Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

بناء على أساس خلية العصبي نيون المهندسة مراسلون (CNiFERs) للكشف بصري من الناقلات العصبية Published: May 12, 2016 doi: 10.3791/53290
Automatic Translation
1, 2, 1, 2,3, 1
1Department of Neuroscience, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2Department of Physics, University of California, San Diego, 3Section of Neurobiology, University of California, San Diego

Summary

نقدم بروتوكول لإنشاء خلية القاعدة العصبي الفلورسنت للصحفيين المهندسة (CNiFERs) للكشف البصري الافراج عن العصبي الحجمي.

Abstract

خلية القاعدة العصبي الفلورسنت للصحفيين المهندسة (CNiFERs) توفير أداة جديدة لعلماء الأعصاب للكشف عن بصريا وإطلاق النواقل العصبية في الدماغ في الجسم الحي. يتم إنشاء CNiFER محددة من خلية الكلى الجنينية البشرية التي تعبر عن مستقر لG البروتين يقترن مستقبلات محددة، والتي الأزواج إلى G ف / 11 البروتينات G، والقائم على الحنق الكالسيوم 2+ -detector، TN-XXL. تفعيل مستقبلات يؤدي إلى زيادة في إشارة الحنق. CNiFERs ديك حساسية نانومتر وردا الزمنية ثانية لاستنساخ CNiFER تستخدم مستقبلات للمواطن وهو ناقل عصبي معين، على سبيل المثال، D2R للدوبامين. تزرع CNiFERs مباشرة في الدماغ، وتمكينهم من الشعور الافراج عن العصبي مع قرار المكاني لأقل من مائة ميكرون، مما يجعلها مثالية لقياس انتقال الصوت في الجسم الحي. ويمكن أيضا أن تستخدم CNiFERs لفحص أدوية أخرى لالمحتملين عبر التفاعل في السادسفو. قمنا بتوسيع مؤخرا عائلة CNiFERs لتشمل GPCRs أن الزوجين لG ط / س ع البروتينات. تتوفر للكشف عن أستيل كولين (ACH)، الدوبامين (DA) والنورادرينالين (NE) CNiFERs. وبالنظر إلى أن أي النوع من الاختزال يمكن استخدامها لخلق رواية CNiFER وأن هناك ما يقرب من 800 GPCRs في الجينوم البشري، ونحن هنا وصف الإجراء العام لتصميم وتحقيق، واختبار أي نوع من CNiFER.

Introduction

لنفهم تماما كيفية اتصال الخلايا العصبية في الدماغ، فمن الضروري أن يكون هناك طريقة لقياس إطلاق النواقل العصبية في الجسم الحي. هناك العديد من التقنيات الراسخة لقياس الموصلات العصبية في الجسم الحي. واحد التقنية المستخدمة شيوعا هو microdialysis، حيث يتم إدخال قنية في الدماغ وكمية صغيرة من السائل النخاعي التي يتم جمعها وتحليلها باستخدام عالية الأداء اللوني السائل وكشف الكهروكيميائية 1. Microdialysis لديها القرار المكانية بناء على أمر من عدد قليل من أقطار لجنة التحقيق، على سبيل المثال، ~ 0.5 ملم لمجهري 200 ميكرون قطر. القرار الزماني لهذه التقنية، ومع ذلك، هو بطيئا بسبب فترات أخذ العينات التي تستمر عادة ~ 5 دقائق أو أكثر 1. وعلاوة على ذلك، لا يتم إجراء التحليلات في الوقت الحقيقي. أسلوب آخر هو مسح سريع Voltammetry دوري (FSCV)، والذي يستخدم مسبار من ألياف الكربون التي يتم إدراجها في الدماغ. FSCV ديه درجة الحرارة ممتازةقرار شفوي (subsecond)، وحساسية عالية (nanomolar)، والقرار المكانية بأقطار التحقيق من 5-30 ميكرون. ومع ذلك، FSCV يقتصر على أجهزة الإرسال التي تنتج الأكسدة المميزة والشخصية تخفيض الجهد على الكربون الجهدية التحقيق 2.

وهناك تقنية أخرى لقياس الناقلات العصبية هي مباشرة من خلال الموصلات العصبية المشفرة وراثيا (NT) أجهزة الاستشعار 3. مع هذا الأسلوب، يتم إنشاء بروتين الانصهار التي تحتوي على نطاق ملزم يجند للمرسل بالإضافة إلى مضان بالرنين نقل الطاقة (الحنق) زوج المستندة من fluorophores 4 أو GFP permutated 5. وخلافا للأساليب السابقتين، هذه الحساسات يتم ترميز وراثيا وأعربت على سطح الخلية المضيفة، مثل الخلايا العصبية، من خلال إنتاج الحيوانات المعدلة وراثيا أو حاد مع استخدام العوامل الفيروسية لتصيب الخلايا. حتى الآن، وقد وضعت أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا فقط لdetectinز الغلوتامات وGABA 3-5. كانت قيود مع هذه التقنيات حساسية منخفضة، في نطاق نانومتر، وعدم القدرة على التوسع في الكشف عن وجود عدد كبير من أجهزة الإرسال، على سبيل المثال، العصبية الكلاسيكية، نيوروببتيد وneuromodulators، التي تشير من خلال مجموعة مستقبلات البروتين يقترن (GPCRs). في الواقع، هناك ما يقرب من 800 GPCRs في الجينوم البشري.

لمعالجة هذا النقص، قمنا بتطوير أداة مبتكرة لإطلاق قياس بصريا من أي الناقل العصبي الذي يشير من خلال هذه العملية من. CNiFERs (ناقل عصبي فلوري خلية القاعدة للصحفيين هندسيا) هي خلايا HEK293 نسيلي هندسيا للتعبير عن هذه العملية من معين، عندما حفزت، وموجبات زيادة في داخل الخلايا [كا 2+] التي يتم الكشف عنها من قبل كا 2+ استشعار القائم على الحنق المشفرة وراثيا، TN-XXL. وهكذا، CNiFERs تحويل مستقبلات الناقلات العصبيه ملزمة إلى تغيير في مضان، وتوفير الوقت الحقيقي المباشر وص البصريهيئة البيئة-من النشاط العصبي المحلي. من خلال الاستفادة من مستقبلات للمواطن وهو ناقل عصبي معين، CNiFERs الإبقاء على خصوصية الكيميائية، تقارب وديناميات الزمنية من المستقبلات التي أعرب عنها التطور الطبيعي. وحتى الآن، وقد انشأنا ثلاثة أنواع من CNiFERs، واحدة للكشف عن أستيل باستخدام مستقبلات M1، واحدة للكشف عن الدوبامين باستخدام مستقبلات D2، واحدة للكشف عن بافراز باستخدام 6،7 α1a مستقبل. التكنولوجيا CNiFER قابلة للتوسيع بسهولة وقابلة للتطوير، مما يجعلها قابلة للأي نوع من الاختزال. في هذه المقالة إن الرب، وصفنا وتوضيح المنهجية لتصميم، وتحقيق، واختبار في CNiFERs الجسم الحي لأي تطبيق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع الإجراءات الحيوان أجريت في هذه الدراسة وفقا للرعاية الحيوان المؤسسية والمبادئ التوجيهية للجنة الاستخدام (IACUC)، حيث تم اعتمادها من قبل IACUCs كانت في مدرسة طب ماونت سيناي وجامعة كاليفورنيا في سان دييغو.

1. توليد النوع من الاختزال، معربا عن الفيروسة البطيئة لتحويل خلايا HEK293

  1. الحصول على [كدنا لهذه العملية من معين من مصدر تجاري، على سبيل المثال، cdna.org. بدلا من ذلك، تضخيم الجينات النوع من الاختزال من مكتبة كدنا] باستخدام PCR. الحصول على ناقلات، معربا عن الفيروسة البطيئة، مثل pCDH-CMV-MCS-EF1-بورو (pCDH). استخدام هذا متجه إلى نشر الحمض النووي وكذلك لتوليد الفيروسة البطيئة.
  2. استنساخ لهذه العملية من [كدنا في ناقلات، معربا عن الفيروسة البطيئة من قبل PCR. انظر لورينز 8، للاطلاع على تفاصيل PCR استنساخ فرعي.
  3. توسيع وتنقية النوع من الاختزال-pCDH الحمض النووي باستخدام "ماكسي" مجموعة الإعدادية خالية من الذيفان الداخلي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. تأكد من أن هذه العملية من [كدنا subcloned إلى pCDH هو mutation-مجانا عن طريق تسلسل الحمض النووي.
    ملاحظة: قبل تقديم الحمض النووي لإنتاج الفيروس، وهضم قسامة مع انزيم التقييد المناسب لتأكيد حجم إدراج ونقاء من الحمض النووي.
  4. توليد الفيروسة البطيئة باستخدام مرفق الأساسية فيروس، مثل واحد في معهد سالك في جامعة بنسلفانيا، أو جامعة نورث كارولينا، وما إلى ذلك، أو توليد في المنزل 9. استخدام ما يقرب من 25 ميكروغرام (> 1 ميكروغرام / ميكرولتر) من الحمض النووي خالية من الذيفان الداخلي لترنسفكأيشن من خلايا كلوة في قارورة T75. تأكد من أن الحمض النووي هو من نقاء عالية، وجود نسبة الامتصاص (A 260/280) من ~ 1.8.
    ملاحظة: التتر من فيروس ~ 10 11 -10 12 GC / مل والأمثل لتنبيغ الخلايا HEK293.

