchtet, wenn der Knochen ausreichend 12,13 verdünnt wird.
  8. Legen Sie eine ACSF getränkten Schwamm auf dem Fenster, um es feucht zu halten, während Zellen Vorbereitung zu injizieren.
  9. Ernten Sie die CNiFER Klon, der in einem T75-Kolben gezüchtet wurde auf ~ 80% Konfluenz. Absaugen die Medien und die Zellen mit sterilem PBS waschen.
    Hinweis: Trypsin für diese Schritte weggelassen.
  10. Entfernen PBS und verwenden 10 ml of ACSF Zellen vom Boden des Kolbens zu entfernen. Man reibt Zellen Zellklumpen zu distanzieren. Zentrifuge und das Pellet in 100 ul ACSF resuspendieren. Zentrifuge für 30 Sekunden bei 1.400 xg und entfernen Sie den Überstand, so dass ein Pellet in ACSF bedeckt. Dieser Schritt lässt einen Klumpen von Zellen in Suspension.
  11. Verfüllen die Injektionspipette hergestellt in Schritt 9.2 mit Mineralöl, laden Sie die Pipette auf eine nanoinjector, und rückt den Kolben eine kleine Perle von Öl auszuwerfen. Setzen 5 ul CNiFER Zellsuspension auf einem Streifen aus Kunststoffparaffinfilm in der Nähe der Maus Zubereitung. Zeichnen Sie sich entweder die CNiFERs oder CNiFER Zellen in die gezogen Pipette steuern.
  12. Bewegen der Pipette zum Ziel X und Y - Koordinaten, das heißt, A / P und M / L festgestellt in Schritt 9.5. Senken Sie die Pipette, die ausgedünnten Schädel-Piercing, und weiter auf ~ 200-400 & mgr; m unter der Schädeloberfläche, CNiFER Zellen in Schichten 2/3 der Hirnrinde zu deponieren.
  13. Injizieren ~ 4.6 nl von CNiFER Zellen an der tiefsten Stelle mit dem nanoinjector, beachten Sie Bewegung in der Öl- und Zelloberfläche und dann für 5 Minuten für die Zellen warten zu verzichten. Ziehen Sie die Pipette ~ 100 & mgr; m und injizieren eine andere ~ 4.6 nl von CNiFER Zellen, warten 5 Min. Zurückziehen dann die Pipette langsam und vorsichtig Rückstau der CNiFERs zu verhindern. Wiederholen Injektion an einer oder mehreren benachbarten Stellen.
  14. Wiederholen Sie die Schritte Injektion 9,8-9,12 mit Steuer HEK293 - Zellen (dh HEK293 / TN-XXL / G qi5 Klon fehlt GPCR). Trennen Sie die CNiFER und steuern Zellinjektionsstellen von ~ 200 & mgr; m.
  15. Nach der Zellimplantationen Abschluss, spülen Sie die ausgedünnten Schädel Fenster mit ACSF und warten Sie auf den Schädel zu trocknen. Geben Sie einen Tropfen Sekundenkleber (siehe Materialien) über das Fenster und legen Sie schnell eine vorgeschnittene sterile Deckglas oben auf den Leim. Drücken Sie vorsichtig das Deckglas gegen den Schädel für ein paar Sekunden. Lassen Sie den Kleber trocknen 2 min 12,13.
  16. Seal die Ränder des Deckglases mit Zahnzement und Form awell um das Fenster Wasser für das Tauch Ziel zu halten.
  17. Für die Maus des Kopfes Immobilisierung während der Bildgebung, fügen Sie eine maßgeschneiderte Kopf-Bar mit einem kleinen Tropfen Sekundenkleber hinter dem Fenster (14 Einzelheiten zur Dimension und Materialien sehen). Lassen Sie den Leim trocknen gründlich und fügen Sie dann weitere Dentalzement, um die maßgeschneiderte Kopf-Bar stärken.
  18. Decken Sie den Rest der Schädeloberfläche, mit Ausnahme der Fenster, mit einer Schicht aus Zahnzement. Stellen Sie die Ränder der Haut sicher von Zement bedeckt sind und lassen Sie es für 20 Minuten trocknen lassen.
  19. Im Anschluss an die Operation, Isofluran Verwaltung stoppen und mit der Maus auf einem Heizkissen in einem Käfig verlassen, bis er aus der Narkose vollständig erholt. Injizieren Sie 5% (w / v) Glukose in Kochsalzlösung (sc) für die Rehydrierung und 0,05 bis 0,1 mg / kg Buprenorphin (ip, Instant-Release) für die postoperative Analgesie.
    Hinweis: Um mögliche immunologische Reaktion auf die menschliche CNiFERs minimieren, injizieren die Maus täglich mit 20 & mgr; l / 100 g Cyclosporin (ip) am Tag vor der Injektion von CNiFERs beginnen.
  20. Bringen Sie die Maus in seinen Heimkäfig für Nahrung und Wasser.

