Summary
Vi presenterar ett protokoll för att skapa cellbaserad signalsubstans fluorescerande manipulerade reportrar (CNiFERs) för optisk detektering av volymetriska neurotransmittorfrisättning.
Abstract
Cellbaserad signalsubstans fluorescerande manipulerade reportrar (CNiFERs) tillhandahålla ett nytt verktyg för neuroforskare att optiskt detektera frisättningen av signalsubstanser i hjärnan in vivo. En specifik CNiFER skapas från en human embryonal njurcell som stabilt uttrycker en specifik G-proteinkopplade receptorer, som kopplas till Gq / 11 G-proteiner, och en FRET-baserad Ca2 + -detector, TN-XXL. Aktivering av receptorn leder till en ökning i FRET-signalen. CNiFERs har nM känslighet och en tids svar sekunder eftersom en CNiFER klon utnyttjar den nativa receptorn för en viss signalsubstans, till exempel, D2R för dopamin. CNiFERs direkt implanteras i hjärnan, så att de kan känna frisättningen av neurotransmittorer med en rumslig upplösning på mindre än hundra um, vilket gör dem idealiska för att mäta volym överföring in vivo. CNiFERs kan också användas för att screena andra droger för potentiell korsreaktivitet i vivo. Vi utökade nyligen familjen CNiFERs att inkludera GPCR som kopplar till Gi / o G-proteiner. CNiFERs finns tillgängliga för detektering av acetylkolin (ACh), dopamin (DA) och norepinefrin (NE). Med tanke på att alla GPCR kan användas för att skapa en ny CNiFER och att det finns ungefär 800 GPCR i det mänskliga genomet, beskriver vi här det allmänna förfarandet för att utforma, förverkliga och testa någon typ av CNiFER.
Introduction
För att till fullo förstå hur nervceller kommunicerar i hjärnan, är det nödvändigt att ha en metod för att mäta frisättningen av signalsubstanser in vivo. Det finns flera väletablerade metoder för att mäta signalsubstanser in vivo. En vanligen använd teknik är mikrodialys, i vilket en kanyl införes in i hjärnan och en liten volym av cerebrospinalvätska uppsamlas och analyseras med användning av HPLC och elektrokemisk detektion 1. Mikrodialys har en rumslig upplösning av storleksordningen några få diametrar av sonden, t.ex., ~ 0,5 mm för en mikrosond 200 ^ m diameter. Den temporala upplösningen av denna teknik är emellertid långsamt på grund av provtagningsintervall som vanligtvis varar ~ 5 min eller längre en. Dessutom är analyser inte görs i realtid. En annan teknik är snabb scanning cyklisk voltametri (FSCV), som använder en kolfiber sond som sätts in i hjärnan. FSCV har utmärkt temporal upplösning (subsecond), hög känslighet (nanomolar) och spatial upplösning med sond diametrar av 5 till 30 ^ m. Dock är FSCV begränsad till sändare som producerar en karakteristisk oxidation och reduktion profil med spänning på ett kol potentiometrisk prob 2.
En tredje teknik för att mäta signalsubstanser är direkt genom genetiskt kodad neurotransmittor (NT) biosensorer 3. Med denna metod, är ett fusionsprotein som skapats som innehåller en ligand-bindande domän för en sändare som är kopplad till en fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) -baserad par av fluoroforer 4 eller en permuterade GFP 5. Till skillnad från de två föregående metoderna är dessa biosensorer genetiskt kodas och uttryckas på ytan av en värdcell, såsom en neuron, genom produktionen av transgena djur eller akut med användningen av virala medel för att infektera celler. Hittills har genetiskt kodade biosensorer har endast utvecklats för detecting glutamat och GABA 3-5. Begränsningar med dessa tekniker har varit den låga känsligheten, i nM-området, och oförmågan att expandera detekteringen till det stora antal sändare, t.ex. klassiska neurotransmittorer, neuropeptider och neuromodulatorer, som signalerar genom G-proteinkopplade receptorer (GPCR). I själva verket finns det nästan 800 GPCR i det mänskliga genomet.
För att åtgärda dessa brister, har vi utvecklat ett innovativt verktyg för att optiskt mått frisättning av någon signalsubstans som signalerar genom en GPCR. CNiFERs (cellbaserad signalsubstans fluorescerande manipulerade reportrar) är klonala HEK293-celler manipulerade för att uttrycka en specifik GPCR som, när de stimuleras, utlöser en ökning av intracellulär [Ca2 +] som detekteras av en genetiskt kodad FRET-baserade Ca2 + sensor, TN-XXL. Sålunda CNiFERs omvandla neurotransmittorreceptorbindning in i en förändring i fluorescens, vilket ger en direkt och i realtid optiska read-slut lokal neurotransmittoraktivitet. Genom att utnyttja den nativa receptorn för ett givet neurotransmittor, CNiFERs behålla den kemiska specificitet, affinitet och tidsmässig dynamik hos de endogent uttryckta receptorer. Till dags dato har vi skapat tre typer av CNiFERs, en för detektering av acetylkolin med hjälp av M1-receptorn, en för att detektera dopamin med hjälp av D2-receptorn, och ett för att detektera noradrenalin med hjälp av a1a receptor 6,7. Den CNiFER tekniken är lätt expanderbar och skalbar, vilket gör det mottagligt för någon typ av GPCR. I detta JUPITER artikeln beskriver vi och illustrerar metoden att utforma, förverkliga och testa in vivo CNiFERs för alla program.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utförs i denna studie är förenliga med Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) riktlinjer, och har godkänts av de IACUCs på Icahn School of Medicine på berget Sinai och University of California, San Diego.
1. Generera GPCR-uttryckande Lentivirus för omvandla HEK293 Cells
- Erhålla cDNA för en specifik GPCR från en kommersiell källa, t ex, cdna.org. Alternativt amplifiera GPCR-genen från ett cDNA-bibliotek med användning av PCR. Skaffa en lentivirus-uttryckvektor, såsom pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro (pCDH). Använda denna vektor för att propagera den DNA samt för att generera lentivirus.
- Klona GPCR cDNA in i lentivirus-uttryckande vektorn genom PCR. Se Lorenz 8, för mer information om PCR subkloning.
- Expandera och rena GPCR-pCDH DNA med användning av en endotoxin-fri "maxi" prep kit enligt tillverkarens instruktioner. Kontrollera att GPCR cDNA subklonades in pCDH är mutation-gratis genom DNA-sekvensering.
Obs: Före inlämning av DNA för virusproduktion, smälta en portion med lämpligt restriktionsenzym för att bekräfta storleken på insatsen och renhet av DNA. - Skapa lentivirus med hjälp av en virus core facility, såsom en vid Salk Institute, University of Penn., Eller University of North Carolina, etc, eller generera in-house 9. Använda cirka 25 | j, g (> 1 ^ g / l) av endotoxin-fritt DNA för transfektion av HEK-celler i en T75-flaska. Se till att DNA: t är av hög renhet, med en absorbans-förhållande (A 260 / A 280) av ~ 1,8.
Obs: virustitrar ~ 10 11 -10 12 GC / ml är optimala för transduktion av HEK293-celler.