2. اختيار HEK293 / TN-XXL نوع العمود الفقري الخليوي لالتثقيف في المختبر

ملاحظة: تحديد G البروتين اقتران خصوصية، على سبيل المثال، G ط / س، ز ف / 11، أو G الصورة البروتينات G، من النوع من الاختزال، لأن ذلك مدينة دبي للإنترنتتتس ما إذا كانت هناك حاجة إلى البروتين الوهم G للCNiFER. لG ف مستقبلات -coupled، على سبيل المثال، M1 مستقبلات المسكارينية، اختر HEK293 / TN-XXL (# 3g8) باعتبارها العمود الفقري HEK293 نوع من الخلايا. لG ط / س -coupled المستقبلات، وهناك حاجة إلى خيالية G بروتين G qi5 10. لG الصورة مستقبلات -coupled، هناك حاجة إلى qs5 الوهم G 10. في هذا البروتوكول، ويستخدم في بناء D2R CNiFER كمثال على ذلك. إشارات D2R من خلال G ط / س ع البروتينات وتتطلب خلايا HEK293 التي تعبر عن ثبات البروتين G خيالية، qi5 G، على سبيل المثال، HEK293 / TN-XXL / G qi5 _ # qi5.6.

  1. الحصول على qi5 HEK293 / TN-XXL / G _ # qi5.6 الخلايا نسيلي من مختبر الأبحاث. ملاحظة: فيما يلي الخلايا نسيلي، HEK293 / TN-XXL (# 3g8) لG ف -coupled المستقبلات، HEK293 / TN-XXL / G qi5 (# qi5.6) لG ط / س -coupled المستقبلات، وHEK293 / TN -XXL / G qs5 (# qs5.47) لG ق إعادة -coupledceptors، هي متاحة بحرية بناء على طلب 6،7.
  2. النمو والتوسع qi5 HEK293 / TN-XXL / G _ # qi5.6 إلى ~ 90٪ confluency في قارورة T25 مع 5 مل من وسائط النمو HEK293 (الجدول 1). تنمو الخلايا في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ (ت / ت) CO 2.
    ملاحظة: يجب أن يتولى جميع العمل مع زراعة الخلايا HEK293 خارج باستخدام تقنيات زراعة الأنسجة عقيمة القياسية.
  3. حصاد الخلايا HEK293 بواسطة الشفط وسائل الإعلام أول من T25 القارورة. غسل الخلايا بلطف عن طريق إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني وهزاز القارورة.
  4. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من 0.05٪ (ث / ت) التربسين / EDTA (الجدول 2). احتضان لمدة 1-2 دقائق عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ (ت / ت) CO 2.
  5. جمع الخلايا ونقل إلى عقيمة 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1000 x ج في أجهزة الطرد المركزي ثقافة الخلية. نضح طاف.
  6. resuspend الكرية خلية في 5 مل من وسائط النمو HEK293. عد الخلايا في عدادة الكريات باستخدامالتريبان الأزرق. حساب كثافة الخلايا وانتقل إلى الخطوة 3.

3. Lentiviral تنبيغ من HEK293 / TN-XXL خلايا / Gqi5

  1. البذور قارورة T25 مع 0.7 × 10 6 خلايا qi5 HEK293 / TN-XXL / G. تنمو الخلايا في حاضنة ترطيب عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ (ت / ت) CO 2 حتى ~ 50٪ متموجة، بعد ما يقرب من 1 يوم. تجميد الخلايا المتبقية (الخطوات 8،2-8،3). وهذه الخلايا بمثابة السيطرة CNiFER، أي CNiFER التي تفتقر إلى هذه العملية من.
  2. في يوم من العدوى، يخفف من التعبير عن الفيروسة البطيئة لهذه العملية من (الخطوة 1.4) إلى تركيز النهائي من ~ 10 9 GC / مل في الحجم الكلي لل2 مل من وسائط النمو HEK293 (الجدول 1). على سبيل المثال، إضافة 20 ميكرولتر من 10 11 GC فيروس / مل إلى 2 مل سائل الإعلام في قارورة T25.
    ملاحظة: ينبغي توفير المعلومات عيار الفيروس من مرفق الأساسية الفيروس. الجمع بين الفيروسة البطيئة وسائل الإعلام في أنبوب الطرد المركزي ويسحن بلطف. التتر عالية من lentivirus هي مستوى السلامة الحيوية 2 (BSL-2).
  3. نضح في وسائل الاعلام من القارورة T25. إضافة 2 مل من فيروس / خليط سائل الإعلام من الخطوة 3.2. احتضان T25 قارورة O / N عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ (ت / ت) CO 2.
  4. بعد يوم واحد من العدوى، ونضح الفيروس / خليط سائل الإعلام واستبدالها HEK293 وسائط النمو التي تحتوي على بوروميسين (2 ميكروغرام / مل، الجدول 1). بوروميسين يختار للخلايا transduced. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ (ت / ت) CO 2 حتى حوالي 90٪ متموجة، بعد ~ 1-2 أيام.
  5. إعداد لوحة 96-جيدا (أسود مع قاع واضح) المغلفة مع فبرونيكتين، لتوليد 10 نقطة منحنى ناهض / التنشيط في خطوة 4.1. في غطاء العقيمة، إضافة 50 ميكرولتر فبرونيكتين (5 ميكروغرام / مل) لكل بئر في صفوف ألف وباء من لوحة 96-جيدا. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. شطف مرتين لمدة 5 دقائق في شطف مع برنامج تلفزيوني. إضافة 50 ميكرولتر من وسائط النمو HEK293 واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ (ت / ت) CO 2.
    ملاحظة: FIBRONتتوفر تجاريا لوحات المعالجة ectin.
  6. حصاد الخلايا في قارورة T25 كما هو موضح في الخطوات 2،3-2،6 (الجدول 2).
  7. resuspend الكرية خلية في 5 مل من وسائط النمو HEK293. البذور قارورة T25 مع 1.5 مل من الخلايا لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. أيضا، البذور قارورة T75 مع 1 مل من الخلايا للتجميد وتخزين (انظر الخطوات 8،2-8،3)
  8. لمنحنى ناهض 10 نقطة، البذور صفين الأولى (A و B) من لوحة 96-جيدا المغلفة فبرونيكتين (من الخطوة 3.5) مع 100 ميكرولتر من تعليق خلية لكل بئر.
  9. احتضان خلايا HEK293 نموا في قارورة T25، T75 قارورة ولوحة 96-جيدا حتى حوالي 90٪ ~ متكدسة عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ (ت / ت) CO 2، بعد ~ 1-2 أيام.

