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Neuroscience

का निर्माण सेल आधारित न्यूरोट्रांसमीटर के ऑप्टिकल पता लगाने के लिए स्नायुसंचारी फ्लोरोसेंट इंजीनियर रिपोर्टर (CNiFERs) doi: 10.3791/53290 Published: May 12, 2016

Summary

हम बड़ा न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज के ऑप्टिकल पता लगाने के लिए सेल आधारित न्यूरोट्रांसमीटर फ्लोरोसेंट इंजीनियर ने संवाददाताओं (CNiFERs) बनाने के लिए एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे।

Abstract

सेल आधारित न्यूरोट्रांसमीटर फ्लोरोसेंट इंजीनियर ने संवाददाताओं (CNiFERs) neuroscientists ऑप्टिकली विवो में मस्तिष्क में न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई का पता लगाने के लिए एक नए उपकरण प्रदान करते हैं। एक विशिष्ट CNiFER एक मानव भ्रूण गुर्दे सेल कि स्थिरतापूर्वक एक विशिष्ट जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर, जो जी क्यू के लिए जोड़ों / 11 ग्राम प्रोटीन, और एक झल्लाहट आधारित सीए 2 -detector, तमिलनाडु-XXL व्यक्त से बनाई गई है। रिसेप्टर के सक्रियण संकेत झल्लाहट में वृद्धि हो जाती है। CNiFERs एनएम संवेदनशीलता और सेकंड के एक अस्थायी प्रतिक्रिया क्योंकि एक CNiFER क्लोन मूल निवासी रिसेप्टर एक विशेष न्यूरोट्रांसमीटर के लिए, जैसे, D2R डोपामाइन के लिए इस्तेमाल किया है। CNiFERs सीधे मस्तिष्क में प्रत्यारोपित कर रहे हैं, कम से कम एक सौ मीटर की एक स्थानिक संकल्प के साथ न्यूरोट्रांसमीटर रिलीज भावना के लिए उन्हें सक्षम करने के लिए, उन्हें इन विवो में संचरण मात्रा को मापने के लिए आदर्श बना रही है। CNiFERs भी छठी में संभावित पार जेट के लिए अन्य दवाओं स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताVO। हमने हाल ही में GPCRs जी आई / ओ जी प्रोटीन के लिए है कि कुछ शामिल करने के लिए CNiFERs के परिवार का विस्तार किया। CNiFERs acetylcholine (आक), डोपामाइन (डीए) और norepinephrine (पूर्वोत्तर) का पता लगाने के लिए उपलब्ध हैं। यह देखते हुए कि किसी भी GPCR एक उपन्यास बनाने के लिए CNiFER इस्तेमाल किया जा सकता है और वहाँ लगभग मानव जीनोम में 800 GPCRs हैं कि, हम यहाँ सामान्य प्रक्रिया का वर्णन है, डिजाइन का एहसास है, और CNiFER के किसी भी प्रकार का परीक्षण करने के लिए।

Introduction

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पूरी तरह से समझने के लिए कैसे न्यूरॉन्स मस्तिष्क में संवाद, यह विवो में न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई को मापने के लिए एक विधि के लिए आवश्यक है। वहाँ विवो में न्यूरोट्रांसमीटर को मापने के लिए कई अच्छी तरह से स्थापित तकनीक है। एक सामान्य तकनीक का इस्तेमाल microdialysis, जिसमें एक प्रवेशनी मस्तिष्क में डाला जाता है और मस्तिष्कमेरु द्रव की एक छोटी मात्रा एकत्र की है और उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी और विद्युत का पता लगाने 1 का उपयोग कर विश्लेषण किया जाता है। MICRODIALYSIS जांच के कुछ ही व्यास के आदेश पर एक स्थानिक संकल्प किया है, जैसे, ~ एक 200 मीटर व्यास microprobe के लिए 0.5 मिमी। इस तकनीक का अस्थायी समाधान है, तथापि, अंतराल नमूना है कि आमतौर पर ~ पिछले 5 मिनट या उससे अधिक समय 1 के कारण धीमी है। इसके अलावा, विश्लेषण वास्तविक समय में नहीं बना रहे हैं। एक और तकनीक तेजी से स्कैनिंग चक्रीय voltammetry (FSCV), जो एक कार्बन फाइबर जांच है कि मस्तिष्क में डाला जाता है का उपयोग करता है। FSCV उत्कृष्ट अस्थायी हैमौखिक संकल्प (subsecond), उच्च संवेदनशीलता (nanomolar), और 30 माइक्रोन से 5 की जांच व्यास के साथ स्थानिक संकल्प। हालांकि, FSCV ट्रांसमीटरों कि एक कार्बन potentiometric जांच 2 पर एक विशेषता ऑक्सीकरण और वोल्टेज के साथ कमी प्रोफ़ाइल उत्पादन करने के लिए सीमित है।

न्यूरोट्रांसमीटर को मापने के लिए एक तीसरा तकनीक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग न्यूरोट्रांसमीटर (एनटी) biosensors 3 के माध्यम से सीधे है। इस विधि के साथ, एक संलयन प्रोटीन बनाई गई है एक ट्रांसमीटर एक प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) fluorophores 4 की आधारित जोड़ी या एक permutated GFP 5 के लिए युग्मित के लिए एक ligand बाध्यकारी डोमेन शामिल है। पिछले दो विधियों के विपरीत, इन biosensors आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग और ट्रांसजेनिक जानवरों के उत्पादन के माध्यम से या तीव्रता से वायरल एजेंटों के उपयोग कोशिकाओं को संक्रमित करने के साथ, इस तरह के एक न्यूरॉन के रूप में मेजबान कोशिका की सतह पर व्यक्त कर रहे हैं। तिथि करने के लिए, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग biosensors केवल detectin के लिए विकसित किया गया हैजी ग्लूटामेट और गाबा 3-5। इन तकनीकों के साथ सीमाओं एनएम रेंज में कम संवेदनशीलता, और ट्रांसमीटरों, जैसे, शास्त्रीय न्यूरोट्रांसमीटर, neuropeptides और neuromodulators, जो जी प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर्स (GPCRs) के माध्यम से संकेत का पता लगाने के लिए बड़ी संख्या में विस्तार करने के लिए असमर्थता किया गया है। वास्तव में, वहाँ मानव जीनोम में लगभग 800 GPCRs हैं।

इन खामियों को संबोधित करने के लिए, हम किसी भी न्यूरोट्रांसमीटर है जो एक GPCR के माध्यम से संकेतों के ऑप्टिकली उपाय के रिलीज के लिए एक अभिनव उपकरण विकसित किया है। CNiFERs (सेल आधारित न्यूरोट्रांसमीटर फ्लोरोसेंट इंजीनियर ने संवाददाताओं से), एक विशिष्ट GPCR कि, जब उत्तेजित, intracellular में वृद्धि [सीए 2 +] कि एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग झल्लाहट आधारित सीए 2 संवेदक द्वारा पता चला है चलाता है व्यक्त करने के लिए इंजीनियर प्रतिरूप HEK293 कोशिकाओं रहे हैं तमिलनाडु XXL। इस प्रकार, CNiFERs न्यूरोट्रांसमीटर रिसेप्टर, प्रतिदीप्ति में एक परिवर्तन में बाध्यकारी एक सीधा और वास्तविक समय ऑप्टिकल आर उपलब्ध कराने बदलनास्थानीय न्यूरोट्रांसमीटर गतिविधि के EAD-out। एक दिया न्यूरोट्रांसमीटर के लिए देशी रिसेप्टर का उपयोग करके, CNiFERs रासायनिक विशिष्टता, आत्मीयता और endogenously व्यक्त रिसेप्टर्स के अस्थायी गतिशीलता बरकरार रहती है। तिथि करने के लिए, हम CNiFERs के तीन प्रकार, डोपामाइन का पता लगाने के लिए एम 1 रिसेप्टर, एक का उपयोग कर acetylcholine का पता लगाने के लिए एक बनाया है डी 2 रिसेप्टर का उपयोग कर, और α1a रिसेप्टर 6.7 का उपयोग कर norepinephrine का पता लगाने के लिए एक। CNiFER प्रौद्योगिकी यह GPCR के किसी भी प्रकार के लिए उत्तरदायी बनाने, आसानी से विस्तार योग्य और स्केलेबल है। इस जौव लेख में, हम का वर्णन है और किसी भी आवेदन के लिए, डिजाइन का एहसास करने के लिए पद्धति, और इन विवो CNiFERs में परीक्षण दर्शाते हैं।

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Protocol

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इस अध्ययन में प्रदर्शन सभी पशु प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) के दिशा निर्देशों के अनुसार कर रहे हैं, और माउंट सिनाई मेडिसिन में Icahn स्कूल और यूनिवर्सिटी ऑफ कैलिफोर्निया, सैन डिएगो में IACUCs द्वारा अनुमोदित किया गया है।

1. HEK293 कोशिकाओं को बदलने के लिए GPCR व्यक्त Lentivirus उत्पन्न

  1. एक वाणिज्यिक स्रोत, जैसे, cdna.org से एक विशिष्ट GPCR के लिए सीडीएनए प्राप्त करते हैं। वैकल्पिक रूप से, पीसीआर का उपयोग कर एक सीडीएनए पुस्तकालय से GPCR जीन बढ़ाना। ऐसे pCDH-सीएमवी एमसीएस EF1-Puro (pCDH) के रूप में एक lentivirus व्यक्त वेक्टर, प्राप्त करते हैं। इस सदिश का उपयोग डीएनए प्रचार के साथ-साथ lentivirus उत्पन्न करने के लिए।
  2. पीसीआर द्वारा lentivirus व्यक्त वेक्टर में GPCR सीडीएनए क्लोन। पीसीआर subcloning पर जानकारी के लिए, लोरेन्ज 8 देखें।
  3. विस्तार और निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक endotoxin मुक्त 'मैक्सी' प्रस्तुत करने का किट का उपयोग कर GPCR-pCDH डीएनए शुद्ध। पुष्टि करें कि GPCR सीडीएनए subcloned में pCDH mutation- हैडीएनए अनुक्रमण द्वारा मुक्त।
    नोट: वायरस उत्पादन के लिए डीएनए प्रस्तुत करने से पहले, डालने और डीएनए की शुद्धता के आकार की पुष्टि करने के लिए उचित प्रतिबंध एंजाइम के साथ एक विभाज्य पचाने।
  4. एक वायरस कोर सुविधा, The सॉल्क संस्थान, पेन। विश्वविद्यालय, या उत्तरी कैरोलिना विश्वविद्यालय, आदि पर इस तरह के रूप में एक का उपयोग कर lentivirus पैदा करते हैं या घर में 9 उत्पन्न करते हैं। एक T75 फ्लास्क में HEK कोशिकाओं के अभिकर्मक के लिए endotoxin मुक्त डीएनए के लगभग 25 माइक्रोग्राम (> 1 माइक्रोग्राम / μl) का प्रयोग करें। सुनिश्चित करें कि डीएनए उच्च शुद्धता की है, 1.8 का ~ एक absorbance अनुपात (ए 260 / ए 280) कर रही है।
    नोट: वायरस के titers ~ 10 11 -10 12 जीसी / एमएल HEK293 कोशिकाओं के पारगमन के लिए उपयोगी हैं।