2. Välja HEK293 / TN-XXL Backbone Celltyp för odling in vitro
Notera: Bestäm G-proteinkopplingsspecificitet, t.ex, G i / o, Gq / 11, eller G s G-proteiner, av GPCR, eftersom detta dictates huruvida en G-proteinchimär behövs för CNiFER. För G q -kopplade receptorer, t.ex. M1 muskarinreceptor väljer HEK293 / TN-XXL (# 3G8) som ryggraden HEK293 celltyp. För G i / o -kopplade receptorer, krävs det chimära G-protein G qi5 10. För G s -kopplade receptor behövs G qs5 chimär 10. I detta protokoll, är byggandet av en D2R CNiFER används som ett exempel. D2R signaler genom G i / o G-proteiner och kräver HEK293-celler som stabilt uttrycker den chimära G-protein, G qi5 t.ex. HEK293 / TN-XXL / G qi5 _ # qi5.6.
- Skaffa HEK293 / TN-XXL / G qi5 _ # qi5.6 klonala celler från ett forskningslabb. Obs: Följande klonala celler, HEK293 / TN-XXL (# 3G8) för G q -kopplade receptorer, HEK293 / TN-XXL / G qi5 (# qi5.6) för G i / o -kopplade receptorer, och HEK293 / TN -XXL / G qs5 (# qs5.47) för G s -kopplade receptors, är fritt tillgängliga på begäran 6,7.
- Växa och expandera HEK293 / TN-XXL / G qi5 _ # qi5.6 till ~ 90% konfluens i en T25 kolv med 5 ml HEK293 tillväxtmedium (tabell 1). Odla cellerna i en fuktad inkubator vid 37 ° C med 5% (volym / volym) CO2.
Notera: Allt arbete med odling av HEK293-celler bör utföras med användning av standard sterila vävnadsodlingstekniker. - Skörda HEK293-celler genom att först aspirera mediet från T25-kolv. Tvätta cellerna försiktigt genom tillsats av 5 ml PBS och gunga kolv.
- Avlägsna PBS och tillsätt 1 ml av 0,05% (vikt / vol) trypsin / EDTA (tabell 2). Inkubera under 1 till 2 minuter vid 37 ° C med 5% (volym / volym) CO2.
- Samla celler och överför till sterila 15 ml koniska rör. Centrifugera i 5 minuter vid 1000 x g i en cellkultur centrifug. Aspirera supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 5 ml HEK293 tillväxtmedia. Räkna cellerna i en hemocytometer med användning avtrypanblått. Beräkna celltätheten och gå vidare till steg 3.
3. Lentiviral Transduction av HEK293 / TN-XXL / Gqi5 celler
- Seed en T25 kolv med 0,7 x 10 6 HEK293 / TN-XXL / G qi5 celler. Odla cellerna i en fuktad inkubator vid 37 ° C med 5% (volym / volym) CO2 tills ~ 50% konfluenta, efter cirka en dag. Frysa återstående cellerna (steg från 8,2 till 8,3). Dessa celler kommer att fungera som CNiFER kontroll, det vill säga en CNiFER som saknar GPCR.
- På dagen för infektionen, späd GPCR som uttrycker lentivirus (steg 1,4) till en slutlig koncentration av ~ 10 9 GC / ml i en total volym av 2 ml HEK293 tillväxtmedium (tabell 1). Till exempel, tillsätt 20 pl 10 11 GC / ml virus till 2 ml medium i en T25 kolv.
Obs! Virustiter information bör tillhandahållas av viruskärnan anläggningen. Kombinera lentivirus och media i ett centrifugrör och finfördela försiktigt. Höga titrar av lentivirus är skyddsnivå 2 (BSL-2). - Aspirera media från T25 kolven. Tillsätt 2 ml av virus / media blandningen från steg 3,2. Inkubera T25 kolv O / N vid 37 ° C med 5% (volym / volym) CO2.
- Efter en dag av infektion, aspirera virus / media blandningen och ersätta den med HEK293 tillväxtmedier innehållande puromycin (2 ug / ml; Tabell 1). Puromycin selekterar för de transducerade cellerna. Inkubera kolven vid 37 ° C med 5% (volym / volym) CO2 tills ungefär 90% konfluenta efter ~ 1-2 dagar.
- Bered en 96-brunnars platta (svart med klar botten) belagd med fibronektin, för att generera en 10-punkts-agonist / aktiveringskurvan i steg 4,1. I en steril huv, tillsätt 50 | il fibronektin (5 | ig / ml) per brunn i raderna A och B i 96-brunnar. Inkubera plattan vid rumstemperatur under 1 timme. Skölj två gånger under 5 minuter per sköljning med PBS. Tillsätt 50 pl av HEK293 tillväxtmedier och inkubera O / N vid 37 ° C med 5% (volym / volym) CO2.
Obs: Fibronectin behandlade plattor är kommersiellt tillgängliga. - Skörda cellerna i T25-kolv såsom beskrivits i steg 2,3-2,6 (tabell 2).
- Resuspendera cellpelleten i 5 ml HEK293 tillväxtmedia. Seed en T25 kolv med 1,5 ml celler för FACS-analys. Också utsäde en T75 kolv med 1 ml celler för frysning och lagring (se steg 8,2-8,3)
- För 10-punkters-agonist kurva, utsäde de två första raderna (A och B) av en fibronektin-belagda 96-brunnsplatta (från steg 3,5) med 100 pl av cellsuspensionen per brunn.
- Inkubera HEK293-celler som växer i en T25-kolv, en T75-kolv och en 96-brunnar tills om ~ 90% konfluenta vid 37 ° C med 5% (vol / vol) CO2, efter ~ 1-2 dagar.
4. FACS och isolering av Single CNiFER kloner
- Använd 96-brunnar för att generera en 10-punkters agonistaktivering kurva.
Notera: Före start fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) analys, är det viktigt att bekräftauttryck av GPCR genom att testa omvandlade celler för en agonist svar (10-punkts-agonist kurva). Detta test utförs med användning av en fluorometrisk plattavläsare.- Förbered en drogplatta för 10-gradig agonistaktivering kurva. Välj 10 olika agonist koncentrationer som fästet förväntade EC50, som kan bestämmas från litteraturen.
Notera: Drogen plattan innehåller 3-faldigt för varje koncentration (i duplikat) för att justera för den 1: 3 spädning i CNiFER plattan. Exempelvis läkemedlet plattan för att testa en D2 CNiFER innehåller 10 olika koncentrationer av dopamin vid 3-faldiga koncentrationer; 0,2, 0,5, 1, 3, 5, 10, 20, 30, 50, och 1000 nM. I CNiFER plattan därför de slutliga koncentrationerna av dopamin är 0,067, 0,167, 0,333, 1,00, 1,67, 3,33, 6,67, 10,0, 16,7, och 333 nM. - Förbered agonist lösningar med artificiell cerebrospinalvätska (ACSF) (tabell 1). Använd två brunnar för "ACSF", till exempel, A1 och A2,och två brunnar för "inga celler", till exempel, B1 och B2.
Obs: Förbered olika koncentrationer av läkemedel med hjälp av en serieutspädningsmetod. Skapa en mall för att hålla reda på CNiFER kloner och de läkemedelskoncentrationer (Figur 3). - Använda programvaran för att programmera 96 brunnar fluorometrisk plattavläsare för att mäta FRET och utför överföringar lösning.
- Ställ in plattläsare temperaturen till 37 ° C.
- För mätning FRET med TN-XXL ställer excitationsvåglängden till 436 ± 4,5 nm (mitten ± HWHM). Ställ in emissionsfilter till 485 ± 7,5 nm för eCFP och till 527 ± 7,5 nm för Citrine. Ställa cutoff filter på 475 och 515 nm för eCFP och Citrine, respektive.
- Programmera plattläsare för att mäta utsläpp vid 485 nm och 527 nm var 4 sek för totalt 180 sek. Välj alternativet för att leverera 50 pl från 3-faldig läkemedels plattan till 100 ul i CNiFER plattan, efter att ha inhämtat 30 sekbaslinje fluorescens.