10. In - vivo - Bildgebung von CNiFER Clones

Hinweis: Live-Bildgebung mit Mäusen führte eine Zwei-Photonen-Mikroskop und einem Kopf-festen Vorrichtung verwendet wird. Keine Anästhesie während der Imaging-Sitzungen benötigt. Wenn die Tiere im Wachzustand Bebilderung begrenzen Kopfstütze in einer Zeit, ein paar Stunden nur Stress zu reduzieren. Bringen Sie das Tier, um es zu Hause Käfig zwischen Imaging-Sitzungen für Nahrung und Wasser. Potenzielle Stress wird durch Verdunkelung die Raumbeleuchtung und der umgebenden Teil der Maus in einem Gehäuse minimiert.

  1. Am Tag nach der Operation, montieren Sie die Maus auf einer Imaging-Plattform durch den Metallkopf-Bar auf dem Schädel an den Rahmenkopffixierung implantiert zu schrauben.
    Hinweis: Wenn Sie wach Mäuse Bildgebung, die Imaging-Sitzung nicht ein paar Stunden wegen der möglichen Stress induziert durch den Kopf-Rückhalteeinrichtung nicht überschreiten sollte.
  2. Legen Sie die Imaging-Plattform mit dem Kopf bändigen Maus in einem Zwei-Photonen-Imaging-Mikroskop mit 10-facher (0,30 NA) und 40x (0,80 NA) Wassertauchziele.
  3. Einfügen Filterwürfel für FRET imaging (eCFP und Citrine), die einen dichroitischen Spiegel bei 505 nm und Bandpassfiltern aufweist, die zur Messung eCFP und 520 nm bis 560 nm zum Messen Citrine 460 nm bis 500 nm umfassen.
  4. In ACSF auf den gut ausgedünnten Schädel Fenster enthält, und das Eintauchen in Wasser Ziel in das ACSF senken. Verwenden Sie das Okular in Verbindung mit Quecksilberlampe und GFP-Filterwürfel, die Oberfläche des Kortex und Vaskulatur unter dem Fenster zu lokalisieren.
    Hinweis: Das Muster der Vaskulatur unterstützt lokalisieren und Bild die gleiche Region in wiederholten Tagen Bildgebung. Wechseln Sie in das Wasser eintauchen Ziel 40X CNiFERs zu finden, indem Sie manuell die Konzentration auf Oberfläche der Hirnrinde in den Zellen unter Verwendung des GFP-Filterwürfel und eine Quecksilberlampe.
  5. Richten Sie für Zwei-Photonen-Imaging. Wählen Sie die apchenden Lichtweg für Zwei-Photonen-Imaging. Für ein typisches kommerzielles System, verwenden Sie die Software auf zwei-Photonen-Imaging-Modus zu wechseln und Licht zu den Photomultiplier (PMT) in den nichtdescannten Detektoren umleiten. Schalten Sie den nahen Infrarot-Femtosekunden gepulsten Lasers, wählen Sie eine Wellenlänge von 820 nm und eine Leistungseinstellung von 5 bis 15%. Hinweis: 5% Leistung liefert typischerweise ~ 25 mW an der Probe.
  6. Stellen Sie die PMT1 & PMT2 Spannung nahe dem Maximalwert, typischerweise 700-1000 V an der PMT abhängig. Stellen Sie die Verstärkung auf 1 für jeden Kanal und Null die z-Position für das Ziel.
  7. Senken Sie die Ziel ~ 100 bis 200 & mgr; m von der kortikalen Oberfläche und starten Sie die xy-Scan. Stellen Sie die Laserleistung, Verstärkung und PMT - Spannung für jeden Kanal, das heißt eCFP und Citrine, um das Signal-Rausch - Verhältnis der CNiFER Fluoreszenz zu optimieren.
  8. Verwenden Sie die Zoom-Funktion in der Software das Bild auf eine Region zu beschränken, die die CNiFER Zellen sowie eine backgroun enthältd Region. Verwenden Sie eine Abtastrate nicht langsamer als ein Rahmen alle 2 Sek (0,5 Hz) bei 4 & mgr; s pro Pixel. Passen Sie die Linie im Durchschnitt für geeignete Signal-zu-Rausch - Verhältnis, zB Kalman 2 Linie Mittelung.
  9. Zeichnen Sie eine Region-of-Interest (ROI) um CNiFER Zellen, rund um ca. 3 bis 4 Zellen pro Ebene. Echtzeit-Analyse von ROI mittleren Intensitäten einrichten. Starten Erwerb CNiFER Fluoreszenz über die Zeit zu überwachen.
  10. Sammeln von Fluoreszenz CNiFERs vor und während der experimentellen Manipulationen, beispielsweise eine elektrische Stimulation, Stimulation ChR2, Verhalten, wie durch den Benutzer bestimmt.
  11. Wenn die Abbildungs ​​Experiment beendet ist, kehren Sie mit der Maus in seinen Heimkäfig. Wiederholen Sie die Abbildung über Tage, wie gewünscht. Beim erneuten Abbilden der Zellen auf die zuvor erworbenen Nieder Vergrößerung Gefäß Bild beziehen sich auf das gleiche Bildfeld (Schritt 10.4) zu orientieren zurück.
    Hinweis: Implantierte CNiFERs kann für mindestens 7 Tage abgebildet werden.