4. نظام مراقبة الأصول الميدانية وعزل واحدة CNiFER النسخ

  1. استخدام لوحة 96-جيدا لتوليد 10 نقطة منحنى تفعيل ناهض.
    ملاحظة: قبل البدء في مضان خلية تنشيط الفرز (FACS) التحليل، فمن المهم التأكد منالتعبير عن هذه العملية من خلال اختبار خلايا transduced للاستجابة ناهض (10 نقطة ناهض منحنى). ويتم هذا الاختبار باستخدام قارئ لوحة فلوروميتريك.
    1. إعداد لوحة المخدرات ل10 نقطة تفعيل ناهض منحنى. اختيار 10 تركيزات ناهض المختلفة التي قوس وتوقعت المفوضية الأوروبية 50، والذي يمكن تحديده من الأدب.
      ملاحظة: لوحة الدواء يحتوي على 3 أضعاف من كل تركيز (نسختين) لضبط التخفيف 1: 3 في لوحة CNiFER. على سبيل المثال، لوحة المخدرات لاختبار D2 CNiFER يحتوي على 10 تركيزات مختلفة من الدوبامين بتركيزات 3 أضعاف. 0.2، 0.5، 1، 3، 5، 10، 20، 30، 50، و 1000 نانومتر. في لوحة CNiFER، وبالتالي فإن تركيزات النهائي من الدوبامين هي 0.067، 0.167، 0.333، 1.00، 1.67، 3.33، 6.67، 10.0، 16.7، و 333 نانومتر.
    2. إعداد الحلول ناهض باستخدام الاصطناعي السائل الدماغي الشوكي (ACSF) (الجدول 1). استخدام بئرين لل"ACSF"، على سبيل المثال، A1 و A2،وبئرين لل"لا الخلايا، على سبيل المثال، B1 و B2.
      ملاحظة: إعداد تركيزات مختلفة من المخدرات باستخدام طريقة التخفيف المتسلسل. إنشاء قالب لتتبع الحيوانات المستنسخة CNiFER وتركيز الدواء (الشكل 3).
    3. استخدام البرنامج لبرنامج قارئ لوحة فلوروميتريك 96-جيدا لقياس الحنق وأداء تحويلات حل.
      1. ضبط درجة الحرارة لوحة القارئ إلى 37 درجة مئوية.
      2. لقياس الحنق مع TN-XXL، تعيين الطول الموجي الإثارة إلى 436 ± 4.5 نانومتر (مركز ± HWHM). تعيين المرشحات الانبعاثات إلى 485 ± 7.5 نانومتر لeCFP و527 ± 7.5 نانومتر لالسترين. تعيين مرشح قطع 475 و 515 نانومتر للeCFP والسترين، على التوالي.
      3. برمجة قارئ لوحة لقياس الانبعاثات في 485 نانومتر و 527 نانومتر كل 4 ثانية ليصبح المجموع 180 ثانية. اختر الخيار لتقديم 50 ميكرولتر من لوحة المخدرات 3 أضعاف إلى 100 ميكرولتر في لوحة CNiFER، بعد جمع 30 ثانية منمضان خط الأساس.
    4. نضح في وسائل الاعلام من الصفوف ألف وباء وإضافة 100 ميكرولتر من ACSF إلى جانب 96 لوحة CNiFER هذا هو ~ 90٪ متموجة (الخطوة 3.9).
    5. تحميل 96-جيدا لوحة CNiFER و "3 أضعاف" لوحة المخدرات في قارئ لوحة. سماح ~ 30 دقيقة لكي تتوازن لوحات عند 37 درجة مئوية. ثم بدء تشغيل البرنامج.
    6. لتحليل البيانات لوحة القارئ، تصدير القيم مضان إلى جدول بيانات. إنشاء صيغة لطرح قياسات الخلفية (التي اتخذت لكل إشارة من الآبار دون الخلايا) من الآبار مع CNiFERs. تطبيع كثافة مضان إلى ما قبل التحفيز خطوط الأساس، F السترين (ر) / F السترين (خط الأساس)، وحساب نسبة الحنق (ΔR / R؛ ؤ 1) باستخدام ردود الذروة في 527 نانومتر و 485 الانبعاثات نانومتر (راجع الخطوة 11 ).
      ملاحظة: إذا كان هناك تغير كبير في ΔR / R مع ناهض، ثم وهذا يدل على التعبير عن هذه العملية من واحد يمكن الشروع في تحليل FACS (الخطوة 4.2). إذا والعشرينيحرث ليس استجابة الحنق مع ناهض، استكشاف باستخدام الكالسيوم 2+ حامل الأيون، على سبيل المثال، A21387، لاختبار استجابة الكالسيوم 2+ وتأكيد من عمل جهاز استشعار القائم على الحنق. إذا كان يعمل على حامل الأيون، ثم لم يكن أعرب مستقبلات احتمالا.
  2. في اليوم قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية، وإعداد أربع لوحات 96-جيدا المغلفة مع فبرونيكتين (راجع الخطوة 3.5) لجمع الخلايا مرتبة. إضافة 50 ميكرولتر من وسائط النمو HEK293 واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ (ت / ت) CO 2.
  3. إعداد 5٪ (ث / ت) BSA في برنامج تلفزيوني (5 غ / 100 مل)، ومرشح (0.2 ميكرون) في زجاجة معقمة.
  4. حصاد الخلايا المزروعة في قارورة T25 (انظر الخطوات 2،3-2،5، الجدول 2). Resuspend وبيليه خلية في 4 مل من 5٪ (ث / ت) BSA في برنامج تلفزيوني. الطرد المركزي الخلايا في 1000 x ج لمدة 5 دقائق.
  5. نضح في وسائل الإعلام و resuspend بيليه خلية في ~ 5 مل من 5٪ (ث / ت) BSA في برنامج تلفزيوني لإعطاء تركيز النهائي من ~ 5 × 10 6 خلية / مل.
    ملاحظة: تحقق مع اتحاد كرة القدممرفق الأساسية CS لمتطلبات محددة على كثافة الخلايا وشروط الفرز.
  6. تصفية الخلايا معلق مع مصفاة الخلية 40 ميكرون لإزالة كتل. نقل الخلايا إلى 5 مل البولي بروبلين الجولة أنبوب أسفل. وضع أنبوب على الجليد للنقل إلى مرفق نظام مراقبة الأصول الميدانية.
  7. فرز الخلايا HEK293 transduced في منشأة FACS. برنامج المعلمات على نظام مراقبة الأصول الميدانية تدفق الكريات على النحو التالي: تعيين 4 درجة مئوية لصاحب العينة، و 100 ميكرون لفوهة و 20 رطل. استنادا إلى تحليل ما قبل الفرز، حدد الخلايا، أي اختيار "البوابة"، التي لديها مضان كبير eCFP (eCFP الإثارة، eCFP الانبعاث) والحنق كبير (eCFP الإثارة، والانبعاثات سيترين) مضان (انظر نتائج أدناه، الشكل 2 ).
  8. إيداع الفرد، وخلايا فرزها الى لوحة 96-جيدا أعدت في الخطوة 4.2، مع نسخة واحدة لكل تحتوي على 50 ميكرولتر من وسائط النمو HEK293 مع بوروميسين. إضافة 50 ميكرولتر من وسائط النمو HEK293 مع بوروميسين (تابلي 1) ليصبح المجموع 100 ميكرولتر لكل بئر. الحفاظ على خلايا O / N عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ (ت / ت) CO 2.
    ملاحظة: وسائط النمو HEK293 يحتوي بوروميسين لاختيار الخلايا transduced.

5. التثقيف والتوسع في التصنيف، CNiFERs نسيلي

  1. الحفاظ على CNiFERs في لوحات 96-جيدا عن طريق إزالة 50 ميكرولتر من وسائل الإعلام القديمة من كل بئر واستبدالها مع 50 ميكرولتر من وسائط النمو HEK293 الطازجة التي تحتوي على بوروميسين (الجدول 1). كرر هذا كل 5-7 أيام حتى ~ 90٪ متموجة، بعد 2-3 أسابيع.
  2. حصاد الخلايا CNiFER بواسطة الشفط بلطف وسائل الإعلام والشطف مرة بلطف مع برنامج تلفزيوني. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 20 ميكرولتر من 0.05٪ (ث / ت) التربسين / EDTA. احتضان لمدة 1-2 دقائق عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ (ت / ت) CO 2.
  3. إضافة 100 ميكرولتر من وسائط النمو HEK293 الخلايا المعالجة التربسين وresuspend الخلايا. محتويات نقل إلى لوحة 24-جيدا تحتوي على 400 ميكرولتر HEK293 جديدة وسائط النمو خفة دمح بوروميسين. في 24 لوحة جيدا، والحفاظ على الخلايا عن طريق استبدال 250 ميكرولتر من وسائط النمو HEK293 كل 5-7 أيام حتى الآبار ~ 90٪ متموجة.

6. تحديد CNiFERs المرشح بناء على الاستجابة الحنق عن طريق فلوروميتريك قارئ لوحة

ملاحظة: مع أربع لوحات 96-جيدا عقب FACS، ينبغي أن يكون هناك> 100 استنساخ قابلة للاختبار أن البقاء على قيد الحياة وتوسع في المرحلة 24 لوحة جيدا، حيث أن العديد من الحيوانات المستنسخة الأصلية تفشل في النمو. لتحديد CNiFERs مرشح محتمل، واستخدام تحليل 3 نقاط للاستجابة الحنق مع ناهض وما شابه ذلك، على سبيل المثال، الدوبامين لD2R.

  1. عندما كانت الخلايا ~ 90٪ متكدسة في 24 لوحة جيدا، ونضح بلطف وسائل الإعلام. إضافة ~ 100 ميكرولتر من 0.05٪ (ث / ت) التربسين / EDTA واحتضان لمدة 1-2 دقائق عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ (ت / ت) CO 2. إضافة 400 ميكرولتر من وسائط النمو HEK293 الخلايا المعالجة التربسين وخلط الخلايا عن طريق سحن لطيف.
  2. إعداد منحنى ناهض 3 نقاط للفحص الأولي من اومهالأخبار. لكل استنساخ CNiFER، أي واحد من الآبار من 24 لوحة جيدا، قسامة 100 ميكرولتر من تعليق خلية (~ 4 × 10 3 خلايا / جيد) في كل من ثلاثة آبار، على سبيل المثال، A1، A2، A3، ل 96-جيدا لوحة المغلفة فبرونيكتين (أسود مع قاع واضح) (راجع الخطوة 3.5).
  3. نقل ما تبقى من ~ 200 ميكرولتر من خلية إلى تعليق لوحة 12-جيدا تحتوي على 1000 ميكرولتر من وسائط النمو HEK293 (1.2 مل الحجم النهائي). احتضان كل من لوحات عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ (ت / ت) CO 2، حتى ~ 90٪ متموجة. لوحة 96-جيدا هي للمقايسة فلوروميتريك ولوحة 12-جيدا هي لنمو وتوسيع الحيوانات المستنسخة.
  4. لتحليل 3 نقاط، وتحديد ثلاثة تركيزات مختلفة من ناهض التي 0.1-، 1.0-، و 10 مرات المفوضية الأوروبية 50 لهذه العملية من معين. إعداد تركيزات ناهض في لوحة المخدرات كما هو موضح في الخطوات 4.1.1-4.1.2. إجراء فلوروميتريك لوحة القارئ الفحص كما هو موضح في الخطوات 4.1.3-4.1.5.
  5. حساب FRنسبة ET (ΔR / R) كما هو موضح في الخطوة 4.1.6. اختيار CNiFERs التي لديها حساسية المناسبة وأكبر رد الحنق للتوسع، وتجميد الوراء، وتحليلات أكثر شمولا (الخطوة 7).
  6. لاستنساخ التي تم تحديدها في الخطوة 6.5، وتنمو في لوحة ال 12 أيضا، إزالة واستبدال 600 ميكرولتر من وسائل الإعلام نمو HEK293 كل 5-7 أيام، حتى ~ 90٪ متموجة.
  7. تدريجيا توسيع الحيوانات المستنسخة من لوحة 12-جيدا لوحة 6 جيدا، ومن ثم إلى قارورة T25 (الخطوات 2،3-2،6 والجدول 2). عندما القارورة T25 هي ~ 90٪ متموجة، وخلايا الحصاد كما هو موضح (الخطوات 2،3-2،5). resuspend الكرية خلية في 5 مل من وسائط النمو HEK293.
  8. إضافة 1 مل من خلية إلى تعليق قارورة T75 مع 9 مل من وسائط النمو HEK293. استخدام ما تبقى من 4 مل من تعليق خلية لمدة cryoprotection والتخزين في السائل N 2 (الخطوات 8،2-8،3). إعداد ثمانية 1.5 مل cryotubes ووضع على الجليد.
  9. في قارورة T75، والحفاظ على الخلايا عن طريق استبدال وسائل الإعلام ثإيث وسائط النمو HEK293 جديدة، على سبيل المثال، 10 مل كل 3-5 أيام حتى 70-80٪ متموجة، بعد ~ 1-2 أسابيع.