2. संवर्धन के लिए चुनना HEK293 / TN-XXL बैकबोन सेल प्रकार इन विट्रो में

नोट: जी प्रोटीन युग्मन विशिष्टता का निर्धारण करते हैं, उदाहरण के लिए, जी मैं / हे, जी क्यू / 11, या जी एस जी प्रोटीन, GPCR के रूप में इस डीआईसीTATES एक जी प्रोटीन कल्पना CNiFER के लिए आवश्यक है या नहीं। जी क्यू -coupled रिसेप्टर्स, जैसे, एम 1 मस्करीनिक रिसेप्टर के लिए, HEK293 / TN-XXL (# 3g8) रीढ़ HEK293 सेल प्रकार के रूप में चुनें। जी आई / ओ -coupled रिसेप्टर्स के लिए, chimeric जी प्रोटीन जी qi5 10 की जरूरत है। जी एस -coupled रिसेप्टर के लिए, जी qs5 कल्पना 10 की जरूरत है। इस प्रोटोकॉल में, एक D2R CNiFER के निर्माण के लिए एक उदाहरण के रूप में प्रयोग किया जाता है। जी आई / ओ जी प्रोटीन और के माध्यम से D2R संकेतों HEK293 कोशिकाओं है कि स्थिरतापूर्वक कैमेरिक ग्राम प्रोटीन, जी qi5, जैसे, HEK293 / TN-XXL / जी qi5 _ # qi5.6 व्यक्त करने की आवश्यकता है।

  1. एक शोध प्रयोगशाला से HEK293 / TN-XXL / जी qi5 _ # qi5.6 प्रतिरूप कोशिकाओं को प्राप्त। नोट: प्रतिरूप कोशिकाओं के बाद, HEK293 / TN-XXL (# 3g8) जी क्यू -coupled रिसेप्टर्स के लिए, HEK293 / TN-XXL / जी qi5 (# qi5.6) जी के लिए मैं / हे -coupled रिसेप्टर्स, और HEK293 / TN -XXL / जी qs5 (# qs5.47) जी एस -coupled पुनः के लिएceptors, अनुरोध 6.7 पर आसानी से उपलब्ध हैं।
  2. आगे बढ़ें और HEK293 विकास मीडिया (तालिका 1) के 5 मिलीलीटर के साथ एक T25 फ्लास्क में 90% confluency विस्तार HEK293 / TN-XXL / जी qi5 _ # qi5.6 करने के लिए ~। 5% (वी / वी) सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को विकसित।
    नोट: HEK293 संवर्धन कोशिकाओं के साथ सभी काम मानक बाँझ टिशू कल्चर तकनीक का उपयोग कर बाहर किया जाना चाहिए।
  3. पहले T25 कुप्पी से मीडिया aspirating द्वारा HEK293 कोशिकाओं फसल। धीरे पीबीएस के 5 मिलीलीटर जोड़ने और कुप्पी कमाल से कोशिकाओं को धो लें।
  4. पीबीएस निकालें और 0.05% (w / v) / trypsin EDTA (तालिका 2) के 1 मिलीलीटर जोड़ें। 5% (वी / वी) सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 से 2 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. कोशिकाओं को इकट्ठा और 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब बाँझ के लिए स्थानांतरण। एक सेल संस्कृति सेंट्रीफ्यूज में 1,000 XG पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  6. HEK293 विकास मीडिया के 5 मिलीलीटर में सेल गोली Resuspend। का उपयोग कर एक hemocytometer में कोशिकाओं की गणनाtrypan नीला। सेल घनत्व की गणना और चरण 3 पर आगे बढ़ें।

3. HEK293 की Lentiviral पारगमन / TN-XXL / Gqi5 प्रकोष्ठों

  1. 0.7 x 10 6 HEK293 / TN-XXL / जी qi5 कोशिकाओं के साथ एक T25 कुप्पी बीज। लगभग के बाद 1 दिन ~ जब तक 50% मिला हुआ 5% (वी / वी) सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को विकसित। शेष कोशिकाओं रुक (8.2-8.3 कदम)। इन कोशिकाओं को CNiFER नियंत्रण, यानी, एक CNiFER कि GPCR अभाव के रूप में काम करेगा।
  2. संक्रमण के दिन, HEK293 विकास मीडिया (तालिका 1) के 2 मिलीलीटर की कुल मात्रा में ~ 10 9 जीसी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए GPCR व्यक्त lentivirus (1.4 कदम) पतला। उदाहरण के लिए, एक T25 फ्लास्क में 2 मिलीलीटर मीडिया के लिए 10 से 11 जीसी / एमएल वायरस के 20 μl जोड़ें।
    नोट: वायरस अनुमापांक जानकारी वायरस कोर सुविधा द्वारा प्रदान की जानी चाहिए। एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में lentivirus और मीडिया का मिश्रण है और धीरे triturate। lentiv के उच्च titersirus जैव सुरक्षा स्तर 2 (बीएसएल -2) कर रहे हैं।
  3. T25 कुप्पी से मीडिया aspirate। 3.2 कदम से वायरस / मीडिया मिश्रण के 2 मिलीलीटर जोड़ें। 5% (वी / वी) सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर T25 कुप्पी हे / एन सेते हैं।
  4. संक्रमण के एक दिन बाद, वायरस / मीडिया मिश्रण aspirate और HEK293 विकास मीडिया युक्त puromycin के साथ बदलें (2 माइक्रोग्राम / एमएल, 1 टेबल)। Puromycin transduced कोशिकाओं के लिए चयन करता है। के बारे में 90% मिला हुआ है जब तक 5% (वी / वी) सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर फ्लास्क सेते हैं, के बाद ~ 1-2 दिनों के लिए।
  5. एक 96 अच्छी तरह से थाली (स्पष्ट नीचे के साथ काले), फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ लेपित 4.1 चरण में एक 10 सूत्री एगोनिस्ट / सक्रियण वक्र पैदा करने के लिए तैयार करें। एक बाँझ हुड में, पंक्तियाँ 96 अच्छी तरह से थाली के ए और बी में 50 μl फ़ाइब्रोनेक्टिन (5 माइक्रोग्राम / एमएल) के प्रति अच्छी तरह से जोड़ें। 1 घंटे के लिए कमरे में अस्थायी पर थाली सेते हैं। पीबीएस के साथ कुल्ला प्रति 5 मिनट के लिए दो बार कुल्ला। HEK293 विकास मीडिया के 50 μl जोड़ें और 5% (वी / वी) सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हे / एन।
    नोट: Fibronectin इलाज प्लेटों व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं।
  6. कदम 2.3-2.6 (तालिका 2) में वर्णित के रूप में T25 फ्लास्क में कोशिकाओं फसल।
  7. HEK293 विकास मीडिया के 5 मिलीलीटर में सेल गोली Resuspend। FACS विश्लेषण के लिए कोशिकाओं के 1.5 मिलीलीटर के साथ एक T25 कुप्पी बीज। इसके अलावा, ठंड और भंडारण के लिए कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर के साथ एक T75 कुप्पी बीज (चरण देखें 8.2-8.3)
  8. 10 सूत्री एगोनिस्ट वक्र के लिए, एक fibronectin लेपित 96 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से प्रति सेल निलंबन के 100 μl के साथ (3.5 कदम से) की पहली दो पंक्तियों (ए और बी) बीज।
  9. 5% (वी / वी) सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर के बारे में ~ 90% मिला हुआ है जब तक HEK293 कोशिकाओं एक T25 फ्लास्क, एक T75 फ्लास्क में बढ़ रही है और एक 96 अच्छी तरह से थाली सेते हैं, ~ 1-2 दिनों के बाद।