- Aspirera media från raderna A och B och tillsätt 100 pl ACSF till 96 brunnar CNiFER platta som är ~ 90% konfluenta (steg 3,9).
- Ladda 96-brunnars CNiFER plattan och "tre-faldigt" drog plattan i plattläsare. Tillåta ~ 30 min för att jämvikta plattorna vid 37 ° C. Starta sedan programmet.
- För att analysera plattläsare uppgifter, exportera fluorescensvärdena till ett kalkylblad. Skapa en formel för att subtrahera bakgrundsmätningar (tagna för varje signal från brunnar utan celler) från brunnar med CNiFERs. Normalisera fluorescensintensiteter till pre-stimulans baslinjer, F Citrin (t) / F Citrin (baslinje), och beräkna FRET ratio (AR / R;. Ekvation 1) med toppsvar på 527 nm och 485 nm utsläpp (se steg 11 ).
Obs: Om det finns en betydande förändring i AR / R med agonisten, indikerar detta uttryck av GPCR och man kan gå vidare till FACS-analys (steg 4,2). Om there finns ingen FRET svar med agonist, felsöka genom användning av en Ca2 + jonofor, t.ex., A21387, för att testa Ca 2 + respons och bekräfta att FRET-baserad sensor fungerar. Om jonoforen fungerar då receptorn inte sannolikt uttrycks.
- Förbered en drogplatta för 10-gradig agonistaktivering kurva. Välj 10 olika agonist koncentrationer som fästet förväntade EC50, som kan bestämmas från litteraturen.
- På dagen före FACS, förbereda fyra 96-brunnars plattor belagda med fibronektin (se steg 3,5) för uppsamling av sorterade celler. Tillsätt 50 pl av HEK293 tillväxtmedier och inkubera O / N vid 37 ° C med 5% (volym / volym) CO2.
- Förbereda 5% (vikt / volym) BSA i PBS (5 g / 100 ml) och filtrering (0,2 ^ m) i en steril flaska.
- Skörda cellerna odlas i T25 kolven (se steg 2.3-2.5, tabell 2). Resuspendera cellpelleten i 4 ml 5% (vikt / volym) BSA i PBS. Centrifugera cellerna vid 1000 xg under 5 min.
- Suga ut mediet och återsuspendera cellpelleten i ~ 5 ml 5% (vikt / volym) BSA i PBS för att ge en slutlig koncentration av ~ 5 x 10 6 celler / ml.
Obs: Kontrollera med FACS core facilitet för specifika krav på celltäthet och sorteringsvillkor. - Filtrera de återsuspenderade cellerna med en 40 | im cellfilter för att ta bort klumpar. Överföra celler till en 5 ml polypropylen rundbottnad röret. Placera röret på is under transport till FACS anläggning.
- Sortera transducerade HEK293-celler vid en FACS anläggning. Programmera parametrar på en FACS flödescytometer enligt följande: set 4 ° C för provhållaren, 100 pm för munstycket och 20 psi. Baserat på den försorterar analys väljer celler, dvs välja en "port", som har en stor eCFP fluorescens (eCFP excitation, eCFP emission) och stora FRET (eCFP excitation, utsläpp Citrin) fluorescens (se resultat nedan, Figur 2 ).
- Insättning individ, sorterade cellerna i en 96-brunnars platta som framställts i steg 4,2, med en klon per brunn innehållande 50 pl av HEK293 tillväxtmedia med puromycin. Tillsätt 50 pl av HEK293 odlingsmedium med puromycin (Table 1) för totalt 100 | il per brunn. Upprätthålla celler O / N vid 37 ° C med 5% (volym / volym) CO2.
Obs: HEK293 odlingsmedier innehåller puromycin för urval av omvandlade celler.
5. odling och expansion av sorteras, Klon CNiFERs
- Bibehålla de CNiFERs i 96-brunnars plattor genom att ta bort 50 | il av gamla medier från varje brunn och ersätts med 50 pl av färsk HEK293 tillväxtmedia innehållande puromycin (tabell 1). Upprepa detta var 5 till 7 dagar tills ~ 90% konfluenta efter 2-3 veckor.
- Harvest CNiFER celler genom att försiktigt aspirera media och sköljning en gång försiktigt med PBS. Avlägsna PBS och tillsätt 20 | il av 0,05% (vikt / vol) trypsin / EDTA. Inkubera under 1 till 2 minuter vid 37 ° C med 5% (volym / volym) CO2.
- Tillsätt 100 pl av HEK293 tillväxtmedia till trypsinbehandlade celler och återsuspendera cellerna. Överför innehållet till en 24-brunnsplatta innehållande 400 | il färskt HEK293 tillväxtmedier with puromycin. I 24-brunnar, underhålla celler genom att ersätta 250 pl HEK293 tillväxtmedier var 5-7 dagar tills brunnarna är ~ 90% konfluenta.
6. Identifiera kandidat CNiFERs Baserat på FRET svar Använda Fluorometrisk Plate Reader
Obs: Med fyra 96-brunnsplattor efter FACS, bör det vara> 100 testbara kloner som överlever och expandera till 24-brunnar skede eftersom många av de ursprungliga klonerna inte växer. För att identifiera potentiella kandidat CNiFERs, använd en 3-punktsanalys för FRET svar med besläktat agonist, t ex dopamin för D2R.
- När cellerna är ~ 90% konfluenta i 24-brunnar, försiktigt suga ut mediet. Lägga ~ 100 | il av 0,05% (vikt / vol) trypsin / EDTA och inkubera i 1-2 min vid 37 ° C med 5% (volym / volym) CO2. Tillsätt 400 pl av HEK293 odlingsmedium till trypsin-behandlade celler och blanda cellerna genom försiktig finfördelning.
- Ställ in 3-punkts-agonist kurvan för den initiala screeningen av clones. För varje CNiFER klon, dvs en av brunnarna från 24-brunnar, alikvot 100 pl av cellsuspensionen (~ 4 x 10 3 celler / brunn) i var och en av tre brunnar, t.ex., A1, A2, A3, av ett fibronektin-belagda 96-brunnsplatta (svart med klar botten) (se steg 3.5).
- Överföra de återstående ~ 200 | il av cellsuspension till en 12-brunnars platta innehållande 1,000 | il HEK293 tillväxtmedia (1,2 ml slutlig volym). Inkubera båda plattorna vid 37 ° C med 5% (vol / vol) CO2, tills ~ 90% konfluenta. Den 96-brunnar är för den fluorometriska analysen och den 12-brunnar är för växer och expanderar klonerna.
- För 3-punktsanalys, bestämma tre olika koncentrationer av agonist som är 0,1-, 1,0- och 10 gånger EC50 för den specifika GPCR. Förbered agonistkoncentrationer i en drogplatta såsom beskrivs i steg 4.1.1-4.1.2. Utför en fluorometrisk plattläsare analys såsom beskrivits i steg 4.1.3-4.1.5.
- Beräkna FRET-förhållande (AR / R) som beskrivs i steg 4.1.6. Välj CNiFERs som har lämplig känslighet och största FRET svar för expansion, frysning tillbaka, och mer omfattande analyser (steg 7).
- För kloner som valdes i steg 6,5 och växer i 12-brunnar, ta bort och ersätta 600 pl av de HEK293 tillväxtmedier var 5 till 7 dagar, tills ~ 90% konfluenta.