7. الاختيار النهائي من CNiFER النسخ عن طريق فلوروميتريك قارئ لوحة

  1. في اليوم قبل الفحص لوحة قارئ:
    1. حصاد الخلايا من ~ 90٪ متكدسة T75 قارورة (انظر الخطوات 2،3-2،6، الجدول 2). البذور 96-جيدا لوحة المغلفة فبرونيكتين (أسود مع قاع واضح) في 5 × 10 4 / جيد مع ~ 100 ميكرولتر من تعليق خلية. ملاحظة: يتم توزيع واحدة استنساخ في عملية واحدة لوحة 96-جيدا.
  2. إعداد لوحة المخدرات لفحص شامل من الحيوانات المستنسخة CNiFER، التمييز بين الاجابات ناهض معينة من الاستجابات غير محددة CNiFER.
    1. لإنشاء منحنى الاستجابة للجرعة كاملة، اختيار 10 تركيزات ناهض مختلفة في جميع أنحاء الاتحاد الأوروبي وتوقع 50. استخدام بئرين لل"لا الخلايا وبئرين لل" ACSF.
    2. لتحديد الاستجابات غير محددة، اختر عبتيتركيزات EE 12 الناقلات العصبية المختلفة أو جهري (72 بئرا) (الشكل 3). مثل ناهض، لوحة الدواء يحتوي على تركيزات 3 أضعاف في نسختين. على سبيل المثال، 100 ميكرولتر من ثلاثة تركيزات مختلفة من أستيل كولين، الغلوتامات، أوركسين، وكبار الشخصيات، الأدينوساين، السيروتونين، بافراز، GABA، المادة P، الميلاتونين، السوماتوستاتين والهستامين، كل بتركيز 3 أضعاف 50، 1000، و 3،000 نيوتن متر يتم تحميلها في لوحة المخدرات 96-جيدا.
  3. تعيين المعلمات على قارئ لوحة فلوروميتريك قياس الحنق وأداء تحويلات الحل كما هو موضح في الخطوات 4.1.3-4.1.5.
  4. لتحليل منحنى الاستجابة للجرعة كاملة، وحساب نسبة الذروة الحنق (ΔR / R) (الخطوة 4.1.6)، مؤامرة بوصفها وظيفة من تركيز ناهض سجل وتتناسب مع المعادلة هيل (خطوة 11.4). تحديد EC 50، هيل معامل، ونسبة الحنق القصوى. ل12 الناقلات العصبية الأخرى / جهري، مؤامرة ذروة ΔR / R بوصفها وظيفة سو تركيز الدواء.
  5. اختيار الحيوانات المستنسخة ~ 10 CNiFER التي لديها نسبة كبيرة الحنق، وهو EC المناسبة (50) لناهض وما شابه ذلك، وقليل أو أي ردود الخلفية لمستقبلات الناقل العصبي الأخرى (استجابة غير محددة).

8. تجميد الظهير مختارة النسخ CNiFER

  1. استخدام ~ 90٪ متكدسة T75 قارورة من استنساخ CNiFER الفردية. حصاد الخلايا كما هو موضح (الخطوات 2،3-2،5، الجدول 2). لتجميد الخلايا، resuspend الكرية خلية في 5 مل من وسائط النمو HEK293. تسمية عشرة 1.5 مل cryotubes وتعيين على الجليد.
  2. لcryoprotection، مزيج خلايا 1: 1 مع 20٪ (ت / ت) DMSO في وسائل الإعلام نمو HEK293، على سبيل المثال، 5 مل من 20٪ (ت / ت) خليط DMSO / وسائل الإعلام ومختلطة بلطف مع 5 مل من تعليق خلية (نهائي تركيز DMSO 10٪).
  3. قسامة 1 مل في كل من cryotubes. تجميد الأنابيب مع الخلايا في الفريزر -80 درجة مئوية O / N، في مربع رغوة العزل (انظر المواد). نقل cryotubes إلى LIQUالنيتروجين معرف للتخزين على المدى الطويل.

9. CNiFER زرع في ماوس اللحاء

  1. تعقيم جميع الأدوات الجراحية في الأوتوكلاف قبل الجراحة. إعداد حقل شبه عقيمة لعملية جراحية من قبل القضاء مع 70٪ من الإيثانول ووضع حفاضة نظيفة المختبر.
  2. إعداد حقن الماصة CNiFER عن طريق سحب الزجاج الشعرية (معرف من 0.53 ملم) على مجتذب الكهربائي العمودي. استخدام زوج من لا. 5 ملقط غرامة غيض لكسر غيض من القطب إلى قطر ~ 40 ميكرون.
    ملاحظة: هذا هو أفضل إنجاز تحت المجهر التكبير ستيريو مع graticule.
  3. تخدير الكبار (يوم ما بعد الولادة 60-90) C57BL / 6 الماوس مع isoflurane: 4٪ (ت / ت) لتحريض و1،5-2،0٪ (ت / ت) للصيانة. استخدام ذيل أو قرصة اصبع القدم للتأكد من أن الفأر هو تخدير كامل.
    ملاحظة: إعادة قرصة دورية وتقييم الطولي الوخز في جميع أنحاء لعملية جراحية لإعادة تقييم عمق التخدير.
  4. تغطية العينين مع مرهم للعين إلى pتجفيف revent. جبل الماوس في إطار التجسيمي بقضبان الأذن. الحفاظ على درجة حرارة الجسم الماوس عند 37 درجة مئوية باستخدام وسادة الحرارة التي تنظمها التحقيق المستقيم.
  5. حلاقة مساحة ما يقرب من 5 مم 12 مم مع ماكينة حلاقة كهربائية الحيوان. تطبق Betadine تليها 70٪ (ت / ت) الأيزوبروبانول. استخدام شفرة مشرط لقطع وإزالة الجلد فوق سطح الجمجمة. استخدام شفرة مشرط لإزالة السمحاق من سطح الجمجمة. كشف وتنظيف سطح الجمجمة، كما هو موضح لعملية جراحية التجسيمي 11.
  6. خفض والماصة الزجاج الفارغة إلى bregma وتسجيل انتيرو-الخلفي (A / P) وميديو الاطراف (M / L) بتنسيق. مشيرا إلى أطلس الماوس الدماغ، وحساب الموقف من موقع الحقن. تحويل الماصة إلى موقع الهدف وعلامة الجمجمة لتشكيل نافذة لاحق. انظر جيتين وآخرون. لمزيد من التفاصيل على حقن التجسيمي مع القوارض 11.
    ملاحظة: موقع الحقن ونافذة تعتمد على ريجأيون لدراستها وتوزيع التوقعات العصبي أو الببتيد الإفراج في القشرة. على سبيل المثال، في منشور صدر مؤخرا 7، ينسق التجسيمي 1،0-2،0 مم A / P و1،0-2،0 مم M / L كانت تستخدم لحقن خلايا CNiFER في القشرة الأمامية للتصوير في الجسم الحي من إطلاق الدوبامين خلال الإشراط الكلاسيكي .
  7. تشكيل 2 مم × 3 مم نافذة ضعفت الجمجمة كما هو موضح سابقا 12،13.
    ملاحظة: العظام في الإطار يجب أن يكون 15-20 ميكرون سميكة. بقع بيضاء صغيرة في العظام لا ينبغي أن تكون واضحة عند مبلل على سطح الجمجمة، إذا كانت العظام ضعيفة بما فيه الكفاية 12،13.
  8. وضع ACSF الاسفنج غارقة في إطار لإبقائها رطبة في حين تستعد الخلايا لحقن.
  9. حصاد استنساخ CNiFER التي كانت تزرع في T75 القارورة إلى ~ 80٪ confluency. نضح في وسائل الإعلام وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني العقيمة.
    ملاحظة: تم حذف التربسين لهذه الخطوات.
  10. إزالة برنامج تلفزيوني واستخدام 10 مل سو ACSF لإزاحة الخلايا من أسفل القارورة. الخلايا يسحن لفصل كتل الخلية. الطرد المركزي و resuspend بيليه في 100 ميكرولتر من ACSF. أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 1400 x ج وإزالة طاف، وترك بيليه المشمولة في ACSF. هذه الخطوة يترك كتلة من الخلايا في تعليق.
  11. الردم الماصة حقن أعدت في الخطوة 9.2 مع الزيت المعدني، تحميل الماصة الصعود إلى nanoinjector، ودفع المكبس لإخراج حبة صغيرة من النفط. وضع 5 ميكرولتر من تعليق خلية CNiFER على شريط من البلاستيك فيلم البارافين بالقرب من إعداد الماوس. وضع إما CNiFERs أو السيطرة على الخلايا CNiFER في ماصة سحبت.
  12. نقل ماصة للX الهدف وينسق Y، أي A / P، وأشار إلى M / L في الخطوة 9.5. انخفاض ماصة، ثقب الجمجمة ضعيفة، والاستمرار في ~ 200-400 ميكرون تحت سطح الجمجمة، لإيداع الخلايا CNiFER في طبقات 2/3 من القشرة.
  13. حقن ~ 4.6 NL الخلايا CNiFER في أعمق الموقع مع nanoinjecتور، حركة المذكرة في واجهة النفط والخلايا ومن ثم الانتظار لمدة 5 دقائق للحصول على الخلايا إلى الاستغناء. سحب ماصة ~ 100 ميكرون وحقن ~ 4.6 NL آخر من الخلايا CNiFER، الانتظار مدة 5 دقائق، ثم سحب ماصة ببطء وبرفق لمنع ارتجاع للCNiFERs. تكرار الحقن في واحد أو أكثر من مواقع مجاورة.
  14. تكرار الحقن الخطوات 9،8-9،12 مع التحكم HEK293 الخلايا (أي HEK293 / TN-XXL / G qi5 استنساخ تفتقر GPCR). فصل CNiFER وسيطرة على مواقع حقن الخلايا التي كتبها ~ 200 ميكرون.
  15. بعد الانتهاء من زرع الخلايا، وشطف نافذة ضعفت الجمجمة مع ACSF وانتظر الجمجمة حتى يجف. تطبيق قطرة من الغراء cyanoacrylate (انظر المواد) خلال نافذة وسرعان ما وضع غطاء معقم الزجاج قبل قطع على رأس الغراء. دفع برفق غطاء زجاجي ضد الجمجمة لبضع ثوان. السماح للالغراء الجاف لمدة 2 دقيقة 12،13.
  16. ختم حواف غطاء زجاجي مع الاسمنت الأسنان وشكل فصيل عبد الواحدالذراع حول النافذة لعقد المياه لتحقيق الهدف غمس.
  17. لشل حركة رأس الفأر خلال التصوير، وإرفاق مبنية خصيصا الرأس شريط مع قطرة صغيرة من الغراء cyanoacrylate وراء النافذة (انظر 14 لمزيد من التفاصيل على البعد والمواد). السماح للالغراء يجف تماما ثم قم بإضافة الإسمنت إضافي الأسنان لمواصلة تعزيز مبنية خصيصا الرأس بار.
  18. تغطية بقية سطح الجمجمة، فيما عدا النافذة، مع طبقة من الاسمنت الأسنان. تأكد من تغطية حواف الجلد عن طريق الاسمنت واتركها لتجف لمدة 20 دقيقة.
  19. بعد الجراحة، والتوقف عن إدارة الأيزوفلورين وترك الماوس على وسادة التدفئة في قفص حتى يتعافى تماما من التخدير. حقن 5٪ (ث / ت) الجلوكوز في المياه المالحة (الشوري) لمعالجة الجفاف و،05-،1 ملغم / كغم البوبرينورفين (الملكية الفكرية، والإفراج الفوري) لتسكين الألم بعد العمليات الجراحية.
    ملاحظة: لتقليل رد فعل مناعي محتمل للCNiFERs الإنسان، وضخ الماوس يوميا مع 20 ميكرولتر / 100 ز سيكلوsporine (الملكية الفكرية) ابتداء من اليوم قبل حقن CNiFERs.
  20. عودة الماوس إلى قفص وطنه للأغذية والمياه.