4. FACS और एकल CNiFER क्लोन का अलगाव

  1. एक 10 सूत्री एगोनिस्ट सक्रियण वक्र पैदा करने के लिए 96 अच्छी तरह से थाली का प्रयोग करें।
    नोट: प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) विश्लेषण शुरू करने से पहले, यह पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण हैएक agonist प्रतिक्रिया (10 सूत्री एगोनिस्ट वक्र) के लिए transduced कोशिकाओं के परीक्षण के द्वारा GPCR की अभिव्यक्ति। यह परीक्षण एक fluorometric प्लेट रीडर का उपयोग किया जाता है।
    1. 10 सूत्री एगोनिस्ट सक्रियण की अवस्था के लिए एक दवा की थाली तैयार करें। 10 विभिन्न एगोनिस्ट सांद्रता है कि चुनाव आयोग 50 भविष्यवाणी ब्रैकेट, जो साहित्य से निर्धारित किया जा सकता है चुनें।
      नोट: CNiFER थाली में 3 घोला: दवा प्लेट प्रत्येक एकाग्रता (दो प्रतियों में) का 3 गुना 1 के लिए समायोजित करने के लिए होता है। उदाहरण के लिए, एक डी 2 CNiFER के परीक्षण के लिए दवा की थाली 3 गुना मात्रा में डोपामाइन के 10 विभिन्न सांद्रता शामिल हैं, 0.2, 0.5, 1, 3, 5, 10, 20, 30, 50, और 1000 एनएम। CNiFER प्लेट में, इसलिए, डोपामाइन के अंतिम सांद्रता 0.067, 0.167, 0.333, 1.00, 1.67, 3.33, 6.67, 10.0, 16.7, और 333 एनएम हैं।
    2. कृत्रिम मस्तिष्क रीढ़ की हड्डी द्रव (ACSF) (तालिका 1) का उपयोग एगोनिस्ट समाधान तैयार करें। 'ACSF', जैसे, A1 और A2 के लिए दो कुओं का प्रयोग करें,और 'नहीं' कोशिकाओं, जैसे, बी 1 और बी 2 के लिए दो कुओं।
      ध्यान दें: एक धारावाहिक कमजोर पड़ने विधि का उपयोग दवाओं के विभिन्न सांद्रता तैयार करें। CNiFER क्लोन और दवा सांद्रता (चित्रा 3) का ट्रैक रखने के लिए एक टेम्पलेट बनाएँ।
    3. सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें झल्लाहट मापने और समाधान स्थानान्तरण के प्रदर्शन के लिए 96 अच्छी तरह से fluorometric प्लेट रीडर कार्यक्रम के लिए।
      1. 37 डिग्री सेल्सियस तक तापमान प्लेट पाठक सेट करें।
      2. तमिलनाडु XXL साथ झल्लाहट को मापने के लिए, 436 ± 4.5 एनएम (केंद्र ± HWHM) उत्तेजना तरंगदैर्ध्य निर्धारित किया है। eCFP के लिए और करने के लिए सिट्रीन के लिए 527 ± 7.5 एनएम के लिए 485 ± 7.5 एनएम उत्सर्जन फिल्टर सेट करें। eCFP और सिट्रीन के लिए 475 के लिए कटऑफ फिल्टर और 515 एनएम, क्रमशः सेट करें।
      3. प्लेट पाठक कार्यक्रम 485 एनएम और 527 एनएम 180 सेकंड की कुल के लिए हर 4 सेकंड में उत्सर्जन को मापने के लिए। CNiFER थाली में 100 μl करने के लिए 3 गुना दवा थाली से 50 μl वितरित करने के लिए विकल्प चुनें, 30 सेकंड मिलने के बादआधारभूत प्रतिदीप्ति।
    4. पंक्तियाँ ए और बी से मीडिया Aspirate और 96 अच्छी तरह से CNiFER थाली है कि ~ 90% मिला हुआ (कदम 3.9) के लिए ACSF के 100 μl जोड़ें।
    5. 96 अच्छी तरह से थाली और CNiFER प्लेट रीडर में '3 गुना' दवा प्लेट लोड। 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों संतुलित करने की अनुमति दें ~ 30 मिनट। फिर, कार्यक्रम शुरू करते हैं।
    6. प्लेट पाठक डेटा का विश्लेषण करने के लिए, एक स्प्रेडशीट के लिए प्रतिदीप्ति मूल्यों निर्यात। एक सूत्र CNiFERs साथ कुओं से पृष्ठभूमि माप (कोशिकाओं के बिना कुओं से प्रत्येक संकेत के लिए ले जाया) घटाना बनाएँ। प्रतिदीप्ति तीव्रता पूर्व प्रोत्साहन के लिए मानक के अनुसार आधार रेखा, एफ सिट्रीन (टी) / एफ सिट्रीन (आधारभूत), और झल्लाहट अनुपात (ΔR / आर। Eqn 1) की गणना 527 एनएम और 485 एनएम के उत्सर्जन में चोटी प्रतिक्रियाओं का उपयोग (11 कदम देखना )।
      नोट: यदि एगोनिस्ट साथ ΔR / आर में एक महत्वपूर्ण परिवर्तन है, तो इस GPCR की अभिव्यक्ति को इंगित करता है और एक FACS विश्लेषण (4.2 कदम) के लिए आगे बढ़ सकते हैं। यदिअरे एगोनिस्ट के साथ कोई झल्लाहट प्रतिक्रिया, एक सीए 2 ionophore, A21387 का उपयोग कर, जैसे, सीए 2 प्रतिक्रिया परीक्षण और पुष्टि करते हैं कि झल्लाहट आधारित सेंसर करने के लिए काम कर रहा है के द्वारा समस्याओं का निवारण है। ionophore काम करता है, तो रिसेप्टर की संभावना व्यक्त नहीं कर रहा था।
  2. FACS पहले दिन पर, फ़ाइब्रोनेक्टिन साथ लेपित चार 96 अच्छी तरह प्लेटें तैयार हल कोशिकाओं इकट्ठा करने के लिए (3.5 कदम देखें)। HEK293 विकास मीडिया के 50 μl जोड़ें और 5% (वी / वी) सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हे / एन।
  3. 5% तैयार (w / v) बीएसए पीबीएस में (5 ग्राम / 100 मिलीलीटर) और फिल्टर (0.2 माइक्रोन) एक बाँझ बोतल में।
  4. कोशिकाओं T25 कुप्पी में उगाया जाता है (देखें कदम 2.3-2.5, तालिका 2) हार्वेस्ट। 5% (w / v) पीबीएस में बीएसए के 4 मिलीलीटर में सेल गोली Resuspend। 5 मिनट के लिए 1,000 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
  5. मीडिया Aspirate और 5% की ~ 5 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend (w / v) पीबीएस में बीएसए ~ 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता देने के लिए।
    नोट: एफए के साथ की जाँचसेल घनत्व और छँटाई की स्थिति पर विशिष्ट आवश्यकताओं के लिए सीएस कोर सुविधा।
  6. गुच्छों को हटाने के लिए एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के साथ resuspended कोशिकाओं फ़िल्टर। एक 5 मिलीलीटर polypropylene नीचे ट्यूब दौर कोशिकाओं स्थानांतरण। FACS सुविधा के लिए परिवहन के लिए बर्फ पर ट्यूब रखें।
  7. एक FACS सुविधा पर transduced HEK293 कोशिकाओं के आधार पर क्रमबद्ध। कार्यक्रम एक FACS पर मापदंडों कोशिकामापी प्रकार के रूप में प्रवाह: नमूना धारक, 100 नोजल और 20 साई के लिए माइक्रोन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस की स्थापना की। पूर्व क्रमबद्ध विश्लेषण के आधार पर, कक्षों का चयन करें, यानी, एक 'गेट', एक बड़े eCFP प्रतिदीप्ति (eCFP उत्तेजना, eCFP उत्सर्जन) और बड़े झल्लाहट (eCFP उत्तेजना, सिट्रीन उत्सर्जन) प्रतिदीप्ति है (देखें नीचे परिणाम, चित्रा 2 चुनें )।
  8. जमा व्यक्ति, एक 96 अच्छी तरह से थाली में अच्छी तरह से puromycin साथ HEK293 विकास मीडिया के 50 μl युक्त प्रति, 4.2 कदम में तैयार एक क्लोन के साथ में हल कोशिकाओं। (टा puromycin साथ HEK293 विकास मीडिया के 50 μl जोड़ेble 1) अच्छी तरह से प्रति 100 μl की कुल के लिए। 5% (वी / वी) सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं हे / एन बनाए रखें।
    नोट: HEK293 विकास मीडिया transduced कोशिकाओं के चयन के लिए puromycin शामिल हैं।

5. संवर्धन और हल के विस्तार, क्लोनल CNiFERs

  1. अच्छी तरह से प्रत्येक से पुराने मीडिया के 50 μl को दूर करने और नए सिरे से HEK293 विकास मीडिया के 50 μl युक्त puromycin (तालिका 1) के साथ जगह से 96 अच्छी तरह प्लेटें में CNiFERs बनाए रखें। यह हर 5 से 7 दिनों तक ~ 90% मिला हुआ दोहराएँ, 2-3 हफ्तों के बाद।
  2. हार्वेस्ट CNiFER धीरे मीडिया aspirating और पीबीएस के साथ एक बार धीरे rinsing द्वारा कोशिकाओं। पीबीएस निकालें और 0.05% की 20 μl जोड़ने (डब्ल्यू / वी) / trypsin EDTA। 5% (वी / वी) सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 से 2 मिनट के लिए सेते हैं।
  3. trypsin इलाज कोशिकाओं को HEK293 विकास मीडिया के 100 μl जोड़ें और कोशिकाओं resuspend। एक 24 अच्छी तरह से थाली 400 μl ताजा HEK293 विकास मीडिया बुद्धि से युक्त करने के लिए स्थानांतरण सामग्रीज puromycin। 24 अच्छी तरह से थाली में, HEK293 विकास मीडिया के 250 μl की जगह हर 5-7 दिनों तक कुओं हैं ~ 90% मिला हुआ द्वारा कोशिकाओं को बनाए रखने।

6. fluorometric प्लेट रीडर का उपयोग उम्मीदवार CNiFERs झल्लाहट प्रतिक्रिया के आधार पर पहचानें

नोट: चार 96 अच्छी तरह प्लेटें निम्नलिखित FACS के साथ, वहाँ 100 परीक्षण योग्य क्लोन है कि जीवित है और 24 अच्छी तरह से थाली चरण का विस्तार किया जाना चाहिए>, क्योंकि मूल क्लोन के कई विकसित करने के लिए असफल। संभावित उम्मीदवार CNiFERs की पहचान करने के लिए, आत्मीय एगोनिस्ट, जैसे, D2R के लिए डोपामाइन के साथ झल्लाहट प्रतिक्रिया के लिए एक 3-बिंदु विश्लेषण का उपयोग करें।

  1. कोशिकाओं ~ 24 अच्छी तरह से थाली में 90% मिला हुआ हैं, धीरे मीडिया aspirate। 0.05% की ~ 100 μl जोड़ें (w / v) / trypsin EDTA और 5% (वी / वी) सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 मिनट के लिए सेते हैं। trypsin इलाज कोशिकाओं को HEK293 विकास मीडिया के 400 μl जोड़ें और कोमल विचूर्णन द्वारा कोशिकाओं मिश्रण।
  2. clo की प्रारंभिक जांच के लिए 3 सूत्री एगोनिस्ट वक्र सेट अपएनईएस। प्रत्येक CNiFER क्लोन, IE के लिए, तीन कुओं, जैसे, A1, A2, A3, के के प्रत्येक में सेल निलंबन के 100 μl (~ 4 x 10 3 कोशिकाओं / अच्छी तरह से) 24 अच्छी तरह से थाली, विभाज्य से कुओं में से एक एक fibronectin लेपित 96 अच्छी तरह से थाली (स्पष्ट नीचे के साथ काला) (3.5 कदम देखें)।
  3. एक 12 अच्छी तरह से थाली HEK293 विकास मीडिया के 1,000 μl (1.2 मिलीलीटर अंतिम मात्रा) से युक्त करने के लिए शेष ~ सेल निलंबन के 200 μl स्थानांतरण। 5% (वी / वी) सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर दोनों प्लेटों सेते हैं, जब तक ~ 90% मिला हुआ। 96 अच्छी तरह से थाली fluorometric परख के लिए है और 12 अच्छी तरह से थाली बढ़ रही है और क्लोन के विस्तार के लिए है।
  4. 3-बिंदु विश्लेषण के लिए, कि 0.1-, 1.0- हैं एगोनिस्ट के तीन अलग अलग सांद्रता, और विशिष्ट GPCR के लिए 10 बार चुनाव आयोग 50 निर्धारण करते हैं। कदम 4.1.1-4.1.2 में वर्णित के रूप में एक दवा की थाली में एगोनिस्ट सांद्रता तैयार करें। कदम 4.1.3-4.1.5 में वर्णित के रूप में एक fluorometric प्लेट पाठक परख प्रदर्शन।
  5. एफआर की गणनाईटी अनुपात (ΔR / आर) कदम 4.1.6 में वर्णित है। CNiFERs उचित संवेदनशीलता और विस्तार के लिए सबसे बड़ा झल्लाहट प्रतिक्रिया है कि, वापस ठंड चुनें, और अधिक व्यापक विश्लेषण (चरण 7)।
  6. क्लोन है कि कदम 6.5 में चयन किया गया था और 12 अच्छी तरह से थाली में बढ़ रहे हैं के लिए, हटाने और HEK293 विकास मीडिया हर 5 से 7 दिनों के 600 μl की जगह है, जब तक ~ 90% मिला हुआ।
  7. धीरे-धीरे 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए एक 12 अच्छी तरह से थाली से क्लोन का विस्तार, और फिर एक T25 फ्लास्क (कदम 2.3 - 2.6 और 2 टेबल)। जब T25 कुप्पी ~ 90% मिला हुआ, फसल कोशिकाओं के रूप में वर्णित है (2.3-2.5 कदम)। HEK293 विकास मीडिया के 5 मिलीलीटर में सेल गोली Resuspend।
  8. HEK293 विकास मीडिया के 9 मिलीलीटर के साथ एक T75 फ्लास्क सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर जोड़ें। तरल एन 2 (कदम 8.2-8.3) में cryoprotection और भंडारण के लिए सेल निलंबन के शेष 4 मिलीलीटर का प्रयोग करें। आठ 1.5 मिलीलीटर cryotubes को तैयार है और बर्फ पर जगह है।
  9. T75 फ्लास्क में, मीडिया डब्ल्यू जगह से कोशिकाओं को बनाए रखनेith ताजा HEK293 विकास मीडिया, जैसे, जब तक 70-80% मिला हुआ 10 मिलीलीटर हर 3-5 दिनों के बाद ~ 1-2 सप्ताह।