- Successivt utöka kloner från en 12-brunnar till en 6-brunnar, och därefter till en T25 kolv (steg från 2,3 till 2,6 och tabell 2). När T25 kolven är ~ 90% sammanflytande, skörd celler såsom beskrivits (steg från 2,3 till 2,5). Resuspendera cellpelleten i 5 ml HEK293 tillväxtmedia.
- Tillsätt 1 ml cellsuspension till en T75-flaska med 9 ml av HEK293 tillväxtmedia. Använda de återstående 4 ml av cellsuspensionen för kryoskydd och lagring i flytande N2 (steg 8,2-8,3). Förbered åtta 1,5 ml kryorör och placera på is.
- I T75 kolven, underhålla celler genom att ersätta media wte färsk HEK293 tillväxtmedium, t ex 10 ml var 3-5 dagar tills 70-80% sammanflytande, efter ~ 1-2 veckor.
7. slutliga valet av CNiFER kloner Använda Fluorometrisk Plate Reader
- På dagen före plattläsare analysen:
- Harvest celler från en ~ 90% konfluenta T75 kolv (se steg 2,3-2,6, tabell 2). Ympa en 96-brunnars fibronektin-belagd platta (svart med klar botten) vid 5 x 10 4 / brunn med ~ 100 | il cellsuspension. Notera: En klon distribueras till en enda 96-brunnsplatta.
- Förbered en drogplatta för omfattande screening av CNiFER kloner särskilja specifika agonist svar från icke-specifika CNiFER svar.
- För att generera en full dos-responskurva, väljer 10 olika agonistkoncentrationer runt den förutspådda EC50. Använd två brunnar för "inga celler" och två brunnar för 'ACSF.
- För att bestämma icke-specifika svar, väljer three koncentrationer av 12 olika neurotransmittorer eller modulatorer (72 brunnar) (Figur 3). Liksom agonist, innehåller läkemedlet plattan 3-faldiga koncentrationer i duplikat. Till exempel, 100 pl av tre olika koncentrationer av acetylkolin, glutamat, orexin, VIP, adenosin, serotonin, noradrenalin, GABA, substans P, melatonin, somatostatin och histamin, var och en på en 3-faldig koncentration av 50, 1000, och 3000 nM laddas in i 96-brunnsdrogplatta.
- Ställ in parametrarna på fluorometriska plattläsaren för att mäta FRET och utföra överföringar lösning som beskrivs i steg 4.1.3-4.1.5.
- För att analysera hela dos-responskurva, beräkna topp FRET ratio (AR / R) (steg 4.1.6), tomt som en funktion av log agonist koncentration och passar med Hill ekvation (steg 11,4). Bestäm EC50, Hill koefficient, och maximal FRET förhållandet. För 12 andra signalsubstanser / modulatorer, tomt topp AR / R som en funktion of läkemedelskoncentration.
- Välja ~ 10 CNiFER kloner som har en stor FRET förhållande, en lämplig EC50 för den besläktade agonist, och liten eller ingen bakgrundssvar till andra neurotransmittor agonister (icke-specifik respons).
8. Freeze-back Valda CNiFER Kloner
- Använda en ~ 90% konfluenta T75-flaska av en enskild CNiFER klon. Harvest celler såsom beskrivits (steg från 2,3 till 2,5, tabell 2). För att frysa cellerna, resuspendera cellpelleten i 5 ml HEK293 tillväxtmedier. Märk tio 1,5 ml kryorör och ligger på is.
- För kryoskydd, blanda cellerna 1: 1 med 20% (volym / volym) DMSO i HEK293 tillväxtmedier, t ex, 5 ml av 20% (volym / volym) DMSO / medieblandningen blandades försiktigt med 5 ml cellsuspension (slutlig koncentrationen av DMSO är 10%).
- Alikvotera 1 ml i varje cryotubes. Frysa rör med celler i en -80 ° C frys O / N, i ett skumisolerad låda (se Material). Överföring kryorör att LIQUid kväve för långtidslagring.
9. CNiFER Implantation in Mouse Cortex
- Sterilisera alla kirurgiska verktyg i en autoklav före operationen. Förbered en halv sterilt område för kirurgi genom att torka med 70% etanol och om en ren lab blöja.
- Förbered CNiFER injektion pipett genom att dra en glaskapillär (id 0,53 mm) på en vertikal elektrod avdragare. Använd ett par ingen. 5 fin spets pincett för att bryta spetsen av elektroden till en diameter på ~ 40 | im.
Obs: Detta uppnås bäst under ett stereozoom-mikroskop med en graticule. - Söva en vuxen (postnatal dag 60-90) C57BL / 6-mus med isofluran: 4% (v / v) för induktion och 1,5 till 2,0% (volym / volym) för underhåll. Använd svans eller tå nypa för att se till att musen är helt bedövad.
Obs: Åter nypa med jämna mellanrum och bedöma morrhår ryckningar hela operationen att omvärdera anestesidjupet. - Täck ögonen med oftalmologiska salva till pRevent torkning. Montera musen i en stereotaktisk ram med örat barer. Upprätthålla musen kroppstemperaturen vid 37 ° C med användning av en värmedyna regleras av en rektal sond.
- Raka ett område ungefär 5 mm x 12 mm med ett djur rakapparat. Tillämpa Betadine följt av 70% (volym / volym) isopropanol. Använda ett skalpellblad för att skära och ta bort huden över skallen ytan. Använda ett skalpellblad för att ta bort benhinnan från ytan av skallen. Exponera och rengör ytan av skallen, som beskrivits för stereotaktisk kirurgi 11.
- Sänka ett tomt glas-pipett till bregma och registrera antero-posterior (A / P) och medio-laterala (M / L) koordinater. Med hänvisning till mushjärna atlas, beräkna positionen av injektionsstället. Flytta pipett till målplatsen och markera skallen för efterföljande fönster bildning. Se Cetin et al. För mer information om stereotaktiska injektioner med gnagare 11.
Notera: Injektionsstället och fönster att bero på regjon som skall studeras och fördelningen av neurotransmittor eller peptidfrigörande projektioner i hjärnbarken. Till exempel, i en nyligen publicerad 7 samordnar stereotaxic 1,0-2,0 mm A / P och 1,0-2,0 mm M / L användes för att injicera CNiFER celler i frontala cortex för in vivo avbildning av dopaminfrisättning under klassisk betingning . - Bildning av en 2 mm x 3 mm förtunnas-skalle fönster som tidigare beskrivits 12,13.
Notera: Benet i fönstret bör vara 15-20 | j, m tjockt. De små vita fläckar i benet bör inte vara synlig när skallen ytan fuktas, om benet är tillräckligt förtunnas 12,13. - Placera en ACSF blöt svamp på fönstret för att hålla den fuktig samtidigt förbereda celler att injicera.
- Skörda CNiFER klon som odlades i en T75 kolv till ~ 80% konfluens. Aspirera media och tvätta cellerna med steril PBS.
Obs: Trypsin har utelämnats för dessa steg. - Ta bort PBS och använda 10 ml of ACSF för att lösgöra cellerna från botten av kolven. Mal sönder cellerna för att dissociera cellklumpar. Centrifugera och suspendera pelleten i 100 pl ACSF. Centrifugera i 30 s vid 1400 xg och avlägsna supernatanten, vilket lämnar en pellet täckt i ACSF. Detta steg ger en klump av celler i suspension.
- Återfyllning injektionen pipett framställts i steg 9,2 med mineralolja, ladda pipett på en nanoinjector, och avancera kolven att mata en liten pärla av olja. Sätt 5 pl CNiFER cellsuspensionen på en remsa av plast paraffin filmen nära beredningen musen. Utarbeta antingen CNiFERs eller styra CNiFER celler till drog pipetten.