10. في فيفو التصوير من CNiFER النسخ

ملاحظة: يتم إجراء تصوير مباشر مع الفئران باستخدام مجهر ثنائي الفوتون وجهاز الرأس ثابت. ليس هناك حاجة إلى تخدير خلال جلسات التصوير. عند التصوير الحيوانات في حالة اليقظة، والحد من مساند الرأس لبضع ساعات فقط في وقت لتقليل مستويات التوتر. عودة الحيوان إلى أنه قفص المنزل بين جلسات التصوير للأغذية والمياه. يتم التقليل من الإجهاد المحتمل قبل سواد أضواء الغرفة والمحيطة جزءا من الماوس في العلبة.

  1. في اليوم التالي لعملية جراحية، جبل الماوس على منصة التصوير من قبل الشد المعدن الرأس بار مزروع في الجمجمة إلى الإطار الرأس التثبيت.
    ملاحظة: عند التصوير الفئران مستيقظا، ينبغي للدورة التصوير لا تتجاوز بضع ساعات بسبب الإجهاد المحتمل الناجم عن رئيس جهاز ضبط النفس.
  2. وضع منصة التصوير مع الماوس ضبط النفس الرأس في المجهر التصوير ثنائي الفوتون مجهزة 10X (0.30 NA) و40X (0.80 NA) أهداف مياه الغمر.
  3. إدراج مكعب تصفية لالحنق التصوير (eCFP والسترين) الذي يحتوي على مرآة مزدوج اللون في 505 نانومتر، والفرقة تمرير مرشحات التي تمتد 460 نانومتر إلى 500 نانومتر لقياس eCFP و 520 نانومتر إلى 560 نانومتر لقياس السترين.
  4. إضافة ACSF إلى تحتوي أيضا نافذة ضعفت الجمجمة وخفض الهدف الغمر بالماء في ACSF. استخدام العدسة بالتزامن مع مصباح الزئبق ومرشح GFP مكعب لتحديد سطح القشرة والأوعية الدموية تحت النافذة.
    ملاحظة: نمط الأوعية الدموية يساعد على تحديد مكان وصورة في نفس المنطقة خلال الأيام المتكررة من التصوير. التبديل إلى الهدف الغمر بالماء 40X لتحديد CNiFERs من خلال التركيز يدويا على سطح القشرة على الخلايا باستخدام GFP مرشح مكعب ومصباح الزئبق.
  5. التي أنشئت من أجل التصوير ثنائي الفوتون. حدد ا ف بمسار الضوء propriate للتصوير ثنائي الفوتون. لنظام تجاري نموذجي، استخدام البرنامج للتبديل إلى وضع التصوير ثنائي الفوتون وتوجيه الضوء على أنابيب مضخم (هذه الفرق) في أجهزة الكشف غير descanned. بدوره على القريب الأشعة تحت الحمراء ليزر نابض الفيمتو ثانية، حدد الطول الموجي من 820 نانومتر، وإعداد قوة 5-15٪. ملاحظة: 5٪ من الطاقة عادة ما يوفر ~ 25 ميغاواط في العينة.
  6. تعيين PMT1 وPMT2 الجهد قريبة من الحد الأقصى المسموح به، وعادة ما 700-1،000 الخامس اعتمادا على PMT. تعيين مكسب إلى 1 لكل قناة والصفر موقف ض لتحقيق الهدف.
  7. خفض هدف ~ 100-200 ميكرون من السطح القشري وبدء المسح الضوئي س ص. ضبط قوة الليزر، وزيادة، وPMT الجهد لكل قناة، أي eCFP والسترين، لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء من مضان CNiFER.
  8. استخدام ميزة التكبير في البرنامج لتقييد الصورة إلى المنطقة التي تحتوي على خلايا CNiFER فضلا عن backgrounالمنطقة د. استخدام معدل المسح لا أبطأ من إطار واحد كل 2 ثانية (0.5 هرتز) في 4 ميكرو ثانية لكل بكسل. ضبط الخط المتوسط ​​لمناسبة نسبة الإشارة إلى الضوضاء، على سبيل المثال، كالمان 2 خط المتوسط.
  9. رسم المنطقة من الفائدة (ROI) حول الخلايا CNiFER، المحيطة حول 3-4 خلايا لكل طائرة. إعداد تحليل في الوقت الحقيقي من متوسط ​​كثافة العائد على الاستثمار. بدء اكتساب لمراقبة CNiFER مضان مع مرور الوقت.
  10. جمع مضان من CNiFERs قبل وخلال التلاعب التجريبية، على سبيل المثال، التحفيز الكهربائي، وتحفيز ChR2، والسلوك، كما هو محدد من قبل المستخدم.
  11. عندما يتم الانتهاء من تجربة التصوير، وعودة الماوس لقفص وطنه. كرر التصوير عبر أيام، كما تريد. عند إعادة التصوير الخلايا تشير إلى صورة الأوعية الدموية-تضخم منخفض المكتسبة سابقا لتوجيه العودة إلى الميدان التصوير نفسه (خطوة 10.4).
    ملاحظة: يمكن تصوير CNiFERs المزروعة لمدة 7 أيام على الأقل.

تحليل 11. البيانات

  • ملف التصوير المفتوحة وحدد في العائد على الاستثمار لCNiFERs والعائد على الاستثمار واحد للخلفية. اختر "تحليل سلسلة" لكل من قنوات لكل العائد على الاستثمار. تصدير متوسط ​​كثافة مضان لكل العائد على الاستثمار كملف المفصول.
  • استخدام برنامج رياضي (انظر المواد) برنامج لتحليل القيم مضان. المنخفضة تمرير مرشح (0.3 هرتز) كل إشارة ثم طرح مضان الخلفية في كل العائد على الاستثمار من eCFP والسترين كثافة مضان.
  • حساب متوسط ​​مضان خط الأساس وحساب النسب كما هو موضح في المعادلة 1 لقياس نسبة ΔR الحنق (ر) / R.
  • لتحديد حساسية CNiFERs، رسم نسبة الحنق بوصفها وظيفة من تركيز سجل ناهض. تتناسب مع المعادلة هيل لتحديد EC 50 و هيل معامل (ن)، وذلك باستخدام البرامج الإحصائية العلمية وهيل المعادلة (معادلة 2).

    • Equation1

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    ويستمد وCNiFER من الخلية البشرية الكلى الجنينية (HEK293) التي تم تصميمها للتعبير عن ثابت لا يقل عن اثنين من البروتينات: أ محددة G-مستقبلات البروتين يقترن (GPCR) والمشفرة وراثيا [كا 2+] الاستشعار، TN-XXL. TN-XXL يخضع نقل مضان بالرنين الطاقة (الحنق) بين السماوي والأصفر فلوري البروتينات، eCFP والسترين، على التوالي، ردا على الكالسيوم 2+ أيونات 6،15. تفعيل GPCRs أن الزوجين الذاتية G ف البروتينات G يؤدي الى زيادة في عصاري خلوي [كا 2+] من خلال مسار المجلس التشريعي الفلسطيني / IP 3، مما يؤدي إلى زيادة في الحنق من TNXXL الكالسيوم 2+ كاشف (الشكل 1).