7. CNiFER क्लोन का अंतिम चयन fluorometric प्लेट रीडर का उपयोग

  1. प्लेट पाठक परख पहले दिन पर:
    1. एक ~ 90% मिला हुआ T75 कुप्पी से हार्वेस्ट कोशिकाओं (कदम 2.3-2.6 देखते हैं, तालिका 2)। अच्छी तरह से सेल निलंबन की ~ 100 μl के साथ 5 एक्स 10 4 / पर एक 96 अच्छी तरह fibronectin लेपित प्लेट (स्पष्ट नीचे के साथ काले रंग) बीज। ध्यान दें: एक क्लोन एक एकल 96 अच्छी तरह से थाली में वितरित किया जाता है।
  2. गैर विशिष्ट CNiFER प्रतिक्रियाओं से विशिष्ट एगोनिस्ट प्रतिक्रियाओं भेद CNiFER क्लोन की व्यापक जांच के लिए एक दवा की थाली तैयार।
    1. एक पूरी खुराक प्रतिक्रिया वक्र उत्पन्न करने के लिए, आसपास की भविष्यवाणी की चुनाव आयोग 50 10 विभिन्न एगोनिस्ट सांद्रता चुनें। 'कोई कोशिकाओं' और 'ACSF' के लिए दो कुओं के लिए दो कुओं का प्रयोग करें।
    2. गैर विशिष्ट प्रतिक्रियाओं का निर्धारण करने के लिए, thr चुनें12 विभिन्न न्यूरोट्रांसमीटर या modulators (72 कुओं) (चित्रा 3) के ईई सांद्रता। एगोनिस्ट की तरह, दवा प्लेट दो प्रतियों में 3 गुना सांद्रता शामिल हैं। उदाहरण के लिए, 50 के 3 गुना एकाग्रता, 1000 में acetylcholine, ग्लूटामेट, orexin, वीआईपी, एडेनोसाइन, सेरोटोनिन, norepinephrine गाबा, पदार्थ पी, मेलाटोनिन, सोमेटोस्टैटिन और हिस्टामिन, प्रत्येक के तीन अलग अलग सांद्रता के 100 μl, और 3000 एनएम 96 अच्छी तरह से थाली में दवा भरी हुई हैं।
  3. कदम 4.1.3-4.1.5 में वर्णित के रूप में झल्लाहट मापने और समाधान स्थानान्तरण के प्रदर्शन के लिए fluorometric प्लेट रीडर पर मानकों को निर्धारित करें।
  4. पूरी खुराक प्रतिक्रिया वक्र का विश्लेषण करने के लिए, शिखर झल्लाहट अनुपात (ΔR / आर) (कदम 4.1.6), लॉग एगोनिस्ट एकाग्रता के एक समारोह के रूप में साजिश की गणना और हिल समीकरण (कदम 11.4) के साथ फिट बैठते हैं। चुनाव आयोग 50, हिल गुणांक, और अधिक से अधिक झल्लाहट अनुपात निर्धारित करते हैं। 12 अन्य न्यूरोट्रांसमीटर / modulators, साजिश चोटी ΔR / आर ओ एक समारोह के रूप में लिएएफ दवा एकाग्रता।
  5. ~ 10 CNiFER क्लोन एक बड़ी झल्लाहट अनुपात, आत्मीय एगोनिस्ट के लिए एक उपयुक्त चुनाव आयोग 50, और अन्य न्यूरोट्रांसमीटर एगोनिस्ट (गैर विशिष्ट प्रतिक्रिया) के लिए कम या कोई पृष्ठभूमि प्रतिक्रिया है कि चुनें।

8. रुक वापस चयनित CNiFER क्लोन

  1. एक व्यक्ति CNiFER क्लोन के एक ~ 90% मिला हुआ T75 कुप्पी का प्रयोग करें। वर्णित के रूप में हार्वेस्ट कोशिकाओं (2.3-2.5 कदम, टेबल 2)। ठंड कोशिकाओं के लिए, HEK293 विकास मीडिया के 5 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend। दस 1.5 मिलीलीटर cryotubes लेबल और बर्फ पर निर्धारित किया है।
  2. 20% (वी / वी) HEK293 विकास मीडिया में DMSO, जैसे, 20% के 5 मिलीलीटर (वी / वी) DMSO / मीडिया मिश्रण धीरे सेल निलंबन के 5 मिलीलीटर (अंतिम के साथ मिलाया जाता है के साथ 1: cryoprotection के लिए, कोशिकाओं 1 मिश्रण DMSO की एकाग्रता 10%) है।
  3. अशेष 1 मिलीलीटर cryotubes में से प्रत्येक में। एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर हे / एन में कोशिकाओं के साथ ट्यूब रुक, एक फोम अछूता बॉक्स में (सामग्री देखें)। स्थानांतरण liqu को cryotubesलंबी अवधि के भंडारण के लिए आईडी नाइट्रोजन।

9. माउस कोर्टेक्स में CNiFER आरोपण

  1. सर्जरी से पहले एक आटोक्लेव में सभी सर्जिकल उपकरण जीवाणुरहित। 70% इथेनॉल के साथ पोंछते और एक साफ प्रयोगशाला डायपर नीचे बिछाने के द्वारा शल्य चिकित्सा के लिए एक अर्द्ध बाँझ क्षेत्र तैयार करें।
  2. एक खड़ी इलेक्ट्रोड खींचने पर एक गिलास केशिका (0.53 मिमी आईडी) खींच कर CNiFER इंजेक्शन pipet तैयार करें। कोई की एक जोड़ी का प्रयोग करें। 5 ठीक टिप संदंश 40 माइक्रोन का ~ एक व्यास के लिए इलेक्ट्रोड की नोक तोड़ने के लिए।
    नोट: यह सबसे अच्छा एक रेखाजाल के साथ एक स्टीरियो ज़ूम माइक्रोस्कोप के तहत पूरा किया है।
  3. रखरखाव के लिए 4% (वी / वी) शामिल करने के लिए और 1.5 से 2.0% (वी / वी): isoflurane के साथ एक वयस्क (प्रसव के बाद दिन 60-90) C57BL / 6 माउस anesthetize। सुनिश्चित करें कि माउस पूरी तरह से anesthetized है बनाने के लिए पूंछ या पैर की अंगुली चुटकी का प्रयोग करें।
    नोट: पुनः चुटकी समय समय पर और सर्जरी के दौरान गलमुच्छा हिल आकलन संज्ञाहरण की गहराई पुनर्मूल्यांकन करने।
  4. पी के लिए नेत्र मरहम के साथ आंखों को कवरrevent सुखाने। कान सलाखों के साथ एक stereotaxic फ्रेम में माउस माउंट। 37 डिग्री सेल्सियस पर माउस शरीर का तापमान एक गर्मी पैड एक गुदा जांच द्वारा विनियमित का उपयोग कर बनाए रखें।
  5. एक क्षेत्र दाढ़ी एक जानवर इलेक्ट्रिक शेवर के साथ 12 मिमी से लगभग 5 मिमी। लागू Betadine 70% (वी / वी) isopropanol द्वारा पीछा किया। एक छुरी ब्लेड का प्रयोग कटौती और खोपड़ी की सतह पर त्वचा को हटाने के लिए। खोपड़ी की सतह से periosteum दूर करने के लिए एक स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग करें। बेनकाब और के रूप में stereotaxic सर्जरी 11 के लिए वर्णित है, खोपड़ी की सतह को साफ।
  6. शीर्षस्थान और Antero पीछे (ए / पी) और Medio पार्श्व (एम / एल) दर्ज करने के लिए एक खाली गिलास pipet लोअर समन्वय करता है। माउस मस्तिष्क एटलस का जिक्र करते हुए इंजेक्शन साइट की स्थिति की गणना। लक्ष्य साइट को शिफ्ट pipet और बाद में खिड़की के गठन के लिए खोपड़ी के निशान। Cetin एट अल। मूषक 11 के साथ stereotaxic इंजेक्शन पर जानकारी के लिए देखें।
    नोट: इंजेक्शन और खिड़की की साइट reg पर निर्भरआयन का अध्ययन किया और कोर्टेक्स में न्यूरोट्रांसमीटर या पेप्टाइड को रिहा अनुमानों का वितरण किया जाना है। उदाहरण के लिए, हाल ही में एक प्रकाशन 7 में, stereotaxic निर्देशांक +1.0 2.0 मिमी ए / पी और +1.0 2.0 मिमी एम / एल शास्त्रीय कंडीशनिंग के दौरान डोपामाइन रिहाई के vivo इमेजिंग के लिए ललाट प्रांतस्था में CNiFER कोशिकाओं इंजेक्षन करने के लिए इस्तेमाल किया गया ।
  7. एक 2 मिमी x 3 मिमी पतला खोपड़ी खिड़की फार्म के रूप में पहले से 12,13 का वर्णन किया।
    नोट: खिड़की में हड्डी 15-20 माइक्रोन मोटी होना चाहिए। हड्डी में छोटे सफेद धब्बे दिखाई जब खोपड़ी की सतह, सिक्त है, तो हड्डी पर्याप्त 12,13 पतला है नहीं होना चाहिए।
  8. एक ACSF खिड़की पर भिगो स्पंज यह नम रखने के लिए इंजेक्षन करने के लिए कोशिकाओं की तैयारी कर रहा है, जबकि जगह है।
  9. CNiFER क्लोन है कि एक T75 फ्लास्क ~ 80% confluency में हो गया था हार्वेस्ट। मीडिया Aspirate और बाँझ पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    नोट: ट्रिप्सिन इन चरणों के लिए छोड़ दिया जाता है।
  10. पीबीएस निकालें और 10 मिलीलीटर का उपयोग ओएफ ACSF कुप्पी के नीचे से कोशिकाओं को बेदखल करने के लिए। Triturate कोशिकाओं सेल clumps अलग कर देना। अपकेंद्रित्र और ACSF के 100 μl में गोली resuspend। 1400 XG पर 30 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटाने, एक गोली ACSF में शामिल किया जा रहा। यह कदम निलंबन में कोशिकाओं का एक पेड़ों का झुरमुट छोड़ देता है।
  11. खनिज तेल के साथ कदम 9.2 में तैयार इंजेक्शन pipet backfill, एक nanoinjector पर pipet बोझ है, और सवार अग्रिम तेल की एक छोटी मनका बेदखल करने के लिए। माउस तैयारी के पास प्लास्टिक आयल फिल्म की एक पट्टी पर CNiFER सेल निलंबन के 5 μl रखो। या तो CNiFERs ड्रा या खींच लिया पिपेट में CNiFER कोशिकाओं को नियंत्रित।
  12. पिपेट, यानी, लक्ष्य एक्स के लिए ले जाएँ और वाई निर्देशांक ए / पी और एम / एल कदम 9.5 में उल्लेख किया। विंदुक कम, भेदी पतला खोपड़ी, और ~ खोपड़ी की सतह के नीचे 200-400 माइक्रोन, परतों कोर्टेक्स के 2/3 में CNiFER कोशिकाओं को जमा करने के लिए जारी है।
  13. nanoinjec साथ गहरी स्थल पर इंजेक्षन ~ CNiFER कोशिकाओं के 4.6 nlटो, तेल और सेल इंटरफ़ेस में टिप्पणी आंदोलन और उसके बाद कोशिकाओं को वितरित करने के लिए के लिए 5 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। पिपेट वापस लेने ~ 100 माइक्रोन और CNiFER कोशिकाओं का एक और ~ 4.6 nl इंजेक्षन, 5 मिनट इंतज़ार करो। फिर CNiFERs की backflow को रोकने के लिए और धीरे धीरे पिपेट वापस ले लें। एक या एक से अधिक आसन्न स्थलों पर इंजेक्शन दोहराएँ।
  14. दोहराएँ इंजेक्शन नियंत्रण HEK293 कोशिकाओं (यानी, HEK293 / TN-XXL / जी qi5 कमी क्लोन GPCR) के साथ 9.8-9.12 कदम। CNiFER अलग और ~ 200 माइक्रोन से सेल इंजेक्शन साइटों नियंत्रित करते हैं।
  15. सेल implantations पूरा करने के बाद, ACSF के साथ पतला खोपड़ी खिड़की कुल्ला और खोपड़ी को सुखाने के लिए के लिए प्रतीक्षा करें। (देखें सामग्री) cyanoacrylate गोंद की एक बूंद खिड़की पर लागू करें और जल्दी से गोंद के शीर्ष पर एक पूर्व में कटौती बाँझ कांच कवर जगह है। धीरे कुछ सेकंड के लिए खोपड़ी के खिलाफ कवर कांच धक्का। 2 मिनट 12,13 के लिए गोंद सूखी।
  16. दंत सीमेंट और फार्म ओ के साथ कवर कांच के किनारों को सीलखिड़की के आसपास पक्ष की सूई उद्देश्य के लिए पानी धारण करने के लिए।
  17. इमेजिंग के दौरान माउस के सिर immobilizing के लिए, खिड़की के पीछे cyanoacrylate गोंद की एक छोटी सी बूंद के साथ एक कस्टम निर्मित सिर-बार देते हैं (आयाम और सामग्री पर जानकारी के लिए 14 देखें)। गोंद अच्छी तरह से सूखे और फिर आगे कस्टम निर्मित सिर-बार सुदृढ़ करने के लिए अतिरिक्त दंत सीमेंट जोड़ दें।
  18. खोपड़ी की सतह के बाकी है, खिड़की के अलावा, दंत सीमेंट की एक परत के साथ कवर। यकीन है कि त्वचा के किनारों सीमेंट द्वारा कवर कर रहे हैं और इसे 20 मिनट के लिए सूखी।
  19. सर्जरी के बाद, isoflurane प्रशासन करो और एक पिंजरे में एक हीटिंग पैड पर माउस छोड़ने के लिए जब तक यह पूरी तरह से संज्ञाहरण से ठीक हो जाए। पोस्ट ऑपरेटिव analgesia के लिए पुनर्जलीकरण के लिए 5% (w / v) खारा (सुप्रीम कोर्ट) में ग्लूकोज और 0.05 0.1 मिलीग्राम / किलो buprenorphine (आईपी, तत्काल रिहाई) इंजेक्षन।
    नोट: मानव CNiFERs करने के लिए संभावित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को कम करने के लिए, 20 μl / 100 ग्राम Cyclo के साथ दैनिक माउस इंजेक्षनsporine (आईपी) CNiFERs के इंजेक्शन से पहले दिन की शुरुआत।
  20. भोजन और पानी के लिए अपने घर पिंजरे में माउस लौटें।

10 CNiFER क्लोन के vivo इमेजिंग में

नोट: लाइव इमेजिंग एक दो photon माइक्रोस्कोप और एक सिर निश्चित तंत्र का उपयोग करते हुए चूहों के साथ आयोजित किया जाता है। कोई संज्ञाहरण इमेजिंग सत्र के दौरान की जरूरत है। जाग राज्य में जानवरों जब इमेजिंग, एक समय में केवल कुछ ही घंटे के लिए सिर संयम की सीमा तनाव के स्तर को कम करने के लिए। भोजन और पानी के लिए इमेजिंग सत्र के बीच में घर पिंजरे यह करने के लिए पशु लौटें। संभावित तनाव एक बाड़े में कमरे में रोशनी काला और माउस के हिस्से के आसपास के द्वारा कम से कम है।

  1. सर्जरी के बाद दिन, धातु सिर-बार सिर निर्धारण फ्रेम करने के लिए खोपड़ी पर प्रत्यारोपित पंगा लेना द्वारा एक इमेजिंग मंच पर माउस माउंट।
    नोट: जाग चूहों जब इमेजिंग, इमेजिंग सत्र संभावित तनाव सिर संयम डिवाइस से प्रेरित होने के कारण कुछ ही घंटे से अधिक नहीं होनी चाहिए।
  2. सिर से रोका माउस के साथ इमेजिंग मंच एक दो photon इमेजिंग एक 10X (0.30 एनए) और 40x (0.80 एनए) पानी विसर्जन उद्देश्यों के साथ सुसज्जित खुर्दबीन में रखें।
  3. झल्लाहट इमेजिंग (eCFP और सिट्रीन) 505 एनएम और बैंड पास फिल्टर है कि 460 एनएम 500 एनएम को मापने के लिए eCFP एनएम सिट्रीन को मापने के लिए और 520 एनएम 560 अवधि में एक dichroic दर्पण है के लिए फिल्टर क्यूब डालें।
  4. अच्छी तरह से युक्त पतला खोपड़ी खिड़की करने के लिए ACSF जोड़ें और ACSF में पानी विसर्जन उद्देश्य कम है। खिड़की से नीचे छाल तथा वाहिका की सतह का पता लगाने में पारा दीपक और GFP फिल्टर घन के साथ संयोजन के रूप में आईपीस का प्रयोग करें।
    नोट: वाहिका की तर्ज इमेजिंग के दोहराया दिनों में ही क्षेत्र का पता लगाने और छवि में मदद करता है। 40X पानी विसर्जन उद्देश्य के लिए स्विच मैन्युअल GFP फिल्टर घन और एक पारा दीपक का उपयोग कोशिकाओं पर कोर्टेक्स की सतह पर ध्यान केंद्रित करके CNiFERs पता लगाने के लिए।
  5. दो photon इमेजिंग के लिए सेट करें। एपी का चयन करेंदो photon इमेजिंग के लिए propriate प्रकाश पथ। एक ठेठ व्यावसायिक प्रणाली के लिए, सॉफ्टवेयर का उपयोग दो photon इमेजिंग मोड के लिए स्विच और गैर descanned डिटेक्टरों में photomultiplier ट्यूब (PMTs) करने के लिए प्रकाश को दिशानिर्देश देने में। निकट अवरक्त femtosecond स्पंदित लेजर पर बारी, 820 एनएम के तरंग दैर्ध्य और 5-15% की एक शक्ति सेटिंग का चयन करें। ध्यान दें: 5% बिजली आम तौर पर नमूना ~ 25 मेगावाट है।
  6. PMT1 और PMT2 वोल्टेज अधिकतम मूल्य के करीब है, आम तौर पर 700-1,000 वी पीएमटी के आधार पर सेट करें। प्रत्येक चैनल के लिए 1 से लाभ निर्धारित और उद्देश्य के लिए Z स्थिति शून्य।
  7. उद्देश्य cortical सतह से 100 से 200 माइक्रोन लोअर ~ और XY स्कैन शुरू करते हैं। CNiFER प्रतिदीप्ति का संकेत करने वाली शोर अनुपात अनुकूलन करने के लिए लेजर शक्ति, लाभ, और प्रत्येक चैनल के लिए पीएमटी वोल्टेज, यानी, eCFP और सिट्रीन समायोजित करें।
  8. एक क्षेत्र के रूप में अच्छी तरह से CNiFER सेल शामिल है कि एक पृष्ठभूमि के रूप में करने के लिए छवि को प्रतिबंधित करने के लिए सॉफ्टवेयर में जूम की सुविधा का प्रयोग करेंडी क्षेत्र। एक स्कैन दर कोई पिक्सेल प्रति 4 μs में एक फ्रेम हर 2 सेकंड (0.5 हर्ट्ज) की तुलना में धीमी का प्रयोग करें। लाइन उपयुक्त संकेत करने वाली शोर अनुपात, जैसे, Kalman 2 लाइन औसतन लिए औसत समायोजित करें।
  9. एक क्षेत्र के हित (आरओआई) CNiFER कोशिकाओं के आसपास ड्रा, विमान प्रति के बारे में 3 से 4 कोशिकाओं के आसपास। रॉय औसत तीव्रता के वास्तविक समय विश्लेषण सेट करें। समय के साथ CNiFER प्रतिदीप्ति की निगरानी के लिए अधिग्रहण शुरू करो।
  10. पहले और प्रयोगात्मक जोड़तोड़, जैसे, बिजली की उत्तेजना, ChR2 उत्तेजना, व्यवहार, के रूप में उपयोगकर्ता द्वारा निर्धारित दौरान CNiFERs से प्रतिदीप्ति लीजिए।
  11. जब इमेजिंग प्रयोग पूरा हो गया है, अपने घर पिंजरे में माउस वापसी। दिन भर इमेजिंग दोहराएँ, के रूप में वांछित। जब फिर से इमेजिंग कोशिकाओं को एक ही इमेजिंग क्षेत्र (कदम 10.4) के लिए वापस उन्मुख करने के लिए पहले से अधिग्रहीत कम बढ़ाई वाहिका की छवि को देखें।
    नोट: प्रत्यारोपित CNiFERs कम से कम 7 दिनों के लिए imaged किया जा सकता है।

11. डेटा विश्लेषण

  • ओपन इमेजिंग फ़ाइल और CNiFERs के लिए रॉय और पृष्ठभूमि के लिए एक रॉय का चयन करें। प्रत्येक रॉय के दोनों चैनलों के लिए 'श्रृंखला विश्लेषण' का चयन करें। एक टैब-सीमांकित फाइल के रूप में प्रत्येक रॉय के लिए निर्यात औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता।
  • एक गणितीय सॉफ्टवेयर (सामग्री देखें) प्रोग्राम का उपयोग करें प्रतिदीप्ति मूल्यों का विश्लेषण करने के लिए। कम पास फिल्टर (0.3 हर्ट्ज) प्रत्येक संकेत और फिर eCFP और सिट्रीन प्रतिदीप्ति तीव्रता से प्रत्येक रॉय में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति घटाना।
  • आधारभूत लिए औसत प्रतिदीप्ति की गणना और 1 समीकरण के रूप में वर्णित झल्लाहट अनुपात ΔR (टी) / आर मापने के अनुपात की गणना।
  • CNiFERs की संवेदनशीलता का निर्धारण करने के लिए, लॉग एगोनिस्ट एकाग्रता के एक समारोह के रूप में झल्लाहट अनुपात साजिश है। हिल समीकरण चुनाव आयोग 50 और हिल गुणांक (एन) का निर्धारण करने के साथ फ़िट, वैज्ञानिक सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर और हिल समीकरण (2 समीकरण) का उपयोग।
  • Equation1

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    Representative Results

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    एक विशिष्ट जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (GPCR) और एक आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग [सीए 2 +] सेंसर, तमिलनाडु XXL: एक CNiFER एक मानव भ्रूण गुर्दे (HEK293) सेल कि स्थिरतापूर्वक कम से कम दो प्रोटीन व्यक्त करने के लिए इंजीनियर है से ली गई है। तमिलनाडु XXL सीए 2 आयनों 6,15 करने के लिए प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) सियान और पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन, eCFP और सिट्रीन, क्रमशः, के बीच जवाब में आए। GPCRs अंतर्जात जी क्यू जी प्रोटीन के लिए है कि इस जोड़ी के एक्टिवेशन साइटोसोलिक में वृद्धि [सीए 2 +] पीएलसी / आईपी 3 मार्ग के माध्यम से, (चित्रा 1) TNXXL सीए 2 डिटेक्टर से झल्लाहट में वृद्धि करने के लिए अग्रणी ट्रिगर।

    आकृति 1
    चित्रा 1:। विकास CNiFERs के लिए योजना शीर्ष, GPCR-सीए 2 संकेतन मार्ग एक बनाने के लिए आवश्यकCNiFER सेल। नीचे, HEK293 कोशिकाओं का उपयोग CNiFERs के निर्माण के लिए बुनियादी कदम। चरण आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग झल्लाहट आधारित सीए 2 -detector (TN-XXL) के साथ 1. transduce। चरण 2. transduce Gα जी प्रोटीन कल्पना, यानी, जी qs5, जी qi5, यदि आवश्यक है। CNiFER बनाने के लिए 3. transduce अद्वितीय GPCR कदम। दो photon उत्तेजना प्रकाश (लाल) उत्तेजित eCFP, जो झल्लाहट से होकर गुजरती है, दोनों एक eCFP उत्सर्जन (सियान) और सिट्रीन उत्सर्जन (पीला) का निर्माण किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    झल्लाहट में वृद्धि न्यूरोट्रांसमीटर के स्तर में परिवर्तन की एक तेजी से ऑप्टिकल पढ़ने के लिए बाहर है। न्यूरोट्रांसमीटर की एक विशेष प्रकार के लिए एक CNiFER को विकसित करने के लिए, पहली बार जी प्रोटीन के प्रकार का निर्धारण कि GPCR जोड़ों। के लिए जी क्यू -coupled GPCRs, GPCR जी क्यू प्रोटीन endogenously में व्यक्त करता हैHEK293 कोशिकाओं। जी के लिए मैं / ओ -coupled GPCRs, एक प्रतिरूप HEK293 लाइन पहले बनाई गई है कि एक chimeric जी प्रोटीन है कि जी क्यू -PLC / आईपी 3 मार्ग को GPCR पुनर्निर्देश व्यक्त करता है। यह एक chimeric ग्राम प्रोटीन, जी qi5, जो मुख्य रूप से Gα क्ष अनुक्रम और जी मैं के carboxyl टर्मिनस के पांच अमीनो एसिड होता है के साथ पूरा किया है। इन पांच अमीनो एसिड पर्याप्त जी qi5 जी आई / ओ -coupled GPCRs के साथ संवाद करने के लिए, लेकिन जी क्यू मार्ग के माध्यम से संकेत के लिए कर रहे हैं। जी एस -coupled GPCRs के लिए, एक जी qs5 कल्पना 10 प्रयोग किया जाता है। एक CNiFER के उत्पादन के लिए सामान्य रणनीति के लिए है: 1), एक प्रतिरूप HEK293 सेल कि स्थिरतापूर्वक एक ऑप्टिकल सीए 2 डिटेक्टर व्यक्त कर रहा है, यानी, तमिलनाडु XXL बनाने HEK कोशिकाओं का एक lentivirus पारगमन का उपयोग कर, 2) स्थिरतापूर्वक एक जी प्रोटीन कल्पना का इजहार यदि आवश्यक हो, HEK293 सेल क्लोन व्यक्त TN-XXL, और 3) HEK293 सेल में एक स्थिरतापूर्वक व्यक्त GPCR क्लोन बनाने मेंतमिलनाडु XXL और कैमेरिक जी प्रोटीन व्यक्त क्लोन। प्रतिरूप HEK293 लाइन है कि GPCR का अभाव है लेकिन तमिलनाडु XXL और कैमेरिक जी प्रोटीन के रूप में 'नियंत्रण CNiFER' कार्य करता है। नियंत्रण CNiFER पुष्टि करने के लिए कि CNiFER प्रतिक्रिया विशेष रूप से इंजीनियर रिसेप्टर्स, यानी, D2R, और अन्य रिसेप्टर्स endogenously HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त की सक्रियता के लिए नहीं के सक्रियण के कारण है की जरूरत है।

    Lentivirus उत्पन्न करने के लिए, एक lentivector अभिव्यक्ति प्रणाली का इस्तेमाल किया जाता है, जैसे, pCDH-सीएमवी एमसीएस EF1-Puro, जो पैकेजिंग, पारगमन, वायरल अभिव्यक्ति की स्थिर एकीकरण जीनोमिक डीएनए में निर्माण, और अभिव्यक्ति लक्ष्य के लिए जिम्मेदार आनुवांशिक तत्व शामिल जीन अनुक्रम। वायरल कणों, अभिव्यक्ति और पैकेजिंग वैक्टर के एक उच्च अनुमापांक उत्पादन करने के लिए क्षणिक निर्माता स्तनधारी कोशिकाओं में सह ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं और वायरस एकत्र किया जाता है। अमेरिका में कई वायरल कोर सुविधाओं है कि उच्च तिवारी उत्पन्न कर सकते हैं कर रहे हैं आतंकवाद lentivirus। HEK293 कोशिकाओं के संक्रमण के बाद, Puro जीन transduced HEK293 कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एंटीबायोटिक प्रतिरोध प्रदान करता है।

    आदेश विशिष्ट प्रतिरूप लाइनों की पहचान करने के लिए, transduced HEK293 कोशिकाओं एक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) प्रणाली का उपयोग क्रमबद्ध हैं। उद्देश्य के लिए एक क्लोन कि झल्लाहट आधारित सीए 2 डिटेक्टर के एक उच्च अभिव्यक्ति के स्तर पर और झल्लाहट के दौर से गुजर करने की क्षमता शामिल है को अलग-थलग करने के लिए है। FACS विश्लेषण के इस उदाहरण में, eCFP उत्सर्जन के प्रतिदीप्ति संकेत झल्लाहट (eCFP उत्तेजना और सिट्रीन उत्सर्जन) के खिलाफ साजिश रची है। बक्से क्षेत्रों (P2 और पी 3) है कि बाद में 96 अच्छी तरह से प्लेटों में (चित्रा 2) छंटाई के लिए चयन किया जाएगा ( "gated") निशान। आम तौर पर, के बारे में चार 96 अच्छी तरह प्लेटें CNiFERs के सफल निर्माण के लिए स्क्रीन करने के लिए पर्याप्त हैं। इन 4 प्लेटों से, लगभग 100 क्लोन fluorometric प्लेट पाठक विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं।

    e_content "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> चित्र 2
    चित्रा 2: FACS विश्लेषण का उदाहरण एक FACS विश्लेषण निम्नलिखित उत्पादन का एक नमूना।। ग्राफ भूखंडों eCFP उत्सर्जन ( "475/20-ए") सिट्रीन उत्सर्जन के एक समारोह के रूप में ( "झल्लाहट वी-530/30-ए"), प्रत्येक कक्ष के लिए eCFP उत्तेजना का उपयोग। क्षेत्र P2 और पी 3 शो क्षेत्रों का चयन किया है, यानी, gated, व्यक्ति की कोशिकाओं में छँटाई के लिए। रंग मनमानी कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    एक बार हल कोशिकाओं पर्याप्त घनत्व के हो गए हैं, झल्लाहट प्रतिक्रिया एगोनिस्ट सक्रियण के बाद एक 96 अच्छी तरह से थाली पाठक fluorometric समाधान से निपटने के साथ सुसज्जित प्रणाली का उपयोग करते हुए निर्धारित किया जाता है। अध्ययन करने के लिए क्लोन की संख्या नीचे संकीर्ण करने के लिए, एक "3 सूत्री" एगोनिस्ट वक्र स्क्रीन करने के लिए प्रयोग किया जाता है ~100 क्लोन और अच्छी प्रतिक्रियाओं के साथ चुनिंदा CNiFERs। लगभग 10 क्लोन तो कर रहे हैं आत्मीय एगोनिस्ट के साथ पूरा खुराक-प्रतिक्रिया का दृढ़ संकल्प के साथ आगे का विश्लेषण किया, और गैर विशिष्ट प्रतिक्रियाओं, 12 अन्य न्यूरोट्रांसमीटर या modulators के साथ जांच की। दवाओं के (जैसे, एगोनिस्ट, विरोधी, आदि) ACSF में: एक 96 अच्छी तरह से दवा प्लेट (प्लेट में 3 अंतिम एकाग्रता 1 पतला है) तीन गुना एकाग्रता के रूप में तैयार किया जाता है। इस उदाहरण में, एक दवा की थाली अपने आत्मीय एगोनिस्ट, डोपामाइन, और संभावित गैर विशिष्ट प्रतिक्रियाओं अन्य न्यूरोट्रांसमीटर और पेप्टाइड एगोनिस्ट की एक किस्म के साथ (चित्रा 3) के साथ एक डी 2 CNiFER के परीक्षण के लिए निर्धारित है। रीढ़ की हड्डी CNiFER, जो GPCR का अभाव है, नव निर्मित CNiFER के लिए एक महत्वपूर्ण नियंत्रण के रूप में कार्य करता है।

    चित्र तीन
    चित्रा 3:। 96 अच्छी तरह प्लेटें के लिए लेआउट के उदाहरण ऊपर, Layou की तालिका, Fluorometric प्लेट पाठक के लिए एक 3x दवा प्लेट लोड विभिन्न न्यूरोट्रांसमीटर और पेप्टाइड्स के तीन गुना सांद्रता का उपयोग करने के लिए T। नीचे, स्पष्ट प्लास्टिक की 96 अच्छी तरह से थाली और दवा CNiFERs बोने और प्लेट रीडर में मापने के लिए काले रंग की 96 अच्छी तरह से थाली के उदाहरण हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    GPCR की उत्तेजना TN-XXL द्वारा intracellular [सीए 2 +] और पता लगाने की ऊंचाई का एक परिणाम के रूप में, झल्लाहट प्रतिक्रिया में वृद्धि की उम्मीद है। इन शर्तों के तहत, झल्लाहट eCFP और सिट्रीन करीब चलती है, इसलिए eCFP की है कि उत्तेजना के एक छोटे eCFP उत्सर्जन और बड़ा सिट्रीन उत्सर्जन का उत्पादन द्वारा निर्मित है। इस उदाहरण में, उत्तेजना 436 एनएम और उत्सर्जन फिल्टर करने के लिए सेट है eCFP के लिए 485 ± 7.5 एनएम और सिट्रीन के लिए 527 ± 7.5 एनएम (चित्रा 4) स्थापित कर रहे हैं। बीए के तीस सेकंडseline प्रतिदीप्ति मापा जाता है और ACSF थाली में "तीन गुना" एगोनिस्ट से फिर 50 μl प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त 100 μl ACSF के लिए दिया जाता है (1: 3 के कमजोर पड़ने)। eCFP और सिट्रीन उत्सर्जन प्रतिदीप्ति 180 सेकंड के लिए हर 3.8 सेकंड मापा जाता है। पृष्ठभूमि माप कोशिकाओं के बिना कुओं से लिया है और, यदि आवश्यक हो तो घटाया जाता है। प्रतिदीप्ति तीव्रता सामान्यीकृत पूर्व प्रोत्साहन की पूर्ति कर रहे हैं (एफ (टी) / एफ (आधारभूत)), और चोटी की प्रतिक्रियाएं 527 की झल्लाहट अनुपात (ΔR / आर) एफ (टी) का उपयोग / एफ (आधारभूत) की गणना करने में मापा जाता है एनएम और 485 एनएम चैनल (1 समीकरण)। एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र तो अलग एगोनिस्ट सांद्रता के एक समारोह के रूप में झल्लाहट अनुपात की साजिश रचने और चुनाव आयोग 50 और हिल गुणांक (चित्रा 5) (2 समीकरण) का निर्धारण करने के लिए हिल समीकरण के साथ फिट द्वारा निर्माण किया है। एक इष्टतम CNiFER एक बड़ी झल्लाहट अनुपात और आत्मीय एगोनिस्ट के लिए एक उपयुक्त चुनाव आयोग 50 दर्शाती है, और अन्य neurotransmit के लिए कम या कोई पृष्ठभूमि प्रतिक्रियाएं दर्शातीआतंकवाद एगोनिस्ट। इसके विपरीत, नियंत्रण CNiFER आत्मीय एगोनिस्ट के लिए बहुत कम प्रतिक्रिया दिखाना चाहिए।

    चित्रा 4
    चित्रा 4:। Agonist प्रेरित झल्लाहट रिस्पांस D2R CNiFER झल्लाहट प्रतिक्रिया एक समाधान वितरण प्रणाली के साथ एक प्लेट रीडर पर मापा का उदाहरण है। (ए) झल्लाहट प्रतिक्रिया का एक भूखंड, यानी, eCFP और सिट्रीन उत्सर्जन के साथ eCFP उत्तेजना, डोपामाइन (लाल पट्टी) के आवेदन के दौरान डी 2 CNiFERs करने के लिए। ध्यान दें कि eCFP उत्सर्जन कम हो जाती है, जबकि एगोनिस्ट (डोपामाइन) के साथ सिट्रीन उत्सर्जन बढ़ जाती है। (बी) (ए) में मुलर एट अल। से संशोधित चित्रा प्रतिक्रिया के लिए झल्लाहट अनुपात (1 समीकरण) का एक भूखंड, 2014 7। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।


    चित्रा 5:। डी 2 CNiFER के लिए खुराक प्रतिक्रिया घटता के उदाहरण (ए) (डीए, काला) डोपामाइन के लिए डी 2 CNiFERs की प्रतिक्रिया के लिए और norepinephrine के लिए (पूर्वोत्तर, हरा) प्रतिक्रिया घटता खुराक। इसके अलावा, D2R कमी "नियंत्रण" CNiFERs की प्रतिक्रिया दिखाया गया है। (बी) के बार ग्राफ 50 एनएम और 1 माइक्रोन पर अन्य न्यूरोट्रांसमीटर और modulators के लिए झल्लाहट अनुपात प्रतिक्रिया से पता चलता। मूल्यों मतलब ± SEM हैं। मुलर एट अल।, 2014 7 से संशोधित चित्रा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    CNiFER क्लोन संभव रिसेप्टर पर निर्भर desensitization के लिए आगे और उनके अस्थायी समाधान के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है, प्रस्तुति भेदभावदो अलग अलग एगोनिस्ट दालों की (विवरण के लिए, वहाँ मुलर एट अल।, 2014 7)। एक CNiFER क्लोन का निर्माण करने के बाद अगले कदम के विवो में अपने कार्य का परीक्षण करने के लिए है। विवो में प्रतिदीप्ति पर नजर रखने के लिए, यह एक दो photon माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए आवश्यक है। एक पतला-खोपड़ी खिड़की तैयार करने के बाद, CNiFERs एक गिलास पिपेट में भरी हुई है और परतों के कोर्टेक्स के 2/3 में इंजेक्ट कर रहे हैं। माउस तो पतला खोपड़ी के लिए एक गिलास को कवर पर्ची संलग्न, और इमेजिंग के दौरान सिर फिक्सिंग के लिए एक सिर बार दाखिल (चित्रा 6) द्वारा vivo इमेजिंग के लिए तैयार किया जाता है।

    तय है कि प्रत्यारोपित CNiFERs विवो में व्यवहार्य हैं, एगोनिस्ट के ज्ञात सांद्रता आरोपण के स्थल के निकट इंजेक्शन जा सकता है और झल्लाहट अनुपात निर्धारित किया 7। आगे प्रत्यारोपित CNiFERs की गतिविधि को मान्य करने के लिए, इनपुट न्यूरॉन्स उत्तेजक जांच की जानी चाहिए। उदाहरण के लिए, डी 2 CNiFER, के प्रभाव के साथ के लिएमध्यमस्तिष्क डोपामाइन न्यूरॉन्स कि कोर्टेक्स के लिए इस परियोजना की बिजली की उत्तेजना जांच की गई थी। एक 0.1 MΩ टंगस्टन द्विध्रुवी 500 माइक्रोन के एक टिप जुदाई के साथ इलेक्ट्रोड उत्तेजक (-3.2 मिमी ए / पी, -1.3 मिमी एम / एल, -4.4 मिमी डी / वी)। चित्रा 6 द्रव्य नाइग्रा में प्रत्यारोपित किया गया था विद्युत का एक उदाहरण से पता चलता है विभिन्न तीव्रताओं पर द्रव्य नाइग्रा उत्तेजक और डी 2 CNiFERs 7 के लिए झल्लाहट अनुपात में वृद्धि देख। ध्यान दें कि प्रणालीगत अंतर peritoneal (आईपी) एक डी 2 रिसेप्टर प्रतिपक्षी, eticlopride (1 मिलीग्राम / किग्रा), ब्लॉक डी 2 CNiFER प्रतिक्रिया का इंजेक्शन। दूसरी ओर, कोकीन का इंजेक्शन (15 मिग्रा / किग्रा), जो डोपामाइन के ब्लॉक अवरोध, विद्युत पैदा डी 2 CNiFER प्रतिक्रिया 7 को बढ़ाता है।

    चित्रा 6
    चित्रा 6: डी 2 CNiFER प्रतिक्रिया मैं का उदाहरण ओंग> एन द्रव्य नाइग्रा की बिजली की उत्तेजना के बाद विवो। (ए) एक कार्टून एक सिर तय विवो दो photon इमेजिंग और बिजली की उत्तेजना के लिए तैयार माउस से पता चलता है। उत्तेजना के लिए दो photon प्रकाश (लाल, 820 एनएम) और eCFP (नीला) और सिट्रीन (हरा) के लिए 530 एनएम उत्सर्जन के लिए 475 एनएम उत्सर्जन। (बी) लाइन साजिश से पता चलता डी 2 CNiFER के लिए झल्लाहट अनुपात द्रव्य नाइग्रा की बिजली की उत्तेजना, निम्नलिखित कोर्टेक्स में इंजेक्शन यानी, 500 मिसे के लिए 50 हर्ट्ज, और कम से 50 से 300 μA के 200 μsec दालों एक D2R की उपस्थिति में बिजली की उत्तेजना के बाद प्रतिपक्षी (eticlopride) या कोकीन। मुलर एट अल।, 2014 7 से संशोधित चित्रा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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    तालिका 1: रसायन और अभिकर्मकों के HEK293 मध्यम विकास और ACSF बनाने के लिए सूची।

    सारणी 2
    तालिका 2: अलग अलग आकार संस्कृति प्लेट्स या बोतल से कटाई प्रकोष्ठों के लिए संस्करणों।

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    Discussion

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    CNiFERs के निर्माण के ऑप्टिकली विवो में मस्तिष्क में न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई को मापने के लिए एक अभिनव और अद्वितीय रणनीति प्रदान करता है। CNiFERs आदर्श extrasynaptic रिहाई, यानी, मात्रा चालन, न्यूरोट्रांसमीटर के लिए मापने के लिए अनुकूल हैं। महत्वपूर्ण बात है, प्रत्येक CNiFER, देशी GPCR के गुण के पास मस्तिष्क में न्यूरोट्रांसमीटर के स्तर में परिवर्तन का एक शारीरिक ऑप्टिकल माप प्रदान करते हैं। तिथि करने के लिए, CNiFERs acetylcholine का पता लगाने के लिए बनाया गया है (एम 1-CNiFER) 6, डोपामाइन (डी 2-CNiFER) 7 और norepinephrine (α1a-CNiFER) 7।

    प्रिंसिपल, एक CNiFER किसी भी न्यूरोट्रांसमीटर है जो एक GPCR के माध्यम से संकेतों के लिए बनाया जा सकता है। इस मामले में जहां जी क्यू जी प्रोटीन के माध्यम से GPCR का संकेत है, आगे कोई संशोधन HEK293 सेल करने के लिए आवश्यक है। GPCRs कि जी के माध्यम से संकेत मैं / हे, हालांकि, एक जी qi5 कैमेरिक जी प्रोटीन की आवश्यकता होती है Coexpressionजोड़े को जी क्यू / पीएलसी मार्ग 7,10 करने के लिए GPCR। इसी तरह, GPCRs कि जी एस के माध्यम से संकेत एक chimeric जी qs5 जी प्रोटीन 10 के Coexpression की आवश्यकता होगी। एक बार जब पूरा, प्रत्येक CNiFER क्लोन जांच की है और केवल उन CNiFER क्लोन एक समानता मूल निवासी रिसेप्टर के लिए तुलनीय है, कम या कोई desensitization प्रदर्शन और एक संकेत करने वाली शोर अनुपात है कि इन विवो दो photon माइक्रोस्कोपी के साथ मापने के लिए पर्याप्त है प्रदान करते हैं, इन विवो अध्ययन के लिए चुने गए हैं।

    इन विवो पढ़ाई के लिए, यह अत्यधिक Cyclosporine किसी भी संभावित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को कम करने के साथ चूहों के इलाज के लिए सिफारिश की है। वहाँ अस्वीकृति की संभावना या कृंतक मस्तिष्क में मानव कोशिकाओं CNiFER दाखिल साथ एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है। इस GFAP और mac1 7 की अभिव्यक्ति की जांच, CNiFER आरोपण के बाद से पहले से जांच की गई। CNiFERs glial निशान उत्पादन करने के लिए प्रकट नहीं किया था या किसी उल्लेखनीय उत्पन्नficant mac1 धुंधला हो जाना 7।

    दो प्रमुख मुद्दों CNiFERs के निर्माण में विचार करने के लिए संवेदनशीलता और desensitization हैं। अगर चुनाव आयोग 50 बहुत अधिक है, यानी, कम समानता, देशी रिसेप्टर के सापेक्ष है, तो CNiFER विवो में न्यूरोट्रांसमीटर की रिहाई का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता नहीं हो सकता है। एक समाधान क्लोन rescreen और एक अलग CNiFER क्लोन उच्च संबंध है कि चुनाव है। एक वैकल्पिक रणनीति आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट सीए 2 -detectors एक उच्च सीए 2 संवेदनशीलता हो सकता है, जो GPCR सक्रियण के लिए चुनाव आयोग 50 बदलाव कर सकते हैं और अन्य प्रकार के परीक्षण करने के लिए किया जाएगा। क्योंकि CNiFER डिजाइन मॉड्यूलर है, यह आसानी से ऐसे GCaMP 16 के रूप में आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग सीए 2 -detectors, के अन्य प्रकारों के लिए अनुकूल है। एक ही रिसेप्टर लेकिन अलग अलग चुनाव आयोग 50 एस के साथ CNiFER क्लोन अलग अंतर्जात Neu का पता लगाने के रिलीज के गतिशील रेंज का विस्तार के लिए फायदेमंद हो सकता हैविवो में rotransmitters।

    CNiFER की असंवेदीकरण भी विवो में इसके उपयोग को सीमित कर देगा। शिखर प्रतिक्रिया धीरे-धीरे एगोनिस्ट की एक नाड़ी के साथ कम हो जाती है, तो रिसेप्टर desensitizing जा सकता है। इस मामले में, अन्य क्लोन की जांच करने और निर्धारित करती है कि वे उसी तरह से प्रतिक्रिया। रिसेप्टर अमीनो एसिड अनुक्रम, या रिसेप्टर का एक और उप प्रकार के उपयोग के लिए संशोधन एगोनिस्ट निर्भर desensitization संबोधित करने के लिए आवश्यक हो सकता है। अगर वहाँ जाना जाता है फोस्फोराइलेशन या एमिनो एसिड की साइटों की पहचान की जी प्रोटीन रिसेप्टर kinases (GRKs) के साथ कि सहयोगी, यह एक या एक से अधिक साइटों परिवर्तनशील द्वारा GPCR के एक गैर desensitizing संस्करण के निर्माण के लिए उचित होगा। desensitization के तंत्र में एक मामला-दर-मामला आधार पर प्रत्येक रिसेप्टर के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए।

    इस प्रकार अब तक, CNiFERs केवल कोर्टेक्स 6.7 की ऊपरी परत में, दो photon मील के साथ इमेजिंग fluorophores के साथ सीमाओं स्पेक्ट्रोस्कोपी को प्रत्यारोपित किया गया है कारण17,18 croscopy। भविष्य में, यह प्रतिदीप्ति 19 के फाइबर आधारित माप के साथ CNiFER प्रौद्योगिकी अनुकूल करने के लिए इतना है कि CNiFERs subcortical मस्तिष्क क्षेत्रों में प्रत्यारोपित किया जा सकता संभव हो सकता है।

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    Disclosures

    लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

    Acknowledgments

    हम इलेक्ट्रॉनिक्स के साथ सहायता के लिए जी qi5 और जी qs5 cDNAs, ए Schweitzer प्रदान करने के लिए बी Conklin (कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सैन फ्रांसिस्को) धन्यवाद, एन टेलर क्लोन, इयान Glaaser और रॉबर्ट रिफ़्कीन सबूत पढ़ने के लिए की स्क्रीनिंग के साथ सहायता के लिए और तमिलनाडु XXL के लिए ओलिवर Griesbeck। (; DA037170 DA029706), बायोमेडिकल इमेजिंग और बायोइन्जिनियरिंग के राष्ट्रीय संस्थान (NIBIB) (EB003832), हॉफमैन-ला रॉश (88610A) और 'न्यूरोसाइंस इस काम नशीली दवाओं के सेवन पर अमेरिका के नेशनल इंस्टीट्यूट (NIDA) के माध्यम से अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया NIDA (DA007315) के माध्यम से दुर्व्यवहार "प्रशिक्षण अनुदान की दवाओं से संबंधित।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro  System Biosciences CD510B-1 Cloning: for generating lentivirus
    12 x 75 *BD Falcon High Clarity Polypropylene Round Bottom Test Tube BD Biosciences 352063 FACS
    BD 40 um Falcon cell strainers BD Biosciences 352340 FACS
    0.05% Trypsin EDTA  Invitrogen 25200056 FACS
    96 Well Plate, flat bottom, clear  Corning  3596 FACS
    96 well cell culture plates  Corning  CLS3997 Flexstation
    Optilux black clear bottom  Corning  3603 Flexstation
    Flexstation pipet tips Molecular Devices 9000-0911 Flexstation
    Acetylcholine Chloride   Sigma-Aldrich A2661 Flexstation
    Norepinephrine   Sigma-Aldrich A7256 Flexstation
    Dopamine Hydrochloride   Sigma-Aldrich PHR1090 Flexstation
    GABA   Sigma-Aldrich A2129 Flexstation
    Histamine   Sigma-Aldrich H7125 Flexstation
    Glutamate   Sigma-Aldrich 49621 Flexstation
    Epinephrine   Sigma-Aldrich E4642 Flexstation
    Somatostatin    Sigma-Aldrich S1763 Flexstation
    5HT    Sigma-Aldrich H9523 Flexstation
    VIP  Alpha Diagnostics Inc.    SP-69627 Flexstation
    Orexin A Alpha Diagnostics Inc.    12-p-01 Flexstation
    Substance P   Sigma-Aldrich S6883 Flexstation
    Adenosine Sigma-Aldrich A4036 Flexstation
    Melatonin  Sigma-Aldrich M5250C Flexstation
    Fluorescence Plate Reader & software Molecular Devices Flexstation 3 Flexstation
     DMEM (high glucose) with Glutamax   Life Technologies 10569-010 Tissue culture
     Fetal bovine serum Life Technologies 10082-139 Tissue culture
     Pen/Strep  antibiotics Life Technologies 15140-122 Tissue culture
     Puromycin   InvivoGen ant-pr-1 Tissue culture
     Fibronectin  Sigma-Aldrich F0895 Tissue culture
    CoolCell LX Alcohol-free controlled-rate cell freezing box Bioexpress D-3508) Tissue culture
    cyanoacrylate glue  Loctite Loctite no. 495 surgery and stereotaxic injection
    plastic paraffin film  VWR Parafilm® surgery and stereotaxic injection
    Nanoinjector Drummond 3-000-204 surgery and stereotaxic injection
    Glass electrodes Drummond 3-000-203G surgery and stereotaxic injection
    hand held drill OSADA Exl-M40 surgery and stereotaxic injection
    Burrs for drill Fine Scientific 19007-05; 19007-07) surgery and stereotaxic injection
    Sterilizing bath FST 18000-45, Hot Bead Sterilizer surgery and stereotaxic injection
    isoflurane chamber/mask Highland Medical Equipment 564-0427, HME 109 Table Top Anesthetic Machine with Isoflurane Vaporizer, O2 Flowmeter, Gang Valve; 564-0852, Induction Chamber 16X7X7.5cm surgery and stereotaxic injection
    3D scope with arm Zeiss surgery and stereotaxic injection
    fiber optic light surgery and stereotaxic injection
    Betadine  surgery and stereotaxic injection
    70 % (v/v) isopropyl alcohol surgery and stereotaxic injection
    Povidone-Iodine Prep Pads dynarex 1108 surgery and stereotaxic injection
    NaCl 0.9% (injection, USP, 918610) surgery and stereotaxic injection
    CYCLOSPORINE (INJECTION, USP) surgery and stereotaxic injection
    Buprenex (injection) buprenorphine (0.03 μg per g rodent) Sigma-Aldrich surgery and stereotaxic injection
    Ophthalmic ointment  Akorn NDC 17478-235-35 surgery and stereotaxic injection
    Surgifoam Ethicon surgery and stereotaxic injection
    Grip dental cement Dentsply #675571, 675572 surgery and stereotaxic injection
    Instant SuperGlue  NDindustries surgery and stereotaxic injection
    LOCTITE 4041 surgery and stereotaxic injection
    METABOND C&B surgery and stereotaxic injection
    no. 0 cover glass Fisher surgery and stereotaxic injection
    stereotaxic frame  Kopf surgery and stereotaxic injection
    Rectal probe and heating pad FHC 40-90-8D, DC Temperature Controller,40-90-2-06, 6.5X9.5cm Heating Pad40-90-5D-02, Rectal Thermistor Probe surgery and stereotaxic injection
    optical breadboard for imaging Thorlabs surgery and stereotaxic injection
    Mineral oil Fisher S55667 surgery and stereotaxic injection
    Kwik-Cast (Silicone elastomer) World Precision Instruments surgery and stereotaxic injection
    Suture   Ethicon 18’’, 1667, 4-0 surgery and stereotaxic injection
    Scissors Fine Scientific Tools 91500-09, 15018-10 surgery and stereotaxic injection
    Forcepts Fine Scientific Tools 11252-30; #55, 11295-51; Grafe, 11050-10 surgery and stereotaxic injection
    Student Halsted-Mosquito Hemostats Fine Scientific Tools 91308-12 surgery and stereotaxic injection
    Small Vessel Cauterizer Kit Fine Scientific Tools 18000-00 surgery and stereotaxic injection
    Hot Bead Sterilizers Fine Scientific Tools 18000-45 surgery and stereotaxic injection
    Instrument Case with Silicone Mat Fine Scientific Tools 20311-21 surgery and stereotaxic injection
    Plastic Sterilization Containers with Silicone Mat Fine Scientific Tools 20810-01 surgery and stereotaxic injection
    2P fixed-stage fluorescence scope for in vivo imaging Olympus FV1200 MPE in vivo imaging
    Multiphoton laser SpectraPhysics Mai Tai DeepSee in vivo imaging
    Green Laser Olympus 473 nm Laser in vivo imaging
    xy translational base Scientifica MMBP in vivo imaging
    FRET filter cube for YFP and CFP Olympus in vivo imaging
    10x and 40x water immersion objectives Olympus in vivo imaging
    air table Newport in vivo imaging
    custom built light-tight cage Thorlab in vivo imaging

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    References

    1. Day, J. C., Kornecook, T. J., Quirion, R. Application of in vivo. microdialysis to the study of cholinergic systems. Methods. 23, 21-39 (2001).
    2. Robinson, D. L., Venton, B. J., Heien, M. L., Wightman, R. M. Detecting subsecond dopamine release with fast-scan cyclic voltammetry in vivo. Clin Chem. 49, 1763-1773 (2003).
    3. Liang, R., Broussard, G. J., Tian, L. Imaging Chemical Neurotransmission with Genetically Encoded Fluorescent Sensors. ACS Chem Neurosci. (2015).
    4. Okubo, Y., et al. Imaging extrasynaptic glutamate dynamics in the brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 6526-6531 (2010).
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    Lacin, E., Muller, A., Fernando, M., Kleinfeld, D., Slesinger, P. A. Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo. J. Vis. Exp. (111), e53290, doi:10.3791/53290 (2016).More

    Lacin, E., Muller, A., Fernando, M., Kleinfeld, D., Slesinger, P. A. Construction of Cell-based Neurotransmitter Fluorescent Engineered Reporters (CNiFERs) for Optical Detection of Neurotransmitters In Vivo. J. Vis. Exp. (111), e53290, doi:10.3791/53290 (2016).

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