- Flytta pipetten till målet X och Y-koordinater, dvs A / P och M / L antecknade i steg 9,5. Sänk pipett piercing uttunnade skallen, och fortsätter att ~ 200-400 um under skallen ytan, att sätta CNiFER celler i skikt 2/3 av cortex.
- Injicera ~ 4,6 nl av CNiFER celler vid den djupaste platsen med nanoinjecTor, notera rörelse i oljan och cell gränssnitt och sedan vänta i 5 minuter för att cellerna att fördela. Återkalla pipetten ~ 100 um och injicera en annan ~ 4,6 nl av CNiFER celler, vänta fem minuter. Sedan återkalla pipetten sakta och försiktigt för att förhindra återflöde av CNiFERs. Upprepa injektionen vid ett eller flera angränsande platser.
- Upprepa injektionen steg från 9,8 till 9,12 med kontroll HEK293-celler (dvs, HEK293 / TN-XXL / G qi5 klon saknar GPCR). Separera CNiFER och kontrollera cellinjektionsställen vid ~ 200 nm.
- Efter avslutad cell implantationer, skölj tunnas-skalle fönster med ACSF och vänta på skallen för att torka. Applicera en droppe cyanoakrylatlim (se Material) över fönstret och snabbt placera en färdigskurna steril täckglaset ovanpå limmet. Tryck försiktigt täckglaset mot skallen under några sekunder. Låt limmet torka i 2 min 12,13.
- Försegla kanterna på täckglaset med dentalcement och formen awell runt fönstret för att hålla vatten för doppmålet.
- För immobilisering musens huvud under avbildning, bifoga en specialbyggd huvud-bar med en liten droppe cyanoakrylatlim bakom fönstret (se 14 för mer information om dimension och material). Låt limmet torka ordentligt och sedan lägga till ytterligare dentalcement att ytterligare förstärka specialbyggd huvud-bar.
- Täcka resten av skallen ytan, med undantag för fönstret, med ett skikt av dentalcement. Se till kanterna på huden täcks av cement och låta det torka i 20 min.
- Efter operationen, stopp isofluran administration och lämna musen på en värmedyna i en bur tills den återhämtat sig fullständigt från anestesin. Injicera 5% (vikt / volym) glukos i salin (se) för rehydrering och 0,05 till 0,1 mg / kg buprenorfin (ip, omedelbar frisättning) för postoperativ smärtlindring.
Obs! För att minimera potentiell immunologisk reaktion på den mänskliga CNiFERs, injicera musen dagligen med 20 ul / 100 g cyklosporine (ip) med start dagen före injektion av CNiFERs. - Återgå musen till sin hemma bur för mat och vatten.
10. In vivo avbildning av CNiFER kloner
Obs: Live avbildning sker med möss med användning av en två-photon mikroskop och ett huvud-fast apparat. Det behövs ingen bedövning under avbildning sessioner. När avbildning djur i vaket tillstånd, begränsa nack till bara några timmar i taget för att minska stress. Tillbaka djuret till den buren mellan avbildning sessioner för mat och vatten. Potentiella stress minimeras genom mörkare rummet ljus och omgivande en del av musen i en låda.
- På dagen efter operationen, montera musen på en avbildning plattform genom att skruva metallhuvud-bar implanteras på skallen till huvudfixeringsramen.
Obs: När avbildning vakna möss bör avbildning session inte överstiga ett par timmar på grund av den potentiella stress som huvudstödet enhet. - Placera bildgivande plattform med den huvudåterhåll mus i en två-foton-avbildning mikroskop utrustat med en 10X (0,30 NA) och 40X (0,80 NA) vattenimmersionsobjektiv.
- Infoga filter kub för FRET avbildning (eCFP och Citrin) som har en dikroisk spegel vid 505 nm och bandpassfilter som spänner över 460 nm till 500 nm för att mäta eCFP och 520 nm till 560 nm för att mäta Citrine.
- Lägg ACSF till brunnen innehållande tunnas-skalle fönster och sänka nedsänkning i vatten mål i ACSF. Använda okularet i samband med kvicksilverlampa och GFP filterkuben att lokalisera ytan av cortex och vaskulaturen under fönstret.
Obs: Mönstret av kärl hjälper lokalisera och bild samma region under upprepade dagar avbildning. Växla till 40X nedsänkning i vatten mål att lokalisera CNiFERs genom att manuellt fokusera på ytan av cortex över cellerna med hjälp av GFP filter kub och en kvicksilverlampa. - Ställ upp för två-photon avbildning. Välj apenliga ljusbanan för två-foton-avbildning. För en typisk kommersiellt system, använda programvaran för att byta till två-photon imaging läge och omdirigera ljus till fotomultiplikatorrören (PMT) i de icke-descanned detektorer. Slå på nära infraröd femtosecond pulsad laser, välj en våglängd på 820 nm och en effektinställning på 5-15%. Obs: 5% effekt ger vanligtvis ~ 25 mW vid provet.
- Ställa in PMT1 & PMT2 spänning nära den maximala värde, typiskt 700-1,000 V beroende på PMT. Ställ in förstärkningen till ett för varje kanal och noll z-positionen för målet.
- Sänk målet ~ 100 till 200 um från kortikala ytan och starta xy skanningen. Justera lasereffekt, förstärkning, och PMT spänning för varje kanal, dvs eCFP och Citrin, för att optimera förhållandet signal-brus av CNiFER fluorescens.
- Använder zoomningsfunktionen i programvaran för att begränsa bilden till en region som innehåller de CNiFER cellerna samt en background region. Använd en svephastighet inte långsammare än en ram varje 2 sek (0,5 Hz) vid 4 ps per pixel. Justera linje genomsnitt för lämplig signal-brusförhållande, t.ex. Kalman två linjemedelvärdes.
- Rita en region av intresse (ROI) runt CNiFER celler, som omger ca 3 till 4 celler per plan. Ställ in realtidsanalys av ROI genomsnittliga intensiteter. Starta förvärv för att övervaka CNiFER fluorescens över tiden.
- Samla fluorescens från CNiFERs före och under experimentella manipulationer, t.ex., elektrisk stimulering, ChR2 stimulans, beteende, som bestäms av användaren.
- När avbildningsexperiment sker återgång musen till sin hemma bur. Upprepa avbildning över dagar, allt efter önskemål. Vid åter avbildning cellerna hänvisar till tidigare förvärvade lågförstorande kärl bilden för att orientera tillbaka till samma bildfältet (steg 10,4).
Obs: Implanterade CNiFERs kan avbildas i minst 7 dagar.
11. Dataanalys
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En CNiFER är härledd från en human embryonal njure (HEK293) cell som är konstruerad för att stabilt uttrycka åtminstone två proteiner: en specifik G-proteinkopplad receptor (GPCR) och en genetiskt kodad [Ca2 +] sensor, TN-XXL. TN-XXL undergår fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) mellan cyan och gult fluorescerande proteiner, eCFP och Citrin, respektive, som svar på Ca2 + -joner 6,15. Aktivering av GPCR: er som kopplar till endogent G q G-proteiner utlösa en ökning av cytosolisk [Ca2 +] genom PLC / IP 3-vägen, vilket leder till en ökning av FRET från TNXXL Ca2 + detektor (Figur 1).
Figur 1:. System för utvecklings CNiFERs Top, GPCR-Ca2 + signalväg som krävs för att skapa enCNiFER cell. Botten, de grundläggande stegen för att konstruera CNiFERs använder HEK293-celler. Steg 1. transducera med genetiskt kodad FRET-baserade Ca2 + -detector (TN-XXL). Steg 2. transducera Ga G-proteinchimär, dvs G qs5, G qi5, om så är nödvändigt. Steg 3. omvandla unik GPCR att skapa CNiFER. Tvåfotonexcitering ljus (röd) retar eCFP, som genomgår FRET, som producerar både en eCFP utsläpp (cyan) och emissions Citrin (gul). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Ökningen i FRET ger en snabb optisk avläsning av ändringen i neurotransmittornivåerna. Att utveckla en CNiFER för en viss typ av signalsubstans, först bestämma vilken typ av G-protein som kopplar till GPCR. För Gq -kopplade GPCR använder GPCR Gq-proteiner endogent uttryckta iHEK293-celler. För G i / o -kopplade GPCR, en klonal HEK293 linje skapas först som uttrycker en chimär G-protein som dirigerar GPCR till Gq -PLC / IP 3-vägen. Detta åstadkommes med ett chimärt G-protein, G qi5, som innehåller i första hand Ga-q-sekvensen och fem aminosyror av karboxylterminalen av Gi. Dessa fem aminosyror är tillräckliga för G qi5 att kommunicera med Gi / o -kopplade GPCRs, men signal genom Gq pathway. För G s -kopplade GPCR är en G qs5 chimär används 10. Den allmänna strategin för att producera en CNiFER är att: 1) skapa en klonal HEK293 cell som stabilt uttrycker en optisk Ca2 + detektor, dvs TN-XXL, med hjälp av en lentivirus transduktion av HEK-celler, 2) stabilt uttrycka en G-proteinchimär vid behov, i HEK293-cellklonen uttrycker TN-XXL, och 3) skapa en stabilt uttrycker GPCR klon i HEK293-cellklona uttrycka TN-XXL och chimära G-protein. Den klonala HEK293 linje som saknar GPCR men har TN-XXL och chimära G-protein fungerar som "kontroll CNiFER". Kontrollen CNiFER behövs för att bekräfta att CNiFER svaret beror speciellt på aktivering av de tekniska receptorer, det vill säga, D2R, och inte aktivering av andra receptorer endogent uttryckta i HEK293-celler.
För att generera lentivirus, är ett lentivector expressionssystem används, t.ex., pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro, som innehåller de genetiska elementen som är ansvariga för förpackningar, transduktion, stabil integrering av det virala expressionskonstruktionen in i genomiskt DNA, och expression av målet gensekvensen. För att producera en hög titer av virala partiklar, uttryck och förpacknings vektorer är transient co-transfekterades in i producentdäggdjursceller och virus uppsamlas. Det finns flera virala kärnanläggningar i USA som kan generera hög ti ter lentivirus. Efter infektion av HEK293-celler, ger Puro genen antibiotikaresistens för att identifiera transducerade HEK293-celler.
För att identifiera specifika klonala linjer, transducerade HEK293 celler sorteras med hjälp av en fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) systemet. Målet är att isolera en klon som innehåller en hög expressionsnivå av FRET-baserade Ca2 + detektor och förmågan att undergå FRET. I detta exempel på FACS-analys, är fluorescensen av emissions eCFP plottas mot FRET-signal (eCFP excitations- och emissions Citrin). Rutorna markerar regionerna (P2 och P3) som senare kommer att utvalda ( "gated") för att sortera i 96-brunnsplattor (Figur 2). Allmänhet, cirka fyra 96-brunnars plattor är tillräckliga för att screena för lyckas med att skapa CNiFERs. Från dessa 4 plattor, ca 100 kloner är lämpliga för fluorometrisk plattavläsare analys.
e_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 2: Exempel på FACS-analys Ett prov av utsignalen efter en FACS-analys.. Som grafen tomter eCFP emission ( "475/20-A") som en funktion av Citrin emission ( "FRET V-530/30-A"), med användning eCFP excitation för varje cell. Regioner P2 och P3 visar områden valts, det vill säga, gated, för att sortera i enskilda celler. Färger är godtyckliga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
När väl de sorterade cellerna har vuxit till tillräcklig densitet, är FRET-svar efter agonistaktivering bestämdes med användning av en 96-brunnars fluorometrisk plattläsare system utrustat med lösning hantering. Att begränsa antalet kloner att studera, är en "3-punkts" agonist kurva användes för att screena ~100 kloner och väljer CNiFERs med de bästa svaren. Ungefär 10 kloner analyseras sedan vidare med fastställandet av den fullständiga dos-respons med den besläktade agonist, och de icke-specifika svar, sonderade med 12 andra neurotransmittorer eller modulatorer. En 96-brunnars drogplatta framställes som tre-faldig koncentration (slutlig koncentration späds 1: 3 i plattan) av läkemedel (t.ex. agonister, antagonister, etc.) i ACSF. I detta exempel är en drog plåt upp för att testa en D2 CNiFER med dess besläktade agonist, dopamin, och potentiella icke-specifika svar med en mängd andra neurotransmittor och peptidagonister (Figur 3). Ryggraden CNiFER, som saknar GPCR, tjänar som en viktig kontroll för nyskapade CNiFER.
Figur 3:. Exempel på layout för 96-brunnsplattor Top, bordet i layout för att ladda en 3x drogplatta för fluorometrisk plattläsare, med hjälp av tre-faldiga koncentrationer av olika signalsubstanser och peptider. Botten, exempel på klar plast med 96 brunnar drogplatta och svart 96-brunnar för sådd CNiFERs och mätning i plattläsare. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Stimulering av GPCR förväntas öka FRET svar, som en konsekvens av en höjd av intracellulär [Ca2 +] och detektion med TN-XXL. Under dessa betingelser, är FRET producerat av eCFP och Citrine flytta närmare, så att excitering av eCFP producerar en mindre utsläpps eCFP och större utsläpps Citrin. I detta exempel, är excitering satt till 436 nm och emissionsfilter är inställda på 485 ± 7,5 nm för eCFP och 527 ± 7,5 nm för Citrine (Figur 4). Trettio sekunder av baSeline fluorescens mäts och därefter 50 | il från "tre-faldigt" agonist i ACSF plattan levereras till varje brunn innehållande 100 | j, l ACSF (1: 3 spädning). eCFP och Citrin fluorescensemissionen mäts var 3,8 sekunder för 180 sek. Bakgrundsmätningar tas från brunnar utan celler och subtraheras, om så är nödvändigt. Fluorescensintensiteter är normaliserade till pre-stimulus baslinjer (F (t) / F (baslinje)), och maximala responser mäts för att beräkna FRET ratio (AR / R) med användning av F (t) / F (baslinje) av 527 nm och 485 nm kanaler (ekvation 1). En dos-responskurva konstrueras sedan genom att plotta FRET förhållandet som en funktion av olika agonistkoncentrationer och passar med Hill-ekvationen för att bestämma EC50 och Hill-koefficient (Figur 5) (ekvation 2). En optimal CNiFER uppvisar en stor FRET förhållande och en lämplig EC50 för den besläktade agonist, och uppvisar liten eller ingen bakgrunds reaktioner på andra neurotransmitTer-agonister. Däremot bör kontroll CNiFER visar lite svar på besläktade agonist.
Figur 4: Exempel på agonistinducerad FRET Response D2R CNiFER FRET svar mäts på en plattläsare med en lösning leveranssystem.. (A) En plot av FRET svaret, dvs eCFP excitation med eCFP och CITRIN utsläpp, under applicering av dopamin (röd stapel) till D2 CNiFERs. Observera att eCFP utsläpp minskar medan Citrin utsläpps ökar med agonist (dopamin). (B) En plot av FRET förhållandet (ekvation 1) för svaret i (A) Figur modifierad från Muller et al., 2014 7. Klicka god här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5:. Exempel på dosresponskurvor för D2 CNiFER (A) dosresponskurvor för svar av D2 CNiFERs till dopamin (DA, svart) och noradrenalin (NE, grön). Dessutom är svaret av "kontroll" CNiFERs saknar D2R visas. (B) Stapeldiagrammet visar den FRET-förhållande respons för andra signalsubstanser och modulatorer vid 50 nM och 1 | iM. Värdena är medelvärde ± SEM. Figur modifierad från Muller et al., 2014 7. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
CNiFER kloner kan utvärderas ytterligare för eventuell receptor-beroende hyposensibilisering och deras tidsupplösning, diskriminerande presentationenav två olika agonistpulser (för detaljer, se Muller et al., 2014 7). Efter att ha konstruerat en CNiFER klon, är nästa steg att testa dess funktion in vivo. Att övervaka fluorescensen in vivo, är det nödvändigt att använda en två-foton-mikroskop. Efter att förbereda en tunnas-skalle fönster är CNiFERs laddas i en glaspipett och injiceras i lager 2/3 av cortex. Musen är därefter förberedd för in vivo-avbildning genom att fästa ett glastäckglas till den uttunnade skallen, och implantera en huvudstången för fixering av huvudet under avbildning (Figur 6).
För att bestämma att de implanterade CNiFERs är livskraftiga in vivo, kan kända koncentrationer av agonist injiceras nära platsen för implantation och FRET förhållandet bestämt 7. För att ytterligare bekräfta aktiviteten hos implanterade CNiFERs, stimulera ingångs nervceller bör undersökas. Till exempel, med D2 CNiFER, effekten avelektrisk stimulering av mellanhjärnan dopaminneuroner som skjuter till cortex undersöktes. En 0,1 Mohm volfram bipolär stimulerande elektrod med en spets separation av 500 | j, m implanterades i substantia nigra (-3,2 mm A / P, -1,3 mm M / L, -4,4 mm D / V), fig. 6 visar ett exempel av elektriskt stimulerande substantia nigra vid olika intensiteter och observera en ökning i FRET-förhållande för D2 CNiFERs 7. Notera att systemisk intraperitoneal (ip) injektion av en D2-receptorantagonist, eticlopride (1 mg / kg), blockerar D2 CNiFER respons. Å andra sidan, injektion av kokain (15 mg / kg), som blockerar återupptaget av dopamin, förstärker den elektriskt framkallade D2 CNiFER respons 7.
Figur 6: Exempel på D2 CNiFER Response I
ftp_upload / 53290 / 53290table1.jpg "/>
Tabell 1: Kemikalier och reagens för att göra HEK293 odlingsmedium och ACSF.
Tabell 2: Volymerna för skörd av celler från olika storlek odlingsplattor eller flaskor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Skapandet av CNiFERs erbjuder en innovativ och unik strategi för att optiskt mäta frisättning av signalsubstanser i hjärnan in vivo. CNiFERs är idealiskt lämpade för att mäta extrasynaptic release, dvs volymledning, för neurotransmittorer. Viktigare, varje CNiFER besitter egenskaperna hos den nativa GPCR, vilket ger en fysiologiskt optisk mätning av förändringarna i nivåer av signalsubstanser i hjärnan. Hittills har CNiFERs skapats för att detektera acetylkolin (M1-CNiFER) 6, dopamin (D2-CNiFER) 7 och noradrenalin (a1a-CNiFER) 7.
I princip kan en CNiFER skapas för varje signalsubstans som signalerar genom en GPCR. För det fall där de GPCR signaler genom G q G-proteiner, behövs ingen ytterligare modifiering av HEK293-cell. GPCR: er som signalerar genom G i / o dock kräva samuttryck av en G qi5 chimärt G-proteinatt koppla GPCR till Gq / PLC vägen 7,10. På samma sätt kommer GPCR som signalerar genom G s kräver samexpression av en chimär G qs5 G-protein 10. När de är färdiga, är varje CNiFER klon screenas och endast de CNiFER kloner som har en affinitet som är jämförbar med den nativa receptorn, uppvisar liten eller ingen desensibilisering och tillhandahålla en signal-till-brusförhållande som är tillräcklig för mätning med in vivo två-foton-mikroskopi, väljs för in vivo-studier.
För in vivo-studier, är det starkt rekommenderat att behandla mössen med cyklosporin för att minimera eventuella immunologiskt svar. Finns det en möjlighet för avstötning eller ett immunologiskt svar med implantera humana CNiFER celler in i gnagare hjärnan. Detta har tidigare undersökts genom att undersöka uttryck av GFAP och MAC1 7, efter CNiFER implantation. CNiFERs verkar inte producera gliaceller ärr eller generera någon bety-dande MAC1 färgning 7.
Två viktiga frågor att tänka på att bygga CNiFERs är känslighet och hyposensibilisering. Om EG-50 är för hög, det vill säga, låg affinitet, i förhållande till den nativa receptorn, då CNiFER kanske inte har tillräcklig känslighet för att detektera frisättning av neurotransmitter in vivo. En lösning är att återscreena kloner och välja en annan CNiFER klon som har högre affinitet. En alternativ strategi skulle vara att testa andra typer av genetiskt kodade fluorescerande Ca 2 + -detectors som kan ha en högre Ca2 + känslighet, som kan skifta EC50 för GPCR aktivering. Eftersom CNiFER design är modulärt, är det lätt anpassas till andra typer av genetiskt kodade Ca 2 + -detectors, såsom GCaMP 16. Isolera CNiFER kloner med samma receptor men olika EG 50 s kan vara en fördel för att utsträcka det dynamiska området för att detektera frisättning av endogent neurotransmitters in vivo.
Hyposensibilisering av CNiFER kommer också begränsa dess användning in vivo. Om maximal känslighet gradvis minskar med varje puls av agonist, då receptorn kan desensibilisering. I det här fallet, undersöka andra kloner och avgöra om de svarar på samma sätt. Ändringar av receptoraminosyrasekvensen, eller användning av en annan subtyp av receptor kan vara nödvändigt att ta itu med agonistberoende hyposensibilisering. Om det finns kända ställen för fosforylering eller aminosyror upptäckts som förknippar med G-protein receptorkinaser (GRK: er), skulle det vara lämpligt att konstruera en icke-desensibilisering variant av GPCR genom att mutera en eller flera platser. Mekanismen för hyposensibilisering måste bestämmas för varje receptor på en bedömning från fall till fall.
Hittills har CNiFERs har endast implanteras i ytliga lager av cortex 6,7, på grund av spektroskopiska begränsningar med avbildnings fluoroforer med två-photon microscopy 17,18. I framtiden kan det bli möjligt att anpassa CNiFER teknik med fiberbaserade mätningar av fluorescens 19, så att CNiFERs kan implanteras i subkortikala hjärnregioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar B. Conklin (University of California, San Francisco) för att ge G qi5 och G qs5 cDNA, A. Schweitzer för att få hjälp med elektroniken, N. Taylor för att få hjälp med screening av kloner, Ian Glaaser och Robert Rifkin för korrekturläsning och Olivier Griesbeck för TN-XXL. Detta arbete stöddes av forskningsanslag genom US National Institute on Drug Abuse (NIDA) (DA029706, DA037170), National Institute of Biomedical Imaging och Bioengineering (NIBIB) (EB003832), Hoffman-La Roche (88610A) och "Neuroscience relaterade till droger "utbildningsstipendium genom NIDA (DA007315).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro | System Biosciences | CD510B-1 | Cloning: for generating lentivirus |
| 12 x 75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube | BD Biosciences | 352063 | FACS |
| BD 40 um Falcon cell strainers | BD Biosciences | 352340 | FACS |
| 0.05% Trypsin EDTA | Invitrogen | 25200056 | FACS |
| 96 Well Plate, flat bottom, clear | Corning | 3596 | FACS |
| 96 well cell culture plates | Corning | CLS3997 | Flexstation |
| Optilux black clear bottom | Corning | 3603 | Flexstation |
| Flexstation pipet tips | Molecular Devices | 9000-0911 | Flexstation |
| Acetylcholine Chloride | Sigma-Aldrich | A2661 | Flexstation |
| Norepinephrine | Sigma-Aldrich | A7256 | Flexstation |
| Dopamine Hydrochloride | Sigma-Aldrich | PHR1090 | Flexstation |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | Flexstation |
| Histamine | Sigma-Aldrich | H7125 | Flexstation |
| Glutamate | Sigma-Aldrich | 49621 | Flexstation |
| Epinephrine | Sigma-Aldrich | E4642 | Flexstation |
| Somatostatin | Sigma-Aldrich | S1763 | Flexstation |
| 5HT | Sigma-Aldrich | H9523 | Flexstation |
| VIP | Alpha Diagnostics Inc. | SP-69627 | Flexstation |
| Orexin A | Alpha Diagnostics Inc. | 12-p-01 | Flexstation |
| Substance P | Sigma-Aldrich | S6883 | Flexstation |
| Adenosine | Sigma-Aldrich | A4036 | Flexstation |
| Melatonin | Sigma-Aldrich | M5250C | Flexstation |
| Fluorescence Plate Reader & software | Molecular Devices | Flexstation 3 | Flexstation |
| DMEM (high glucose) with Glutamax | Life Technologies | 10569-010 | Tissue culture |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10082-139 | Tissue culture |
| Pen/Strep antibiotics | Life Technologies | 15140-122 | Tissue culture |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | Tissue culture |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Tissue culture |
| CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box | Bioexpress | D-3508) | Tissue culture |
| cyanoacrylate glue | Loctite | Loctite no. 495 | surgery and stereotaxic injection |
| plastic paraffin film | VWR | Parafilm® | surgery and stereotaxic injection |
| Nanoinjector | Drummond | 3-000-204 | surgery and stereotaxic injection |
| Glass electrodes | Drummond | 3-000-203G | surgery and stereotaxic injection |
| hand held drill | OSADA | Exl-M40 | surgery and stereotaxic injection |
| Burrs for drill | Fine Scientific | 19007-05; 19007-07) | surgery and stereotaxic injection |
| Sterilizing bath | FST | 18000-45, Hot Bead Sterilizer | surgery and stereotaxic injection |
| isoflurane chamber/mask | Highland Medical Equipment | 564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm | surgery and stereotaxic injection |
| 3D scope with arm | Zeiss | surgery and stereotaxic injection | |
| fiber optic light | surgery and stereotaxic injection | ||
| Betadine | surgery and stereotaxic injection | ||
| 70 % (v/v) isopropyl alcohol | surgery and stereotaxic injection | ||
| Povidone-Iodine Prep Pads | dynarex | 1108 | surgery and stereotaxic injection |
| NaCl 0.9% (injection, USP, 918610) | surgery and stereotaxic injection | ||
| CYCLOSPORINE (INJECTION, USP) | surgery and stereotaxic injection | ||
| Buprenex (injection) buprenorphine (0.03 μg per g rodent) | Sigma-Aldrich | surgery and stereotaxic injection | |
| Ophthalmic ointment | Akorn | NDC 17478-235-35 | surgery and stereotaxic injection |
| Surgifoam | Ethicon | surgery and stereotaxic injection | |
| Grip dental cement | Dentsply | #675571, 675572 | surgery and stereotaxic injection |
| Instant SuperGlue | NDindustries | surgery and stereotaxic injection | |
| LOCTITE 4041 | surgery and stereotaxic injection | ||
| METABOND | C&B | surgery and stereotaxic injection | |
| no. 0 cover glass | Fisher | surgery and stereotaxic injection | |
| stereotaxic frame | Kopf | surgery and stereotaxic injection | |
| Rectal probe and heating pad | FHC | 40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe | surgery and stereotaxic injection |
| optical breadboard for imaging | Thorlabs | surgery and stereotaxic injection | |
| Mineral oil | Fisher | S55667 | surgery and stereotaxic injection |
| Kwik-Cast (Silicone elastomer) | World Precision Instruments | surgery and stereotaxic injection | |
| Suture | Ethicon | 18’’, 1667, 4-0 | surgery and stereotaxic injection |
| Scissors | Fine Scientific Tools | 91500-09, 15018-10 | surgery and stereotaxic injection |
| Forcepts | Fine Scientific Tools | 11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10 | surgery and stereotaxic injection |
| Student Halsted-Mosquito Hemostats | Fine Scientific Tools | 91308-12 | surgery and stereotaxic injection |
| Small Vessel Cauterizer Kit | Fine Scientific Tools | 18000-00 | surgery and stereotaxic injection |
| Hot Bead Sterilizers | Fine Scientific Tools | 18000-45 | surgery and stereotaxic injection |
| Instrument Case with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20311-21 | surgery and stereotaxic injection |
| Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat | Fine Scientific Tools | 20810-01 | surgery and stereotaxic injection |
| 2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging | Olympus | FV1200 MPE | in vivo imaging |
| Multiphoton laser | SpectraPhysics | Mai Tai DeepSee | in vivo imaging |
| Green Laser | Olympus | 473 nm Laser | in vivo imaging |
| xy translational base | Scientifica | MMBP | in vivo imaging |
| FRET filter cube for YFP and CFP | Olympus | in vivo imaging | |
| 10x and 40x water immersion objectives | Olympus | in vivo imaging | |
| air table | Newport | in vivo imaging | |
| custom built light-tight cage | Thorlab | in vivo imaging |
References
- Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems. Methods. 23, 21-39 (2001).
- Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo. Clin Chem. 49, 1763-1773 (2003).
- Liang, R., Broussard, G. J., Tian, L. Imaging Chemical Neurotransmission with Genetically Encoded Fluorescent Sensors. ACS Chem Neurosci. , (2015).
- Okubo, Y., et al. Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 6526-6531 (2010).
- Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10, 162-170 (2013).
- Nguyen, Q. T., et al. An in vivo biosensor for neurotransmitter release and in situ receptor activity. Nat Neurosci. 13, 127-132 (2010).
- Muller, A., Joseph, V., Slesinger, P. A., Kleinfeld, D. Cell-based reporters reveal in vivo dynamics of dopamine and norepinephrine release in murine cortex. Nat Methods. 11, 1245-1252 (2014).
- Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. , e3998 (2012).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. , (2009).
- Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Gjα. Nature. 363, 274-276 (1993).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1, 3166-3173 (2006).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. , (2012).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat Methods. 7, 981-984 (2010).
- Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1277-1309 (2012).
- Yamauchi, J. G., et al. Characterizing ligand-gated ion channel receptors with genetically encoded Ca2+ sensors. PLoS One. 6, e16519 (2011).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
- Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
- Cui, G., et al. Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation. Nature. 494, 238-242 (2013).