11. Datenanalyse

  • Öffnen Sie Imaging-Datei und wählen Sie ROIs für CNiFERs und ein ROI für den Hintergrund. Wählen Sie "Reihenanalyse" für beide Kanäle jedes ROI. Export durchschnittliche Fluoreszenzintensität für jeden ROI als tabstoppgetrennte Datei.
  • Verwenden Sie eine mathematische Software (siehe Materialien) Programm Fluoreszenzwerte zu analysieren. Tiefpassfilter (0.3 Hz) jedes Signal und dann die Fluoreszenz-Intensitäten der Hintergrundfluoreszenz in jedem ROI von eCFP und Citrine subtrahieren.
  • Berechnen durchschnittliche Fluoreszenz für Baseline und Verhältnisse zu berechnen, wie in Gleichung 1 beschrieben, um die FRET-Verhältnis & Delta; R (t) / R zu messen.
  • die Empfindlichkeit der CNiFERs, zeichnen Sie die FRET-Verhältnis als Funktion der log-Agonisten-Konzentration zu bestimmen. Fit mit der Hill - Gleichung , die EC 50 und Hill - Koeffizienten (n) unter Verwendung von wissenschaftlichen Statistik - Software und der Hill - Gleichung (Gleichung 2) zu bestimmen.

    • Equation1

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    Representative Results

    A CNiFER wird aus einer menschlichen embryonalen Nieren (HEK 293) -Zellen abgeleitet , die stabil konstruiert ist mindestens zwei Proteine ​​zu exprimieren: eine spezifische G-Protein - gekoppelten Rezeptor (GPCR) und eine genetisch kodierte [Ca 2+] Sensor, TN-XXL. TN-XXL erfährt Fluoreszenz - Resonanz - Energie - Transfer (FRET) zwischen Cyan und Gelb fluoreszierende Proteine, eCFP und Citrine jeweils als Antwort auf Ca 2+ -Ionen 6,15. Die Aktivierung von GPCRs dass Paares endogene G q G - Proteine ​​auslösen einen Anstieg der cytosolischen [Ca 2+] durch den PLC / IP 3 - Weg, was zu einem Anstieg in FRET von der TNXXL Ca 2+ Detektor (Abbildung 1).

    Abbildung 1
    Abb . 1: Schema für die Entwicklung von CNiFERs Top, GPCR-Ca 2+ Signalwegs für die Schaffung eines erforderlichCNiFER Zelle. Unten, die grundlegenden Schritte für CNiFERs mit HEK293-Zellen zu konstruieren. Schritt 1. transduzieren mit genetisch kodierten FRET-basierten Ca 2+ -Detektor (TN-XXL). Schritt 2. Transduktion von G & agr; G-Protein - Chimäre, dh G qs5, G qi5, falls erforderlich. Schritt 3. transduzieren einzigartige GPCR zu CNiFER erstellen. Zwei-Photonen - Anregungslicht (rot) regt eCFP, die FRET erfährt, produziert sowohl eine eCFP Emission (Cyan) und Citrine Emission (gelb). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Der Anstieg der FRET stellt ein schnelles optisches Auslesen der Änderung der Neurotransmitter Ebenen. Um eine CNiFER für einen bestimmten Typ von Neurotransmitter entwickeln, bestimmen zunächst den Typ von G-Protein koppelt an den GPCR. Für G q -gekoppelter GPCRs verwendet die GPCR G q Proteine ​​endogen ausgedrückt inHEK293-Zellen. Für G i / o -gekoppelter GPCRs wird eine klonalen HEK293 Linie zuerst geschaffen , das einen chimären G - Protein exprimiert, die den GPCR an den G q -PLC / IP - 3 - Weg umleitet. Dies wird mit einem chimären G - Protein durchgeführt, G qi5, die G & agr; i in erster Linie q - Sequenz und fünf Aminosäuren des Carboxyl - Terminus von G enthält. Diese fünf Aminosäuren sind ausreichend für G qi5 mit G i / o -gekoppelter GPCRs zu kommunizieren , aber die G q Weg signalisieren durch. Für G s -gekoppelter GPCRs ist ein G qs5 Chimäre 10 verwendet. Die allgemeine Strategie für eine CNiFER Herstellung ist: 1) eine HEK293 klonalen Zell schaffen , die stabil einen optischen Detektor Ca 2+ ausdrückt, das heißt TN-XXL, ein Lentivirus Transduktion von HEK Zellen, 2) stabil eine Protein - Chimäre G exprimieren falls erforderlich, in HEK293-Zellklon exprimierenden TN-XXL, und 3) schaffen eine stabil exprimierende Klon GPCR in den HEK293-Zelleklonen TN-XXL und die chimären G-Protein exprimieren. Die klonalen HEK293 Linie, die den GPCR, hat aber den TN-XXL und chimären G-Protein dient als "Kontrolle CNiFER 'fehlt. Die Steuer CNiFER benötigt , um zu bestätigen , dass die Reaktion aufgrund CNiFER ist spezifisch auf die Aktivierung der Rezeptoren entwickelt, dh D2R und nicht auf die Aktivierung von anderen Rezeptoren endogen in HEK293 Zellen exprimiert wird .