    الشكل 1
    الشكل 1: مخطط لCNiFERs تطوير توب لهذه العملية من-كا 2+ إشارات الطريق المطلوبة لإنشاءخلية CNiFER. القاع، والخطوات الأساسية لبناء CNiFERs باستخدام خلايا HEK293. الخطوة 1. تنبيغ مع المشفرة وراثيا القائم على الحنق الكالسيوم 2+ -detector (TN-XXL). الخطوة 2. تنبيغ Gα G-بروتين الوهم، أي qs5 G، G qi5، إذا لزم الأمر. الخطوة 3. تنبيغ النوع من الاختزال فريدة من نوعها لخلق CNiFER. ثنائي الفوتون ضوء الإثارة (أحمر) يثير eCFP، الذي يخضع الحنق، وإنتاج كلا من الانبعاثات eCFP (السماوي) والانبعاثات السترين (أصفر). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    الزيادة في الحنق توفر السريع البصرية للقراءة من تغيير في مستويات الناقل العصبي. لتطوير CNiFER لنوع معين من الناقلات العصبية، أولا تحديد نوع من البروتين G أن الأزواج إلى هذه العملية من. لG ف -coupled GPCRs، يستخدم لهذه العملية من مجموعة البروتينات ف أعرب التطور الطبيعي فيخلايا HEK293. لG ط / س -coupled GPCRs، يتم إنشاء خط HEK293 نسيلي أولا أن يعبر عن بروتين G خيالية أن يعيد توجيه هذه العملية من لG ف -PLC / IP 3 المسار. ويتم إنجاز هذا مع بروتين G خيالية، qi5 G، والذي يحتوي على تسلسل ف Gα في المقام الأول وخمسة الأحماض الأمينية من محطة الكربوكسيل من G ط. هذه خمسة الأحماض الأمينية هي كافية لG qi5 للتواصل مع G ط / س -coupled GPCRs، ولكن إشارة من خلال ف مسار G. لG الصورة GPCRs -coupled، يتم استخدام qs5 الوهم G 10. الاستراتيجية العامة لإنتاج CNiFER هي: 1) إنشاء خلية HEK293 نسيلي أن يعبر عن ثبات والبصرية الكالسيوم 2+ كاشف، أي TN-XXL، وذلك باستخدام تنبيغ الفيروسة البطيئة من خلايا كلوة، 2) التعبير عن مستقر بروتين الوهم G ، إذا لزم الأمر، في الخلية استنساخ HEK293 معربا عن TN-XXL، و 3) إنشاء معربا عن مستقر استنساخ النوع من الاختزال في الخلية HEK293استنساخ معربا عن TN-XXL وبروتين G خيالية. خط HEK293 نسيلي التي تفتقر إلى هذه العملية من ولكن لديه TN-XXL وخيالية بروتين G بمثابة "السيطرة CNiFER". هناك حاجة إلى السيطرة CNiFER للتأكد من أن استجابة CNiFER ومن المقرر خصيصا لتفعيل مستقبلات هندسيا، أي D2R، وليس لتنشيط مستقبلات أخرى أعرب التطور الطبيعي في الخلايا HEK293.

    لتوليد الفيروسة البطيئة، ويستخدم نظام التعبير lentivector، على سبيل المثال، pCDH-CMV-MCS-EF1-بورو، الذي يحتوي على عناصر وراثية مسؤولة عن التعبئة والتغليف، التنبيغ، والتكامل مستقر من التعبير الفيروسي بناء في الحمض النووي الجيني، والتعبير عن الهدف تسلسل الجينات. لإنتاج عيار عالية من الجسيمات الفيروسية والتعبير وناقلات التعبئة والتغليف وعابر شارك في transfected في خلايا الثدييات منتج ويتم جمع الفيروس. هناك العديد من المرافق الأساسية الفيروسية في الولايات المتحدة التي يمكن أن تولد تي عالية ثالثا الفيروسة البطيئة. بعد إصابة خلايا HEK293، ويوفر الجين بورو المقاومة للمضادات الحيوية لتحديد خلايا HEK293 transduced.

    من أجل تحديد خطوط نسيلي محددة، transduced يتم فرز الخلايا HEK293 باستخدام مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) النظام. والهدف هو عزل نسيلة التي تحتوي على مستوى عال من التعبير القائمة على الحنق-كا 2+ كشف وقدرة تمر الحنق. في هذا المثال من تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية، يتم رسم مضان من الانبعاثات eCFP ضد إشارة الحنق (eCFP الإثارة وانبعاث سيترين). المربعات علامة المناطق (P2 و P3) التي سيتم اختيارها لاحقا ( "بوابات") للفرز في لوحات 96-جيدا (الشكل 2). عموما، حوالي أربع لوحات 96-جيدا كافية للكشف عن النجاح في إيجاد CNiFERs. من هذه اللوحات 4، ما يقرب من 100 الحيوانات المستنسخة هي مناسبة لتحليل لوحة القارئ فلوروميتريك.

    e_content "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" 1 "> الشكل 2
    الشكل 2: مثال لتحليل FACS عينة من الانتاج بعد تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. المؤامرات الرسم البياني eCFP الانبعاثات ( "475/20-A") بوصفها وظيفة من الانبعاثات السترين ( "الحنق V-530/30-A")، وذلك باستخدام eCFP الإثارة لكل خلية. المناطق P2 ومناطق عرض P3 تحديد، أي بوابة، للفرز في الخلايا الفردية. الألوان هي تعسفية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    مرة واحدة ونمت الخلايا مرتبة لكثافة كافية، يتم تحديد استجابة الحنق التالية تفعيل ناهض باستخدام نظام لوحة القارئ فلوروميتريك 96-مجهزة تجهيزا جيدا مع معالجة حل. لتضييق عدد من الحيوانات المستنسخة لدراسة، يتم استخدام "3 نقاط" منحنى ناهض لفحص ~100 استنساخ وحدد CNiFERs مع أفضل الردود. ما يقرب من 10 استنساخ ثم يتم تحليلها أخرى مع تحديد كاملة بين الجرعة والاستجابة مع ناهض وما شابه ذلك، وردود الفعل غير محددة، بحث مع 12 الناقلات العصبية أو جهري أخرى. ويتم إعداد لوحة المخدرات 96-كذلك ثلاثة أضعاف تركيز (يتم تخفيف تركيز النهائي 1: 3 في لوحة) من المخدرات (على سبيل المثال، منبهات، الخصوم، وما إلى ذلك) في ACSF. في هذا المثال، يتم تعيين لوحة المخدرات يصل لاختبار D2 CNiFER مع ناهض لها وما شابه ذلك، الدوبامين، والاستجابات المحتملة غير محددة مع مجموعة متنوعة من غيرها من الناقلات العصبية والببتيد منبهات (الشكل 3). العمود الفقري CNiFER، الذي يفتقر إلى هذه العملية من، بمثابة رقابة هامة لCNiFER تم إنشاؤه حديثا.

    الشكل (3)
    الرقم 3: أمثلة من تخطيط لوحات 96-جيدا الأعلى، طاولة layouر لتحميل لوحة المخدرات 3X للقارئ لوحة فلوروميتريك، وذلك باستخدام تركيزات ثلاثة أضعاف من مختلف الناقلات العصبية والببتيدات. أسفل، أمثلة واضحة بلاستيكية 96-جيدا لوحة المخدرات والأسود لوحة 96-جيدا لبذر CNiFERs وقياس في قارئ لوحة. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    ومن المتوقع أن تزيد من استجابة الحنق، نتيجة لارتفاع من بين الخلايا [كا 2+] والكشف عن طريق TN-XXL تحفيز هذه العملية من. في ظل هذه الظروف، وينتج الحنق من قبل eCFP والسترين تقترب، بحيث الإثارة من eCFP تنتج انبعاثات eCFP أصغر وأكبر الانبعاثات السترين. في هذا المثال، يتم تعيين الإثارة إلى 436 نانومتر، وانبعاث المرشحات يتم تعيين إلى 485 ± 7.5 نانومتر لeCFP و 527 ± 7.5 نانومتر لالسترين (الشكل 4). ثلاثين ثانية من بايتم قياس سيلين مضان ثم 50 ميكرولتر من ناهض "ثلاثة أضعاف" في لوحة ACSF يتم تسليم لاحتواء جيدا كل ACSF ميكرولتر 100 (1: 3 تمييع). يتم قياس eCFP ومضان الانبعاثات سيترين كل 3.8 ثانية لمدة 180 ثانية. يتم أخذ القياسات خلفية من الآبار دون الخلايا وطرح، إذا لزم الأمر. كثافة مضان هي تطبيع خطوط الأساس إلى ما قبل التحفيز (F (ر) / F (المرجعية)) يتم قياس، وردود الذروة لحساب نسبة الحنق (ΔR / R) باستخدام F (ر) / F (خط الأساس) من 527 نانومتر و 485 نانومتر قنوات (المعادلة 1). ثم يتم إنشاء منحنى الاستجابة للجرعة التي كتبها بالتآمر نسبة الحنق بوصفها وظيفة من تركيزات ناهض مختلفة وتناسب مع المعادلة هيل لتحديد EC 50 و معامل هيل (الشكل 5) (المعادلة 2). وCNiFER الأمثل يسلك نسبة الحنق كبيرة وEC المناسبة (50) لناهض وما شابه ذلك، ويسلك الردود الخلفية قليلا أو لا لneurotransmit الآخرين منبهات ثالثا. على النقيض من ذلك، يجب أن سيطرة CNiFER تظهر استجابة تذكر لناهض وما شابه ذلك.