    Zu erzeugen Lentivirus wird ein lentivector Expressionssystem verwendet, beispielsweise pcdh-CMV-MCS-EF1-Puro, welche die genetischen Elemente , die für Verpackungen enthält, Transduktion, stabile Integration des viralen Expressionskonstrukts in genomische DNA und die Expression des Ziel Gensequenz. Um einen hohen Titer von viralen Partikel produzieren, Expression und Verpackung Vektoren transient cotransfiziert in Produzent Säugetierzellen und Virus gesammelt. Es gibt mehrere virale Kernanlagen in den USA, die eine hohe ti erzeugen kann ter Lentiviren. Nach der Infektion von HEK293-Zellen liefert das Puro-Gen für Antibiotika-Resistenz transduziert HEK293-Zellen zu identifizieren.

    Um spezifische klonale Linien zu identifizieren, transduziert werden HEK293-Zellen unter Verwendung einer Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) sortiert System. Das Ziel ist es, einen Klon zu isolieren , die eine hohe Expressionsniveau enthält FRET-basierten Ca 2+ Detektor und die Fähigkeit von FRET unterziehen. In diesem Beispiel einer FACS-Analyse wird die Fluoreszenz der Emission eCFP aufgetragen gegen die FRET-Signal (eCFP Anregungs- und Citrine Emission). Die Kästen Markierungsbereiche (P2 und P3) , die anschließend ausgewählt ( "gated") werden für die Sortierung in 96-Well - Platten (Abbildung 2). Im allgemeinen werden etwa vier 96-Well-Platten sind ausreichend für eine erfolgreiche Erzeugung von CNiFERs zu screenen. Aus diesen vier Platten sind etwa 100 Klone für fluorometrische Plattenleser Analyse geeignet.

    e_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figur 2
    Abbildung 2: Beispiel für FACS Analyse Ein Beispiel für die Ausgabe nach einer FACS - Analyse.. Die graphische Darstellung trägt eCFP Emission ( "475/20-A") in Abhängigkeit von Citrine Emission ( "FRET V-530/30-A"), unter Verwendung von eCFP Anregung für jede Zelle. Regionen P2 und P3 zeigen Bereiche ausgewählt, das heißt, gated, für in einzelne Zellen zu sortieren. Die Farben sind frei wählbar. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Sobald die sortierten Zellen, um eine ausreichende Dichte gewachsen sind, wird die FRET-Reaktion nach Agonisten Aktivierung bestimmt eine 96-Well-fluorimetrischen Plattenleser-System mit Lösung Handhabung ausgestattet. Zur Eingrenzung der Anzahl von Klonen nach unten zu studieren, ein "3-Punkt" Agonist Kurve wird verwendet, um Bildschirm ~100 Klone und wählen Sie CNiFERs mit den besten Antworten. Etwa 10 Klone werden dann weiter analysiert mit Bestimmung der vollständigen Dosis-Antwort mit der kognaten Agonist und die unspezifische Reaktionen mit 12 anderen Neurotransmittern oder Modulatoren sondiert. Ein 96-Loch - Droge Platte als dreifache Konzentration hergestellt (Endkonzentration verdünnt 1: 3 in der Platte) von Arzneimitteln (zB Agonisten, Antagonisten, etc.) in ACSF. In diesem Beispiel wird ein Medikament Platte zum Testen eines D2 CNiFER mit seinem verwandten Agonisten, Dopamin und potenzielle nicht-spezifische Reaktionen mit einer Vielzahl anderer Neurotransmitter und Peptid - Agonisten (Abbildung 3) eingerichtet. Das Rückgrat CNiFER, die den GPCR fehlt, dient als eine wichtige Kontrolle für die neu geschaffene CNiFER.

    Figur 3
    Abbildung 3:. Beispiele für Layout für die 96-Well - Platten Top, Tisch des layout für eine 3x Medikament Platte für fluorometrische Plattenleser einlegen, mit dreifachen Konzentrationen von verschiedenen Neurotransmittern und Peptiden. Unten, Beispiele aus durchsichtigem Kunststoff 96-Well - Platte Droge und schwarze 96-Well - Platte für CNiFERs Säen und in Plattenlesegerät gemessen werden . Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    Stimulation des GPCR wird erwartet , dass die FRET - Antwort als Folge einer Erhöhung von intrazellulärem [Ca 2+] und Detektion von TN-XXL zu erhöhen. Unter diesen Bedingungen wird die durch FRET eCFP und Citrine Annäherung, so daß Erregung eCFP einen kleineren eCFP Emission und größer Citrine Emission erzeugt. In diesem Beispiel Anregung auf 436 nm und Emissionsfilter eingestellt ist , sind 485 ± 7,5 nm für eCFP eingestellt und 527 ± 7,5 nm für Citrine (Abbildung 4). Dreißig Sekunden von baseline Fluoreszenz wird gemessen und dann wurden 50 & mgr; l aus der "dreifachen" Agonist in ACSF Platte wird in jede Vertiefung, die 100 & mgr; l ACSF geliefert (1: 3 Verdünnung). eCFP und Citrine Emissionsfluoreszenz werden alle 3,8 Sekunden für 180 Sekunden gemessen. Hintergrundmessungen werden aus Vertiefungen ohne Zellen genommen und abgezogen, falls erforderlich. Fluoreszenzintensitäten sind normalisiert auf vorge Stimulus Basislinien (F (t) / F (Baseline)), und die Spitzenantworten werden gemessen, um die FRET-Verhältnis (& Dgr; R / R) unter Verwendung der F (t) / F (Basislinie) des 527 zu berechnen nm und 485 nm-Kanäle (Gleichung 1). Eine Dosis - Wirkungs - Kurve wird dann durch Auftragen der FRET - Verhältnis als Funktion der verschiedenen Agonistenkonzentrationen und passen mit der Hill - Gleichung konstruiert , um die EC 50 und Hill - Koeffizienten (5) (Gleichung 2) zu bestimmen. Eine optimale CNiFER zeigt ein großes FRET - Verhältnis und eine entsprechende EC 50 für den artverwandten Agonisten und zeigt wenig oder keine Hintergrund Antworten auf andere neurotransmitter-Agonisten. Im Gegensatz dazu sollte die Steuerung CNiFER zeigen wenig Reaktion auf die artverwandten Agonisten.

    Abbildung 4
    Abbildung 4: Beispiel für Agonist-induzierte FRET Antwort D2R CNiFER FRET Reaktion auf einem Plattenlesegerät mit einer Lösung Abgabesystem gemessen.. (A) Eine graphische Darstellung der FRET - Reaktion, dh eCFP Anregung mit eCFP und Citrine - Emissionen, während der Anwendung von Dopamin (roter Balken) bis D2 CNiFERs. Beachten Sie, dass eCFP Emission ab, während Citrine Emission steigt mit Agonisten (Dopamin). (B) Eine graphische Darstellung der FRET - Verhältnis (Gleichung 1) für die Antwort in (A) Bild von Müller modifizierten et al., 2014 7. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.


    Fig . 5: Beispiele für Dosis - Wirkungs - Kurven für D2 CNiFER (A) Dosis - Wirkungs - Kurven für die Antwort von D2 CNiFERs auf Dopamin (DA, schwarz) und Norepinephrin (NE, grün). Zusätzlich ist die Reaktion der "Kontrolle" der CNiFERs D2R fehlt gezeigt. (B) Das Balkendiagramm zeigt die FRET - Verhältnis Antwort für andere Neurotransmitter und Modulatoren bei 50 nM und 1 & mgr; M. Die Werte sind Mittelwert ± SEM. Abbildung von Müller modifizierten et al., 2014 7. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

    CNiFER Klone können weiter für möglich beurteilt werden Rezeptor-abhängige Desensibilisierung und für ihre zeitliche Auflösung, die Präsentation Scheidungsvon zwei verschiedenen Agonisten Impulse (für Details siehe Muller et al., 2014 7). Nachdem ein CNiFER Klon konstruiert, ist der nächste Schritt , um seine Funktion in vivo zu testen. Um die Fluoreszenz in - vivo - Überwachung, ist es notwendig , eine Zwei-Photonen - Mikroskop zu verwenden. einen ausgedünnten Schädel Fenster Nach der Vorbereitung werden CNiFERs in eine Glaspipette geladen und in Schichten 2/3 Kortex injiziert. Die Maus wird dann für in - vivo - Bildgebung hergestellt , indem ein Deckglas auf den ausgedünnten Schädel befestigt, und Implantieren einer Kopfleiste zur Fixierung des Kopfes während der Bildgebung (Abbildung 6).

    Zu bestimmen , dass die implantierten CNiFERs lebensfähig sind , in vivo, die bekannte Konzentrationen des Agonisten kann in der Nähe der Implantationsstelle injiziert werden und die FRET - Verhältnis 7 bestimmt. Um die Aktivität der implantierten CNiFERs bestätigen, sollte die Eingangsneuronen anregend untersucht werden. Beispielsweise mit dem D2 CNiFER, die Wirkung vondie elektrische Stimulation des Mittelhirns Dopamin-Neuronen, die an der Hirnrinde projizieren wurde untersucht. Eine 0,1 M & OHgr; Wolfram bipolare Elektrode mit einem Spitzentrennung von 500 & mgr; m Stimulierung wurde in der Substantia nigra implantiert (-3.2 mm A / P, -1.3 mm M / L, -4,4 mm D / V) dar. 6 zeigt ein Beispiel eines elektrisch Stimulieren der Substantia nigra bei unterschiedlichen Intensitäten und eine Erhöhung der FRET - Verhältnis für D2 CNiFERs 7 beobachtet. Beachten Sie, dass die systemische intraperitoneale (ip) Injektion eines D2-Rezeptor-Antagonisten, Eticloprid (1 mg / kg), blockiert die D2 CNiFER Antwort. Auf der anderen Seite kann die Injektion von Kokain (15 mg / kg), die Blöcke Wiederaufnahme von Dopamin, 7 des elektrisch evozierten D2 CNiFER Reaktion verbessert.

    Figur 6
    Abbildung 6: Beispiel D2 CNiFER Antwort I Elektrische Stimulation der Substantia Nigra. (A) Eine Karikatur zeigt einen Kopf fixierten Maus vorbereitet für in vivo Zwei-Photonen - Imaging und elektrische Stimulation Ong> n vivo nach. Zwei-Photonen-Licht (rot, 820 nm) für die Anregung und 475 nm Emission für eCFP (blau) und 530 nm Emission für Citrine (grün). (B) Das Liniendiagramm zeigt die FRET - Verhältnis für D2 CNiFER in Kortex injiziert folgende elektrische Stimulation der Substantia nigra, dh 200 & mgr; s - Impulse von 50 bis 300 & mgr; A bei 50 Hz für 500 ms, und im Anschluss an eine elektrische Stimulation in Gegenwart eines D2R Antagonist (Eticloprid) oder Kokain. Abbildung von Müller modifizierten et al., 2014 7. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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    Tabelle 1: Liste der Chemikalien und Reagenzien für die Herstellung von HEK293 Wachstumsmedium und ACSF.

    Tabelle 2
    Tabelle 2: Volumes für Ernte Zellen verschiedener Größe Kulturplatten oder Flaschen.

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    Discussion

    Die Schaffung von CNiFERs bietet eine innovative und einzigartige Strategie zur optischen Messung Freisetzung von Neurotransmittern im Gehirn in vivo. CNiFERs zur Messung extrasynaptischen Freisetzung ideal geeignet, dh Volumenleitung, für Neurotransmitter. Wichtig ist, besitzt jede CNiFER die Eigenschaften des nativen GPCR, eine physiologische optischen Messung der Veränderungen der Konzentrationen von Neurotransmittern im Gehirn bereitstellt. Bisher wurden CNiFERs Acetylcholin (M1-CNiFER) 6, Dopamin (D2-CNiFER) 7 und Norepinephrin (& alpha; 1A-CNiFER) angelegt 7 zu erfassen.

    Im Prinzip kann ein CNiFER für jeden Neurotransmitter geschaffen werden, die ein GPCR-Signale durch. Für den Fall, daß die GPCR - Signale durch G q G - Proteine, keine weitere Modifikation der HEK293 - Zelle benötigt wird. GPCRs , die durch G - Signal - I / O erfordern jedoch Koexpression eines G qi5 chimären G - Proteindie GPCR an den G q / PLC Weg 7.10 zu koppeln. In ähnlicher Weise GPCRs , die durch G S - Signal wird Koexpression eines chimären Proteins G qs5 G erfordern 10. Nach der Fertigstellung wird jeder CNiFER Klon gescreent und nur die CNiFER Klone , die eine Affinität vergleichbar mit dem nativen Rezeptor zeigen wenig oder keine Desensibilisierung und ein Signal-Rausch - Verhältnis , das für die Messung mit in vivo Zweiphotonenmikroskopie geeignet ist, sind für die in vivo - Studien ausgewählt.

    Für in - vivo - Studien, ist es sehr empfehlenswert , die Mäuse mit Cyclosporin zur Behandlung eine mögliche immunologische Reaktion zu minimieren. Es besteht die Möglichkeit der Abstoßung oder eine immunologische Reaktion mit Implantieren menschlicher CNiFER Zellen in das Gehirn von Nagetieren. Dies wurde bisher untersuchten durch Expression von GFAP Prüfung und MAC1 7 nach CNiFER Implantation. CNiFERs schien nicht Glia-Narben zu erzeugen oder eine nennens erzeugenkanten MAC1 Färbung 7.

    Zwei große Probleme bei der Konstruktion von CNiFERs sind Empfindlichkeit und Desensibilisierung zu berücksichtigen. Wenn der EC 50 zu hoch ist, das heißt, eine geringe Affinität, bezogen auf den nativen Rezeptor, kann die CNiFER nicht ausreichende Empfindlichkeit haben kann zur Freisetzung von Neurotransmitter in vivo nachzuweisen. Eine Lösung ist, um Klone zu erneute Kontrolle und einen anderen CNiFER Klon auszuwählen, die eine höhere Affinität hat. Eine alternative Strategie andere Arten von genetisch kodierten fluoreszierenden Ca 2+ -detectors zu testen , wäre , dass eine höhere Ca 2+ Empfindlichkeit aufweisen, die die EC 50 für GPCR - Aktivierung verschieben kann. Weil die CNiFER modular aufgebaut ist, wird sie leicht auf andere Arten von genetisch kodierten Ca 2+ -detectors angepasst, wie GCaMP 16. CNiFER Isolieren Klone mit dem gleichen Rezeptor , aber unterschiedliche EC 50 s könnte zum Verlängern der Dynamikbereich der Erfassungs Freisetzung von endogenem neu vorteilhaft sein ,rotransmitters in vivo.

    Desensibilisierung des CNiFER wird auch ihre Verwendung in vivo begrenzen. Wenn die Spitzenantwort nach und nach mit jedem Impuls des Agonisten abnimmt, dann kann der Rezeptor-Desensibilisierung werden. In diesem Fall prüfen, andere Klone und bestimmen, ob sie auf die gleiche Weise reagieren. Modifikationen an den Rezeptor-Aminosäuresequenz, oder die Verwendung eines anderen Subtyps von Rezeptor kann erforderlich sein, die Agonisten-abhängige Desensibilisierung zu adressieren. Wenn es identifizierten Stellen der Phosphorylierung oder Aminosäuren bekannt sind, dass assoziieren mit G-Protein-Rezeptorkinasen (GRKs), wäre es ratsam, eine nicht-desensibilisierende Variante des GPCR zu konstruieren, durch Mutieren einer oder mehreren Stellen. Der Mechanismus der Desensibilisierung muss für jeden Rezeptor auf einer Fall-zu-Fall-Basis bestimmt werden.

    Bisher wurden CNiFERs nur in oberflächlichen Schichten der Hirnrinde implantiert 6,7 technischen Gründen in der spektroskopischen Bildgebung mit Fluorophore mit Zwei-Photonen - mipie 17,18. In der Zukunft kann es möglich sein CNiFER Technik mit faserbasierten Messungen der Fluoreszenz 19 , so daß CNiFERs kann in subkortikalen Hirnregionen anzupassen implantiert werden.

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    Disclosures

    Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

    Acknowledgments

    Wir danken B. Conklin (University of California, San Francisco) für die Bereitstellung der G qi5 und G qs5 cDNAs, A. Schweitzer für die Unterstützung bei der Elektronik, N. Taylor für die Unterstützung bei Screening von Klonen, Ian Glaaser und Robert Rifkin für Korrekturlesen und Olivier Griesbeck für TN-XXL. (; DA037170 DA029706), dem National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) (EB003832), Hoffmann-La Roche (88610A) und der "Neuroscience Diese Arbeit wurde durch Forschungsförderung durch den US-amerikanischen National Institute on Drug Abuse (NIDA) unterstützt Bezug zu Drogen von Missbrauch "Ausbildungsförderung durch NIDA (DA007315).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro  System Biosciences CD510B-1 Cloning: for generating lentivirus
    12 x 75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube BD Biosciences 352063 FACS
    BD 40 um Falcon cell strainers BD Biosciences 352340 FACS
    0.05% Trypsin EDTA  Invitrogen 25200056 FACS
    96 Well Plate, flat bottom, clear  Corning  3596 FACS
    96 well cell culture plates  Corning  CLS3997 Flexstation
    Optilux black clear bottom  Corning  3603 Flexstation
    Flexstation pipet tips Molecular Devices 9000-0911 Flexstation
    Acetylcholine Chloride   Sigma-Aldrich A2661 Flexstation
    Norepinephrine   Sigma-Aldrich A7256 Flexstation
    Dopamine Hydrochloride   Sigma-Aldrich PHR1090 Flexstation
    GABA   Sigma-Aldrich A2129 Flexstation
    Histamine   Sigma-Aldrich H7125 Flexstation
    Glutamate   Sigma-Aldrich 49621 Flexstation
    Epinephrine   Sigma-Aldrich E4642 Flexstation
    Somatostatin    Sigma-Aldrich S1763 Flexstation
    5HT    Sigma-Aldrich H9523 Flexstation
    VIP  Alpha Diagnostics Inc.    SP-69627 Flexstation
    Orexin A Alpha Diagnostics Inc.    12-p-01 Flexstation
    Substance P   Sigma-Aldrich S6883 Flexstation
    Adenosine Sigma-Aldrich A4036 Flexstation
    Melatonin  Sigma-Aldrich M5250C Flexstation
    Fluorescence Plate Reader & software Molecular Devices Flexstation 3 Flexstation
     DMEM (high glucose) with Glutamax   Life Technologies 10569-010 Tissue culture
     Fetal bovine serum Life Technologies 10082-139 Tissue culture
     Pen/Strep  antibiotics Life Technologies 15140-122 Tissue culture
     Puromycin   InvivoGen ant-pr-1 Tissue culture
     Fibronectin  Sigma-Aldrich F0895 Tissue culture
    CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box Bioexpress D-3508) Tissue culture
    cyanoacrylate glue  Loctite Loctite no. 495 surgery and stereotaxic injection
    plastic paraffin film  VWR Parafilm® surgery and stereotaxic injection
    Nanoinjector Drummond 3-000-204 surgery and stereotaxic injection
    Glass electrodes Drummond 3-000-203G surgery and stereotaxic injection
    hand held drill OSADA Exl-M40 surgery and stereotaxic injection
    Burrs for drill Fine Scientific 19007-05; 19007-07) surgery and stereotaxic injection
    Sterilizing bath FST 18000-45, Hot Bead Sterilizer surgery and stereotaxic injection
    isoflurane chamber/mask Highland Medical Equipment 564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm surgery and stereotaxic injection
    3D scope with arm Zeiss surgery and stereotaxic injection
    fiber optic light surgery and stereotaxic injection
    Betadine  surgery and stereotaxic injection
    70 % (v/v) isopropyl alcohol surgery and stereotaxic injection
    Povidone-Iodine Prep Pads dynarex 1108 surgery and stereotaxic injection
    NaCl 0.9% (injection, USP, 918610) surgery and stereotaxic injection
    CYCLOSPORINE (INJECTION, USP) surgery and stereotaxic injection
    Buprenex (injection) buprenorphine (0.03 μg per g rodent) Sigma-Aldrich surgery and stereotaxic injection
    Ophthalmic ointment  Akorn NDC 17478-235-35 surgery and stereotaxic injection
    Surgifoam Ethicon surgery and stereotaxic injection
    Grip dental cement Dentsply #675571, 675572 surgery and stereotaxic injection
    Instant SuperGlue  NDindustries surgery and stereotaxic injection
    LOCTITE 4041 surgery and stereotaxic injection
    METABOND C&B surgery and stereotaxic injection
    no. 0 cover glass Fisher surgery and stereotaxic injection
    stereotaxic frame  Kopf surgery and stereotaxic injection
    Rectal probe and heating pad FHC 40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe surgery and stereotaxic injection
    optical breadboard for imaging Thorlabs surgery and stereotaxic injection
    Mineral oil Fisher S55667 surgery and stereotaxic injection
    Kwik-Cast (Silicone elastomer) World Precision Instruments surgery and stereotaxic injection
    Suture   Ethicon 18’’, 1667, 4-0 surgery and stereotaxic injection
    Scissors Fine Scientific Tools 91500-09, 15018-10 surgery and stereotaxic injection
    Forcepts Fine Scientific Tools 11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10 surgery and stereotaxic injection
    Student Halsted-Mosquito Hemostats Fine Scientific Tools 91308-12 surgery and stereotaxic injection
    Small Vessel Cauterizer Kit Fine Scientific Tools 18000-00 surgery and stereotaxic injection
    Hot Bead Sterilizers Fine Scientific Tools 18000-45 surgery and stereotaxic injection
    Instrument Case with Silicone Mat Fine Scientific Tools 20311-21 surgery and stereotaxic injection
    Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat Fine Scientific Tools 20810-01 surgery and stereotaxic injection
    2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging Olympus FV1200 MPE in vivo imaging
    Multiphoton laser SpectraPhysics Mai Tai DeepSee in vivo imaging
    Green Laser Olympus 473 nm Laser in vivo imaging
    xy translational base Scientifica MMBP in vivo imaging
    FRET filter cube for YFP and CFP Olympus in vivo imaging
    10x and 40x water immersion objectives Olympus in vivo imaging
    air table Newport in vivo imaging
    custom built light-tight cage Thorlab in vivo imaging

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    References

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    Neuroscience Ausgabe 111 Optical Imaging FSCV Dialyse Volumen Übertragung Neurotransmitter Neuropeptide TPLSM Biosensor GPCR
    Der Bau der Zellbasierte Neurotransmittern Fluorescent Engineered Reporter (CNiFERs) zur optischen Erfassung von Neurotransmittern<em&gt; In Vivo</em
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    Lacin, E., Muller, A., Fernando, M., … More

    Lacin, E., Muller, A., Fernando, M., Kleinfeld, D., Slesinger, P. A. Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo. J. Vis. Exp. (111), e53290, doi:10.3791/53290 (2016).

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