    الشكل (4)
    الشكل 4: مثال على استجابة الحنق الاستجابة D2R CNiFER الحنق الناجم عن ناهض يقاس على قارئ لوحة بنظام تسليم حل. (أ) مؤامرة للاستجابة الحنق، أي eCFP الإثارة مع انبعاثات eCFP والسترين، خلال تطبيق الدوبامين (شريط أحمر) إلى D2 CNiFERs. لاحظ أن انخفاض الانبعاثات eCFP بينما يزداد انبعاث سيترين مع ناهض (الدوبامين). (B) مؤامرة من نسبة الحنق (المعادلة 1) للاستجابة في الفقرة (أ) الشكل المعدل من مولر وآخرون، 2014 (7). الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

    er.within الصفحات = "1"> الرقم 5
    الرقم 5: أمثلة من منحنيات الجرعة الاستجابة لD2 CNiFER (A) جرعة منحنيات استجابة للاستجابة D2 CNiFERs إلى الدوبامين (DA، الأسود) والنورادرينالين (NE، الأخضر). وبالإضافة إلى ذلك، يظهر استجابة CNiFERs "السيطرة" تفتقر إلى D2R. (ب) ويبين الرسم البياني شريط استجابة نسبة الحنق عن الناقلات العصبية وجهري أخرى في 50 نانومتر و 1 ميكرومتر. القيم يعني ± SEM. الرقم معدلة من مولر وآخرون، 2014 (7). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    ويمكن تقييم استنساخ CNiFER كذلك إلى احتمال الحساسية تعتمد على مستقبلات ولحلها الزمني، تميز العرضاثنين من البقول ناهض مختلفة (لمزيد من التفاصيل، انظر مولر وآخرون، 2014 7). وقد شيدت استنساخ CNiFER، فإن الخطوة التالية هي اختبار وظيفتها في الجسم الحي. لرصد مضان في الجسم الحي، فمن الضروري استخدام مجهر ثنائي الفوتون. بعد إعداد نافذة ضعفت الجمجمة، يتم تحميل CNiFERs إلى ماصة الزجاج وحقنه في طبقات 2/3 من القشرة. ثم يتم إعداد الماوس في الجسم الحي التصوير عن طريق ربط زلة غطاء زجاجي على الجمجمة ضعيفة، وزرع شريط الرأس لتثبيت الرأس أثناء التصوير (الشكل 6).

    لتحديد أن CNiFERs مزروع على البقاء في الجسم الحي، وتركيزات المعروف ناهض يمكن حقن بالقرب من موقع الزرع ونسبة الحنق تحديد 7. لمزيد من التحقق من صحة نشاط CNiFERs مزروع، وتحفيز الخلايا العصبية المدخلات يجب فحصها. على سبيل المثال، مع D2 CNiFER، وتأثيرتم فحص التحفيز الكهربائي للخلايا العصبية الدوبامين الدماغ المتوسط ​​أن المشروع إلى القشرة. كان مزروع والقطبين 0.1 MΩ التنغستن تحفيز الكهربائي مع الفصل غيض من 500 ميكرون في المادة السوداء (-3.2 مم A / P، -1.3 مم M / L، -4.4 مم D / V). يبين الشكل 6 مثال كهربائيا تحفيز المادة السوداء في كثافات مختلفة ومراقبة زيادة في نسبة الحنق لD2 CNiFERs 7. لاحظ أن (الملكية الفكرية) حقن داخل الصفاق النظامية للخصم مستقبلات D2، eticlopride (1 ملغ / كلغ)، وكتل الاستجابة D2 CNiFER. من ناحية أخرى، حقن الكوكايين (15 ملغ / كلغ)، الذي يمنع امتصاص الدوبامين، يعزز أثار كهربائيا استجابة D2 CNiFER 7.

    الشكل (6)
    الشكل 6: مثال D2 CNiFER الاستجابة أنا أونج> ن فيفو بعد التنبيه الكهربائي من المادة السوداء. (A) رسم كاريكاتيري يظهر الماوس ثابت رئيس المعدة للتصوير في الجسم الحي اثنين الفوتون والتحفيز الكهربائي. ضوء ثنائي الفوتون (أحمر، 820 نانومتر) لالإثارة و 475 نانومتر انبعاث لeCFP (الأزرق) و 530 نانومتر انبعاث لالسترين (الخضراء). (ب) وتبين مؤامرة خط نسبة الحنق لD2 CNiFER ضخت في القشرة التالية التحفيز الكهربائي المادة الرمادية في الدماغ، أي 200 μsec نبضات من 50-300 أمبير في 50 هرتز لمدة 500 ميللي ثانية، وبعد التحفيز الكهربائي في وجود D2R خصم (eticlopride) أو الكوكايين. الرقم معدلة من مولر وآخرون، 2014 (7). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

    ftp_upload / 53290 / 53290table1.jpg "/>
    الجدول 1: قائمة المواد الكيميائية والمواد الكيميائية لصنع HEK293 متوسطة النمو وACSF.

    الجدول 2
    الجدول 2: وحدات التخزين لخلايا حصاد من لوحات الحجم ثقافة مختلفة أو قوارير.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    إنشاء CNiFERs يوفر استراتيجية مبتكرة وفريدة من نوعها لقياس بصريا إطلاق النواقل العصبية في الدماغ في الجسم الحي. هي مناسبة بشكل مثالي لقياس CNiFERs الإفراج extrasynaptic، أي حجم التوصيل، لالناقلات العصبية. الأهم من ذلك، كل CNiFER تمتلك خصائص النوع من الاختزال الأصلي، وتوفير قياس بصري الفسيولوجي للتغيرات في مستويات النواقل العصبية في الدماغ. حتى الآن، تم إنشاؤها CNiFERs للكشف عن أستيل كولين (M1-CNiFER) 6، الدوبامين (D2-CNiFER) (7) والنورادرينالين (α1a-CNiFER) 7.

    من حيث المبدأ، على CNiFER يمكن أن تنشأ عن أي الناقل العصبي الذي يشير من خلال هذه العملية من. وبالنسبة للحالة التي يكون فيها إشارات لهذه العملية من خلال G ف البروتينات G، هو لم يكن هناك تعديل آخر على خلية HEK293. GPCRs التي تشير من خلال G ط / س، ومع ذلك، تتطلب coexpression من qi5 G خيالية بروتين Gإلى الزوجين النوع من الاختزال إلى G ف / PLC مسار 7،10. وبالمثل، فإن GPCRs التي تشير من خلال G الصورة تتطلب coexpression من خيالية بروتين G qs5 G 10. وبمجرد الانتهاء، يتم فحص كل استنساخ CNiFER وفقط تلك الحيوانات المستنسخة CNiFER أن يكون هناك تقارب مماثلة لمستقبلات الأصلي، تظهر قليلة أو معدومة الحساسية وتوفر نسبة الإشارة إلى الضوضاء التي هي كافية لقياس مع في الجسم الحي اثنين الفوتون المجهري، ويتم اختيار للدراسة في الجسم الحي.

    للدراسة في الجسم الحي، فإنه ينصح بشدة لعلاج الفئران مع السيكلوسبورين للحد من أي استجابة مناعية المحتملة. هناك احتمال الرفض أو استجابة مناعية مع زرع خلايا CNiFER الإنسان في الدماغ القوارض. وكان التحقيق هذا من قبل دراسة التعبير عن GFAP وMAC1 7، بعد CNiFER الزرع. لم CNiFERs لا تظهر لانتاج ندوب الدبقية أو توليد أي جوهريficant MAC1 تلطيخ 7.

    مسألتين رئيسيتين للنظر في بناء CNiFERs هي الحساسية والحساسية. إذا كانت المفوضية الأوروبية 50 مرتفع جدا، أي تقارب منخفضة، نسبة إلى مستقبلات الأصلي، ثم CNiFER قد لا يكون حساسية كافية للكشف عن الافراج عن العصبي في الجسم الحي. حل واحد هو rescreen الحيوانات المستنسخة واختيار CNiFER استنساخ المختلفة التي لديها أعلى النسب. ان استراتيجية بديلة يكون لاختبار أنواع أخرى من ترميز وراثيا الفلورسنت كا 2+ -detectors التي قد يكون لها حساسية والكالسيوم أعلى 2+، والتي يمكن تحويل EC 50 لتنشيط النوع من الاختزال. لأن التصميم CNiFER غير نمطي، فإنها تتكيف بسهولة مع أنواع أخرى من ترميز وراثيا الكالسيوم 2+ -detectors، مثل GCaMP 16. يمكن عزل الحيوانات المستنسخة CNiFER مع نفس مستقبلات ولكنها مختلفة EC 50 ق يكون من المفيد لتوسيع النطاق الديناميكي للكشف عن إطلاق نوي الذاتيةrotransmitters في الجسم الحي.

    والحساسية من CNiFER أيضا تحد من استخدامه في الجسم الحي. وإذا كانت الاستجابة ذروة ينخفض ​​تدريجيا مع كل نبضة من ناهض، ثم مستقبلات يمكن تقليل حساسية. في هذه الحالة، فحص الحيوانات المستنسخة الأخرى، وتحديد ما إذا كانت تستجيب بنفس الطريقة. قد تكون التعديلات على تسلسل الأحماض الأمينية مستقبل، أو استخدام نوع فرعي آخر من مستقبلات الضروري معالجة الحساسية تعتمد على ناهض. إذا كان هناك من المعروف المواقع من الأحماض الأمينية الفسفرة أو معلومة المنتسبين مع G تحركات البروتينات المستقبلة (GRKs)، سيكون من المستحسن لبناء البديل غير مزيل للتحسس لللهذه العملية من قبل تحور واحد أو أكثر من المواقع. لا بد من تحديد آلية الحساسية لكل مستقبلات على أساس كل حالة على حدة.

    حتى الآن، تم زرع CNiFERs فقط في الطبقات السطحية من القشرة 6،7، ويرجع ذلك إلى الطيفية قيود مع fluorophores التصوير مع ميل اثنين الفوتونcroscopy 17،18. في المستقبل، قد يكون من الممكن للتكيف مع التكنولوجيا CNiFER مع القياسات المأخوذة من الألياف مضان 19 بحيث يمكن زرعها CNiFERs في مناطق الدماغ تحت القشرية.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

    Acknowledgments

    نشكر ب كونكلين (جامعة كاليفورنيا، سان فرانسيسكو) لتوفير qi5 G و G qs5 cDNAs، A. شفايتزر للحصول على المساعدة مع الالكترونيات، N. تايلور للحصول على المساعدة مع فحص الحيوانات المستنسخة، إيان Glaaser وروبرت ريفكين للقراءة واقية واوليفييه Griesbeck لTN-XXL. وأيد هذا العمل من قبل المنح البحثية من خلال المعهد الأمريكي الوطني لتعاطي المخدرات (النداء) (DA029706، DA037170)، والمعهد الوطني للتصوير الطبية الحيوية والهندسة الحيوية (NIBIB) (EB003832)، هوفمان-لاروش (88610A) و "علم الأعصاب تتعلق بالمخدرات من منحة "التدريب إساءة من خلال النداء (DA007315).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro  System Biosciences CD510B-1 Cloning: for generating lentivirus
    12 x 75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube BD Biosciences 352063 FACS
    BD 40 um Falcon cell strainers BD Biosciences 352340 FACS
    0.05% Trypsin EDTA  Invitrogen 25200056 FACS
    96 Well Plate, flat bottom, clear  Corning  3596 FACS
    96 well cell culture plates  Corning  CLS3997 Flexstation
    Optilux black clear bottom  Corning  3603 Flexstation
    Flexstation pipet tips Molecular Devices 9000-0911 Flexstation
    Acetylcholine Chloride   Sigma-Aldrich A2661 Flexstation
    Norepinephrine   Sigma-Aldrich A7256 Flexstation
    Dopamine Hydrochloride   Sigma-Aldrich PHR1090 Flexstation
    GABA   Sigma-Aldrich A2129 Flexstation
    Histamine   Sigma-Aldrich H7125 Flexstation
    Glutamate   Sigma-Aldrich 49621 Flexstation
    Epinephrine   Sigma-Aldrich E4642 Flexstation
    Somatostatin    Sigma-Aldrich S1763 Flexstation
    5HT    Sigma-Aldrich H9523 Flexstation
    VIP  Alpha Diagnostics Inc.    SP-69627 Flexstation
    Orexin A Alpha Diagnostics Inc.    12-p-01 Flexstation
    Substance P   Sigma-Aldrich S6883 Flexstation
    Adenosine Sigma-Aldrich A4036 Flexstation
    Melatonin  Sigma-Aldrich M5250C Flexstation
    Fluorescence Plate Reader & software Molecular Devices Flexstation 3 Flexstation
     DMEM (high glucose) with Glutamax   Life Technologies 10569-010 Tissue culture
     Fetal bovine serum Life Technologies 10082-139 Tissue culture
     Pen/Strep  antibiotics Life Technologies 15140-122 Tissue culture
     Puromycin   InvivoGen ant-pr-1 Tissue culture
     Fibronectin  Sigma-Aldrich F0895 Tissue culture
    CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box Bioexpress D-3508) Tissue culture
    cyanoacrylate glue  Loctite Loctite no. 495 surgery and stereotaxic injection
    plastic paraffin film  VWR Parafilm® surgery and stereotaxic injection
    Nanoinjector Drummond 3-000-204 surgery and stereotaxic injection
    Glass electrodes Drummond 3-000-203G surgery and stereotaxic injection
    hand held drill OSADA Exl-M40 surgery and stereotaxic injection
    Burrs for drill Fine Scientific 19007-05; 19007-07) surgery and stereotaxic injection
    Sterilizing bath FST 18000-45, Hot Bead Sterilizer surgery and stereotaxic injection
    isoflurane chamber/mask Highland Medical Equipment 564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm surgery and stereotaxic injection
    3D scope with arm Zeiss surgery and stereotaxic injection
    fiber optic light surgery and stereotaxic injection
    Betadine  surgery and stereotaxic injection
    70 % (v/v) isopropyl alcohol surgery and stereotaxic injection
    Povidone-Iodine Prep Pads dynarex 1108 surgery and stereotaxic injection
    NaCl 0.9% (injection, USP, 918610) surgery and stereotaxic injection
    CYCLOSPORINE (INJECTION, USP) surgery and stereotaxic injection
    Buprenex (injection) buprenorphine (0.03 μg per g rodent) Sigma-Aldrich surgery and stereotaxic injection
    Ophthalmic ointment  Akorn NDC 17478-235-35 surgery and stereotaxic injection
    Surgifoam Ethicon surgery and stereotaxic injection
    Grip dental cement Dentsply #675571, 675572 surgery and stereotaxic injection
    Instant SuperGlue  NDindustries surgery and stereotaxic injection
    LOCTITE 4041 surgery and stereotaxic injection
    METABOND C&B surgery and stereotaxic injection
    no. 0 cover glass Fisher surgery and stereotaxic injection
    stereotaxic frame  Kopf surgery and stereotaxic injection
    Rectal probe and heating pad FHC 40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe surgery and stereotaxic injection
    optical breadboard for imaging Thorlabs surgery and stereotaxic injection
    Mineral oil Fisher S55667 surgery and stereotaxic injection
    Kwik-Cast (Silicone elastomer) World Precision Instruments surgery and stereotaxic injection
    Suture   Ethicon 18’’, 1667, 4-0 surgery and stereotaxic injection
    Scissors Fine Scientific Tools 91500-09, 15018-10 surgery and stereotaxic injection
    Forcepts Fine Scientific Tools 11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10 surgery and stereotaxic injection
    Student Halsted-Mosquito Hemostats Fine Scientific Tools 91308-12 surgery and stereotaxic injection
    Small Vessel Cauterizer Kit Fine Scientific Tools 18000-00 surgery and stereotaxic injection
    Hot Bead Sterilizers Fine Scientific Tools 18000-45 surgery and stereotaxic injection
    Instrument Case with Silicone Mat Fine Scientific Tools 20311-21 surgery and stereotaxic injection
    Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat Fine Scientific Tools 20810-01 surgery and stereotaxic injection
    2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging Olympus FV1200 MPE in vivo imaging
    Multiphoton laser SpectraPhysics Mai Tai DeepSee in vivo imaging
    Green Laser Olympus 473 nm Laser in vivo imaging
    xy translational base Scientifica MMBP in vivo imaging
    FRET filter cube for YFP and CFP Olympus in vivo imaging
    10x and 40x water immersion objectives Olympus in vivo imaging
    air table Newport in vivo imaging
    custom built light-tight cage Thorlab in vivo imaging

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems. Methods. 23, 21-39 (2001).
    2. Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo. Clin Chem. 49, 1763-1773 (2003).
    3. Liang, R., Broussard, G. J., Tian, L. Imaging Chemical Neurotransmission with Genetically Encoded Fluorescent Sensors. ACS Chem Neurosci. , (2015).
    4. Okubo, Y., et al. Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 6526-6531 (2010).
    5. Marvin, J. S., et al. An optimized fluorescent probe for visualizing glutamate neurotransmission. Nat Methods. 10, 162-170 (2013).
    6. Nguyen, Q. T., et al. An in vivo biosensor for neurotransmitter release and in situ receptor activity. Nat Neurosci. 13, 127-132 (2010).
    7. Muller, A., Joseph, V., Slesinger, P. A., Kleinfeld, D. Cell-based reporters reveal in vivo dynamics of dopamine and norepinephrine release in murine cortex. Nat Methods. 11, 1245-1252 (2014).
    8. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. , e3998 (2012).
    9. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. , (2009).
    10. Conklin, B. R., Farfel, Z., Lustig, K. D., Julius, D., Bourne, H. R. Substitution of three amino acids switches receptor specificity of Gqα to that of Gjα. Nature. 363, 274-276 (1993).
    11. Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat Protoc. 1, 3166-3173 (2006).
    12. Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J Vis Exp. , (2012).
    13. Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat Methods. 7, 981-984 (2010).
    14. Shih, A. Y., et al. Two-photon microscopy as a tool to study blood flow and neurovascular coupling in the rodent brain. J Cereb Blood Flow Metab. 32, 1277-1309 (2012).
    15. Yamauchi, J. G., et al. Characterizing ligand-gated ion channel receptors with genetically encoded Ca2+ sensors. PLoS One. 6, e16519 (2011).
    16. Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J. Neurosci. 32, 13819-13840 (2012).
    17. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2, 932-940 (2005).
    18. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
    19. Cui, G., et al. Concurrent activation of striatal direct and indirect pathways during action initiation. Nature. 494, 238-242 (2013).

    Tags

    علم الأعصاب، العدد 111، والتصوير الضوئي، FSCV، غسيل الكلى، وانتقال الصوت، العصبية، نيوروببتيد، TPLSM، جهاز الاستشعار البيولوجي، النوع من الاختزال
    بناء على أساس خلية العصبي نيون المهندسة مراسلون (CNiFERs) للكشف بصري من الناقلات العصبية<em&gt; في فيفو</em
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Lacin, E., Muller, A., Fernando, M., … More

    Lacin, E., Muller, A., Fernando, M., Kleinfeld, D., Slesinger, P. A. Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo. J. Vis. Exp. (111), e53290, doi:10.3791/53290 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter