Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Kwantificering van Intra-peritoneale eierstokkanker Metastase

Published: July 18, 2016 doi: 10.3791/53316
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Epitheliale eierstokkanker (EOC) is de meest voorkomende doodsoorzaak van gynaecologische maligniteit, met een geschatte 21.290 nieuwe diagnoses in de VS in 2015 en naar schatting 14.180 doden 1. De overgrote meerderheid (> 75%) van de vrouwen gediagnosticeerd met late stadia van de ziekte (stadium III of IV) gekenmerkt door diffuse intraperitoneale metastase en slechte prognose. Terugkeer van de ziekte in de buikholte na eerstelijns chemotherapie is ook gebruikelijk en vormt een belangrijke oorzaak van sterfte 2,3. EOC uitzaaiing door een uniek mechanisme waarbij zowel rechtstreeks in het verlengde van de primaire tumor naburige peritoneale organen en door dissociatie of afstoten van cellen uit de primaire tumor oppervlak als enkele cellen of meercellige aggregaten. De cellen worden afgeworpen in de buikholte, waarin ze zich verzetten tegen-detachement geïnduceerde apoptose 4. Ophoping van peritoneale ascites komt vaak voor, zoals schuur tumorcellen blokkeren peritoneale lymfedrainage en tumors produceren groeifactoren die vasculaire permeabiliteit te wijzigen. Een gedeelte van loods tumorcellen hechten aan het oppervlak van peritoneale organen en structuren zoals darmen, lever, omentum en mesenterium, waarna ze verankeren en prolifereren meerdere wijd verspreide secundaire laesies 3,5 produceren. Hematogene metastase is ongewoon. Zo klinische behandeling bestaat gewoonlijk van cytoreductieve chirurgie met inbegrip van "optimale debulking", gedefinieerd als resectie van alle zichtbare tumor (hoe klein ook). Volledige cytoreductie gaat gepaard met een aanzienlijke toename van de totale overleving 6,7 en wordt geassocieerd met de uitdaging van identificatie en verwijdering van laesies <0,5 cm.

Kleine diermodellen hebben bewezen nut in eierstokkanker onderzoek in het verbeteren van ons begrip van de progressie van de ziekte en de identificatie van prognostische biomarkers en het testen van nieuwe chemotherapieën of combinatietherapie benaderingen. Als de primaireplaats van eierstokkanker incidentie en metastase is de peritoneale holte orthotopische modellen van EOC metastase omvatten de analyse en karakterisering van intraperitoneale ziekte. Hoewel recente verbeteringen in de mogelijkheid om beelden op tumorcellen hebben, zelfs op de enkele cel niveau, bestaan ​​er nog steeds grote moeilijkheden bij het kwantificeren van de metastatische tumorlast van EOC. Deze problemen resulteren uit het aantal, grootte en anatomische locatie van metastatische laesies. Verder bestaat er behoefte aan label kankercellen te onderscheiden van normale gastheercellen. Eerdere studies hebben antilichamen gebaseerde labeling protocollen of transfectie van tumorcellen met luciferase 8,9 gebruikt. Direct fluorescent labeling van kankercellen werd eerst beschreven door Chishima en medewerkers in 1997 10. Fluorescente labels geen toevoeging van exogeen substraat vragen en tevens uitstekende tumorcel specificiteit, een meer effectieve manier om kanker metastase 11,12 bijhouden

Hierin beschrijven we een optische imaging methode voor de kwantitatieve analyse van metastatische ziekte met behulp van een syngene orthotope xenograft model bestaat uit rood fluorescerend eiwit (RFP) gemerkte muizen ID8 eierstokkanker cellen 13 en immuno-competente C57 / Bl6 muizen. We tonen een nieuwe werkwijze van relatieve kwantificatie tumorlast combineren in vivo en ex vivo beeldvorming onder verwijdering van weefsel auto-fluorescentie. Deze aanpak heeft potentieel nut bij onderzoeken om het effect van specifieke genetische, epigenetische of micro-omgeving aan te passen en / of behandelingen op orgaanspecifieke metastase van eierstokkanker evalueren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle in vivo studies werden goedgekeurd door de Universiteit van Notre Dame Animal Care en gebruik Comite en gebruikte vrouwelijke C57 / BL6J muizen.

1. Muizen Ovarian Cancer Cell Culture

  1. Maak de ID8 muis eierstokkanker celcultuurmedium als volgt: 1 L Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 4% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline / streptomycine, 5 ug / ml insuline, 5 ug / ml transferrine en 5 ng / ml natriumseleniet.
  2. Transduceren ID8 muizen eierstokkanker cellen 13 tot Red Fluorescent Protein (RFP) met in de handel aangekocht lentivirale deeltjes uitdrukken RFP en een selectie marker (blasticidine-gen) uit te drukken. Merk op dat groen fluorescerend eiwit kan worden gebruikt, maar geeft een zwakker fluorescentiesignaal.
    1. Onmiddellijk voorafgaand aan transductie, kweekcellen tot 50-70% samenvloeiing en voeg vers medium (zonder penicilline / streptomycine) dat 1 ml polybreen (5 ug / ml uiteindelijke omvatconcentratie).
    2. Voorzichtig pipet RFP-lentivirus (20 gl) druppelsgewijs in de schaal en incubeer bij 37 ° C gedurende 72 uur. Verwijder medium en geïncubeerd met vers medium gedurende 24 uur. Begin selectie van getransduceerde cellen door toevoeging blasticidine aan het kweekmedium (5 ug / ml) en toezien op rode cellen met behulp van fluorescentie microscopie (Figuur 1).
  3. De cultuur-RFP hebben cellen in ID8 medium door enten ongeveer 10 6 cellen in een weefselkweekplaat en dagelijks visualiseren met behulp van een lichtmicroscoop totdat de cel monolaag confluent.
  4. Bij samenvloeiing, de oogst van de cellen met behulp van trypsine (0,25%, 3 min) en de terugkeer van de kolf met het 37 o C incubator totdat de cellen worden losgemaakt.
  5. Neutraliseren van de trypsine met 6 ml van ID8 kweekmedium dat serum. Pipet op en neer tegen de bodem van de schaal, vervolgens transfer naar een 15 ml conische buis. Centrifugeer bij 1200 tpm gedurende 2 min, daarna zuig het medium met een glass pipet.
  6. Was de cellen met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) door zachtjes resuspenderen in 6 ml warm PBS en centrifugeren zoals in 1.5 hierboven. Hersuspenderen in PBS tot een eindconcentratie van 5 x 10 6 cellen / ml. Houd cellen warm (37 ° C) tot injectie.

2. Intra-peritoneale injectie van ID8 cellen en in vivo beeldvorming

  1. Injecteer elke muis met 2 ml van de warme ID8 PBS-oplossing voor een totaal van 10 miljoen cellen door intraperitoneale (ip) injectie. Sta tumorcellen groeien in vivo gedurende ongeveer 10 weken met wekelijkse levende imaging.
  2. Onmiddellijk na de injectie en elke week daarna, wegen de muizen en vervolgens verdoven elke muis met behulp van isofluorane (2,5% debiet in 0,5 l / min O 2 flow). Opmerking: De muizen werden gewogen, niet als een kwantitatieve maat van tumorlast, maar een meer algemene maat voor individuele muizen fysieke progressie gedurende de studie. muizen wegents werden vergeleken met hun eigen eerdere gewichtswaarden.
    1. Verdoven muizen door het plaatsen van een isofluorane kamer. Zorg voor een constante verdoving tijdens het scannen door het positioneren van de muis hoofd in de neus-cone voor de blootstelling aan 2,5% debiet isofluorane tijdens de gehele procedure.
  3. Gebruik ontharingscrème om het haar op de romp en buik van elke muis verwijderd, als zwarte haren verzwakking van het fluorescentiesignaal veroorzaken. Muizen worden gebaad met warm water na het aanbrengen van de ontharingscrème en gedroogd met RT papieren handdoeken.
  4. Terwijl verdoofd, scant het hele lichaam van elke muis met behulp van een klein dier optische imaging-systeem. Hiermee worden alle muizen in een cohort op elk tijdstip. Gebruik de volgende twee stappen protocol (Figuur 2A):
    1. In stap 1, om fluorescent gelabelde (RFP) tumorcellen observeren uitvoeren multispectrale overname in totaal 5 afbeeldingen met excitatie filters van 440 nm, 460 nm, 4 verzamelen80 nm, 520 nm en 540 nm en een emissie van 600 nm filter. Gebruik de volgende acquisitie parameters: een standaard blootstelling van 15 sec, 2 x 2 binning, FOV van 160 mm en f stop van 1,1.
    2. In stap 2 om het hele dier te observeren, beeld reflectie verwerven met behulp van een open excitatie filter (wit licht), een open emissie-filter, een standaard belichting van 0,2 sec met 2 x 2 binning en een FOV van 16 cm. Opmerking: De werkelijke imaging tijd is ~ 1 min.

3. Mouse Dissection en Image Acquisition

  1. Bij live-imaging toont de aanwezigheid van uitgebreide intra-peritoneale ziekte of dieren vertonen ophoping van ascites (zoals blijkt uit een opgezette buik), verlies of winst van het lichaamsgewicht van meer dan 20%, lethargie of andere tekenen van nood, euthanaseren elke muis met behulp van CO 2 anesthesie gevolgd door cervicale dislocatie.
  2. Snijd de huid voren langs de ventrale middellijn van de muis en werd gerichte dissection schaar, vanaf de bovenkant van de dijen naar de onderkant van de ribbenkast. Wees uiterst voorzichtig te snijden door middel van alleen de huidlaag (figuur 2BI). Voorzichtig scheiden de huid van de peritoneale weefsel, en zorg ervoor dat de peritoneale muur niet doorboren.
  3. Via gerichte dissectie scharen, zijdelings snijden zowel langs de onderzijde van de ribbenkast en de bovenkant van de dijen twee flappen van de huid is (Figuur 2B ii, iii).
  4. Plaats elke muis op zijn buikzijde (buikholte naar beneden kijkend) met de huid flappen opengetrokken en scan elke muis met haar organen in situ met behulp van het kleine dier optische imaging-systeem (figuur 3A, B).
    1. Gebruik dezelfde beeldopname parameters zoals beschreven in 2.4.1.-2.4.2.
  5. Verder ontleden van de muis door extractie individuele peritoneale organen zoals lever, omentum / pancreas, maag, middenrif, dunne darm, dikke darm, links en rechts peritoneum, eierstokken, kidneys, mesenterium en vet pad.
    1. Observeren, opsommen, en zichtbare tumoren opnemen op elk orgaan. Gebruik een dikte tot de diameter van elke tumor te meten.
    2. Wijzen tumoren kleiner dan 2 mm in diameter kleine, tussen 2 en 5 mm als medium en groter dan 5 mm zo groot.
  6. Plaats de organen op het orgel scanning matrijs (figuur 4) die een vooraf bepaalde locatie identificeert voor elk orgaan. Met PBS om de organen vochtig.
  7. Scan elk vel organen met de kleine dieren optisch afbeeldingsstelsel (Figuur 3C, D).
    1. Gebruik dezelfde beeldopname parameters zoals beschreven in stap 2.4.
  8. Na het scannen plaats organen in 10% formaldehyde tot verdere verwerking mogelijk te maken voor histologie.

4. Kwantificering van tumorlast in the Fluorescentie Images

  1. Om de hoeveelheid auto-fluorescentie in elke multispectrale scan verminderen, eerste unmix de bestanden met software met de kleine dieren afbeeldingssysteem.
    1. Laad eerst de RFP: In Vivo spectrale bestand, gevolgd door de Autofluor: In Vivo Red bestand in het venster Unmixed Afbeeldingen en selecteer Unmix.
  2. Exporteer de .bip bestanden als 16 bit .tiff (ongeschaald) formaat.
  3. Gebruik ImageJ software (ex vivo organen en daarna het volle muis lichaam met organen in situ).
    1. Gebruik Bestand> Openen om de 16 bit TIFF-bestanden van het orgel scannen template-bestanden te openen in ImageJ.
    2. Onder Afbeelding> Aanpassen> Helderheid / Contrast, ervoor kiezen om de minimum weergegeven waarde op 0 en de maximale weergegeven waarde voor 35.353 en vervolgens onderAfbeelding> Lookup Tables, selecteert Red Hot. Opmerking: Diverse diermodellen hebben verschillende helderheidsniveaus nodig, maar het is belangrijk om de helderheid consistent in een bepaalde studie houden.
    3. Met het gereedschap Selectie uit vrije hand, trek je een free-form regio van belang selectie (ROI) rond elk orgaan en het gebruik van het gereedschap Meetlat (CTRL + M) aan de oppervlakte van elk orgaan te berekenen; opnemen Het oppervlak van elk orgaan in een spreadsheet.
    4. Met de getekende rond elk orgaan ROI, klik met de rechtermuisknop binnen de ROI en selecteer Duplicate om alleen het orgel bevatten.
    5. Terwijl u naar het individu orgel, onder Afbeelding> Aanpassen> Drempel, ervoor kiezen om de drempel van het beeld op een lagere drempelwaarde van + 1200 en een Upper Threshold niveau van + 1700 ONL te selectereny de meest fel fluorescerende regio's en controleer donkere achtergrond te selecteren; selecteer OK. Opmerking: De afbeeldingen kunnen handmatige manipulatie van de drempel schuifknoppen in ImageJ vereisen zodat de eerder helderste gebieden worden geselecteerd voor de analysestap, zoals hierboven getoond. Verschillende ziektemodellen hebben verschillende beperkingen drempel vereist, maar het is belangrijk om de drempelniveaus consistent in een bepaalde studie houden.
    6. Onder Analyze> Analyseer Deeltjes, verander de grootte (pixels ^ 2) tot 10-Infinity, ervoor kiezen om Show: Contouren, controleer dan alleen "Resultaten weergeven" te selecteren en klik op OK om zowel het gebied en ruwe geïntegreerd dichtheden van deze heldere gebieden te meten, geacht tumoren.
    7. Noteer de waarden van de oppervlakte en het Raw geïntegreerde Dichtheid van elke tumor selectie weergegeven in de
    8. Onder Analyze> Extra> Calibration Bar, voeg een kalibratie schaal bar om de beelden van de organen. Opmerking: In dit voorbeeld, werd dit gedaan door het veranderen van de locatie naar de rechterbovenhoek, de Fill kleur naar zwart, de Label Kleur White, het aantal labels tot en met 5, de decimalen op 0, de lettergrootte tot 12 en de Zoom factor tot 4,0 en het mogelijk maken Bold tekst.
    9. Onder Bestand> Opslaan als ..., sparen de montage als een .tiff en .Jpeg.
    10. Gebruik Bestand> Openen om het JPEG-bestand van de organen en vervolgens onder Invoegen> Text Box te openen
    11. Gebruik Bestand> Openen om elk van de 16 bit TIFF-bestanden van de full body scans in ImageJ openen om van de muis nummer.
    12. Onder Afbeelding> Aanpassen> Helderheid / Contrast, ervoor kiezen om het minimumpakket weergegeven waarde op 0 en de maximale weergegeven waarde naar + 35.353 en vervolgens onder Afbeelding> Lookup Tables, selecteert Red Hot.
    13. Onder Bestand> Opslaan als ..., sparen de montage als een. Tiff en .Jpeg.

5. Data Analysis

  1. Voeg de tumor selectiegebieden en ruwe dichtheden geïntegreerd, respectievelijk voor elk orgaan van elke muis en de totale orgel tumor oppervlak per muis opnemen.
  2. Normaliseren van de opgenomen gebied en ruwe integrated dichtheidswaarden voor de grootte van elk orgaan door het totale tumor stippellijn totale ruwe geïntegreerde dichtheidswaarden te delen door het overeenkomstige orgaan oppervlak (tabel 1).
  3. Bereken en plot de gemiddelde van het genormaliseerde tumor oppervlakken en de genormaliseerde ruwe geïntegreerde densiteitswaarden (Figuur 5A, B).
  4. Vergelijk deze gemiddelde waarden die worden verkregen door visueel tellen van de tumoren die tijdens de inspectie van elk orgaan voor metastatische laesies zichtbaar waren voor het blote oog.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Het mechanisme van metastatische ovariumkanker gekenmerkt door zeer diffuse intraperitoneale metastase uit talrijke lesies van verschillende grootte, waaronder meerdere kleine (<2 mm) laesies. Aldus gebruik van RFP gelabelde tumorcellen (figuur 1) en optische beeldvorming verschaft een alternatieve methode voor handmatige telling en meting van verwondingsgrootte. De ontwikkeling van tumor belasting in de tijd kan worden bepaald door wekelijkse weging van muizen en meting van abdominale omtrek voor mogelijke aanwezigheid van ascites meten. In vivo optische beeldvorming verschaft als aanvulling op tumorlast (figuur 2) te beoordelen. Eierstokkanker metastasizes om meerdere sites in de buikholte en moleculaire bestuurders van site-specific metastase zijn momenteel onbekend. In aanvulling op de bepaling van de totale tumorlast, kan volgende offer zorgvuldige dissectie worden uitgevoerd om te evalueren en te kwantificeren site-specific patterns op uitzaaiingen. Aldus kan de optische beeldvorming van peritoneale organen in situ (figuur 3A, B) in combinatie met ex vivo bepaling van individuele organen (Figuur 3C, D) nuttige gegevens over het totale vs orgaanspecifieke tumorlast verschaffen. De scans in figuur 3 geven de resultaten van het scannen van de buikholte en de individuele organen van muizen met verschillende mate van tumorlast. Bijvoorbeeld, Figuur 3C toont de tumorlast in het omentum / pancreas, eierstokken en mesenterium van muis A. In vergelijking met diezelfde organen muis B, een significant verschil in signaal wordt waargenomen (Figuur 3D). Het gebruik van het orgel scanning template (Figuur 4) helpt bij de identificatie van orgaanspecifieke tumorlast. De waarneming van differentiële tumorlast kwantitatief wordt bevestigd zowel qua oppervlakte tumor en tumor signaalintensiteit (tabel 1, figuur 5).

Figuur 2 en 3 illustreren de grote waaier van tumorlast die kunnen worden afgebeeld en gekwantificeerd met deze methode. De gegevens in tabel 1 illustreert deze lange reeks toepasbaarheid kwantificeren zowel tumoroppervlak stippellijn signaalintensiteit van de tumor. Bijvoorbeeld, als we kijken naar de omentum / pancreas van muis Een vergelijking met die van muis B de genormaliseerde tumor oppervlakte is 26 maal groter dan A Mouse Muis B. Bovendien, het grote aantal signaalintensiteit wordt ook geïllustreerd in het omentum / pancreas van muizen A en B; het genormaliseerde ruwe dichtheid van geïntegreerde muis A is 56 maal groter dan die van muis B. Deze resultaten tonen de geldigheid van vergelij-ng de tumorlast van een aantal proefpersonen opzichte van elkaar, zowel tumor specifiek oppervlak en tumor signaalintensiteit, met deze snelle werkwijze die geen verdere histologische analyse vereist.

Figuur 1
Figuur Express RFP. (A) Fase image 1. ID8 Murine eierstokkanker cellen van ID8 cellen. (B) Fluorescentie beeld van ID8 cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. Levende optische beeldvorming van C56 / Bl6 muis met Intra-peritoneale Tumor Burden. (A) Ontharings crème werd gebruikt om hai verwijderen r van het ventrale oppervlak van de muis vóór het scannen. (B) Schematische weergave van de initiële ventrale middellijn en laterale incisies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3AC
Figuur 3BD
Figuur 3. Eindpunt scannen van intraperitoneale tumorlast. (A, B) Muizen worden eerst afgebeeld met organen in situ (ventrale zijde naar beneden) na opening van het ventrale oppervlak van de muis. (C, D) beeldvorming van individuele organen. Elk orgaan wordt ontleed, opgenomen visuele tumorlast, en op het orgel scanning template voor analyse.target = "_ blank"> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4. Organ Template scannen. Ontleed organen worden op het orgel scannen template geplaatst om positionele identificatie van individuele organen tijdens het scannen te handhaven.

figuur 5
.. Figuur 5. De genormaliseerde kwantitatieve gegevens voor de Omentum / pancreas, eierstokken en Mesenterium Gegevens werden geanalyseerd zoals beschreven in protocol en zoals getoond in tabel 1 Muis A aan de muis afgetast paneel 3A; muis B verwijst naar de muis afgetast paneel 3B. (A) Genormaliseerde tumorgebied. Fluorescentiesignaal kwantificatieanalyse van deze drie organen werd uitgevoerd en gekwantificeerd in termen van een verhoudingtumor oppervlak tot gehele orgaan oppervlak voor beide muizen. (B) De genormaliseerde ruwe geïntegreerde dichtheid. Fluorescentiesignaal kwantificatieanalyse van deze drie organen werd uitgevoerd en gekwantificeerd in termen van een verhouding van ruwe geïntegreerde dichtheid gehele orgaan oppervlak voor beide muizen.

Omentum / pancreas
Genormaliseerde Tumor Area De genormaliseerde Raw Integrated Dichtheid
Een muis 0,5346 5.11E + 07
muis B 0,0203 8.97E + 05
eierstokken
Genormaliseerde Tumor Area De genormaliseerde Raw Integrated Dichtheid
Een muis 4.79E + 07
muis B 0,0123
mesenterium
Genormaliseerde Tumor Area De genormaliseerde Raw Integrated Dichtheid
Een muis 0,2951 2.22E + 07
muis B 0,0098 4.15E + 05

Tabel 1. De genormaliseerde Tumor Ruimte en genormaliseerde RawGeïntegreerde dichtheidswaarden in het Omentum / pancreas, eierstokken en Mesenterium van zowel muis A en B. Voeg muis dissectie en scannen, werd elk orgaan gesegmenteerd en de fluorescentie gekwantificeerd het percentage tumor vlak voor totale orgaanoppervlak stippellijn de intensiteit van het bepalen fluorescentie voor deze tumor gebieden. De omentum / pancreas, eierstokken en mesenterium werden geselecteerd omdat ze hadden de sterkste fluorescentie signalen in zowel de positieve als negatieve controlegroepen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In tegenstelling tot onderzoek met humaan ovarium kankercellen die in immuungecompromitteerde muizen moeten worden uitgevoerd, de hierboven beschreven protocol gebruikt immuuncompetente C57 / Bl6 muizen en syngene muizen eierstokkankercellen. Hoewel dit maakt evaluatie van de mogelijke rol van immune infiltraten bij tumorprogressie en metastase, de aanwezigheid van donker haar op het buikoppervlak maakt beeldvorming minder gevoelig. Toepassing van een ontharingscrème om haar voorafgaand aan beeldvorming versterkt beeldverwerving verwijderen, maar is tijdrovend, met name voor experimenten die longitudinale beeldvorming. Haarloze 'naakt' muizen kunnen worden gebruikt in dit protocol en vereisen geen ontharingscrème-gebaseerde ontharing. Bovendien naakt muizen missen een functionerend immuunsysteem, zodat ook kan worden gebruikt om de groei van humaan ovarium kankercellen experimenten bepalen waarbij de bijdrage van het immuunsysteem is niet geanalyseerde.

Ook moet worden opgemerkt dat de diepte van intraperitoneal tumoren presenteert ook technische uitdagingen, optische fluorescentie beeldvorming in het algemeen geen tumoren op een diepte van meer dan 5 mm te detecteren. Bovendien is de prevalentie van ascitesvloeistof en de aanwezigheid van ascites tumorcellen extra complicaties. We hebben aanzienlijke muis tot muis variabiliteit waargenomen bij de vorming van ascitesvloeistof, zelfs bij injectie met dezelfde cellijn. Dus in de aanwezigheid van ascites, deze werkwijze de voorkeur dat eindpunt analyse van orgaanspecifieke tumorlast dan routinematige longitudinale beeldvorming van progressie. In het huidige geval dramatische veranderingen in tumorlast opgemerkt tussen het voorbeeld muizen, zodat cohorten van 4-5 muizen meestal voldoende voor statistische analyse zijn. Bij minder dramatische verschillen in tumorlast zullen bijkomende proefpersonen nodig om statistisch bereiken. Hoewel de hier getoonde voorbeelden verschillen aanzienlijk in tumorvolume, kunnen optische fluorescentie beeldvorming worden gebruiktdetecteren veel kleinere verschillen in orgaanspecifieke tumorlast, vooral ten opzichte van gewichts- of dikte-metingen op kleine laesies (niet getoond) .Resolution en gevoeligheid verschilt naargelang cellijn en beeldvormingssysteem. In het onderhavige geval kan metastatische implantaten zo klein als 400 urn in diameter worden opgelost en gekwantificeerd. Alternatieve methoden waaronder contrastversterking computertomografie (CT), magnetische resonantie (MR) beeldvorming en positron emissie tomografie (PET) zijn beschreven voor longitudinale beeldvorming 14,15. Modaliteiten waaronder gecombineerde anatomische en functionele beeldvorming zijn ook in ontwikkeling 16.

Met betrekking tot de voorgestelde werkwijze voor kwantificering van tumorlast, zij opgemerkt dat de bepaling van de fluorescentie drempels [Stap 4.3.5.] Is gebaseerd op de intensiteit van de fluorescentie waargenomen in het orgaan afbeeldingen [Stap 4.3.2.] en wordt gekozen door de gebruiker alleen de fluorescentiegebieden relat omvattenive de rest van het orgaan. Uiteenlopende drempelwaarden werden gebruikt in de analyse alvorens de definitieve drempelwaarden gebruikt in deze studie. Eenmaal vastgesteld, werden deze zelfde drempels voor elk orgaan geanalyseerd om zo te zorgen voor samenhang in de kwantificering van wat metastatische weefsel wordt geacht door de eerste visuele analyse gedaan door de onderzoeker. De bepaling van deze drempels is een kritische stap in de procedure en zou kunnen variëren van de ene naar het andere project zoals bepaald door de onderzoeker. In dit geval werd een grote lagere drempel gebruikt zodat alleen de hoogste intensiteit fluorescentie-signalen vast te leggen. Via dezelfde drempel voor elk orgaan analyse, de analyse en resultaten bieden vergelijkende kwantitatieve resultaten binnen het kader van deze groep muizen. Hoewel deze methode wordt beperkt kwantificering van absolute waarden van tumor oppervlak, laat onderzoekers het vermogen te vergelijken relatieve genormaliseerde tumorlast onder dezelfde eennd verschillende organen in cohorten van muizen. Er zij op gewezen dat deze benadering omvat kwantificatie van tumoren die niet zichtbaar zijn voor het blote oog.

Het unieke metastatische mechanisme van de EOC resultaten in op grote schaal verspreid intraperitoneale carcinomatosa waarbij meerdere weefsels en organen, waardoor een optimale cytoreductieve operatie technisch uitdagend. Zo volledig cytoreductie positief correleert met de totale overleving, blijkt dat de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën ter bestrijding intraperitoneale metastase gerechtvaardigd. Evaluatie van therapeutische werking, echter afhankelijk van nauwkeurige kwantificering van tumorlast, inclusief evaluatie van orgaanspecifieke metastase. Optische beeldvorming van RFP hebben tumorcellen in situ gecorrigeerd voor orgel autofluorescentie, gecombineerd met een zorgvuldige orgaan ex vivo beeldvorming, hebben we een aanpak voor intraperitoneale orgaanspecifieke tumorlast kwantificeren ontwikkeld. Interessant onze analyses blijktdie voorkeursplaatsen van metastase in dit model, zoals omschreven in tumorlast / oppervlak, vergelijkbaar met die gevonden bij vrouwen met eierstokkanker (omentum, eierstok, darm, mesenterium) 2,4,5. Daarom moet deze aanpak de toekomst nut bij de evaluatie van de experimentele therapieën ontworpen om te richten op metastatische ziekte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dit artikel is onderdeel van een themanummer over Multimodal Preklinische Imaging, gesponsord door Bruker BioSpin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium Corning 10-014-CM
Fetal bovine serum Gibco 10437-028
penicillin/streptomycin
Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement Sigma I-1884
Bruker Xtreme small animal imaging system Bruker Corp.
Bruker Multispectral software Bruker Corp
lentiviral particles with Red fluorescent protein GenTarget, Inc. LVP023
trypsin for cell culture Corning 25-053-CI
PBS Corning 21-040-CM
depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion) purchases from drugstore  n/a
ImageJ software  http://imagej.nih.gov/ij/  free download
dissecting tools (forceps) Roboz Surgical Instrument  RS 5130
dissecting tools (Scissors) Roboz Surgical Instrument RS 5910

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. American Cancer Society. Available from: http://www.cancer.org/cancer/ovariancancer/overviewguide/ovarian-cancer-overview-key-statistics (2015).
  2. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177, (3), 1053-1064 (2010).
  3. Halkia, E., Spiliotis, J., Sugarbaker, P. Diagnosis and management of peritoneal metastases from ovarian cancer. Gastroenterology Research and Practice. 2012, 541842-541854 (2012).
  4. Barbolina, M. V., et al. Microenvironmental regulation of ovarian cancer metastasis. Cancer Treatment and Research. 149, 319-334 (2009).
  5. Lengyel, E., et al. Epithelial ovarian cancer experimental models. Oncogene. 33, (28), 3619-3633 (2014).
  6. Harter, P., duBois, A. The role of surgery in ovarian cancer with special emphasis on cytoreductive surgery for recurrence. Current Opinion in Oncology. 17, (5), 505-514 (2005).
  7. Bristow, R. E., Puri, I., Chi, D. S. Cytoreductive surgery for recurrent ovarian cancer: a meta-analysis. Gynecologic Oncology. 112, (1), 265-274 (2009).
  8. Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death and Differentiation. 9, 786-789 (2002).
  9. Sweeney, T. J., et al. Visualizing the kinetics of tumor-cell clearance in living animals. Proceedings of the National Academy of Science USA. 96, 12044-12049 (1999).
  10. Chishima, T., et al. Cancer invasion and micrometastasis visualized in live tissue by green fluorescent protein expression. Cancer Research. 57, 2042-2047 (1997).
  11. Bouvet, M., et al. Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model. Cancer Research. 62, 1534-1540 (2002).
  12. Hoffman, R. M. The Multiples Uses of Fluorescent Proteins to Visualize Cancer in vivo. Nature Reviews. 5, 796-806 (2005).
  13. Roby, K. F., et al. Development of a syngeneic mouse model for events related to ovarian cancer. Carcinogenesis. 21, (4), 585-591 (2000).
  14. Rampurwala, M., Ravoori, M. K., Wei, W., Johnson, V. E., Vikram, R., Kundra, V. Visualization and quantification of intraperitoneal tumors by in vivo computed tomography using negative contrast enhancement strategy in a mouse model of ovarian cancer. Translational Oncology. 2, (2), 96-106 (2009).
  15. Kim, T. J., et al. Antitumor and antivascular effects of AVE8062 in ovarian carcinoma. Cancer Research. 67, 9337-9345 (2007).
  16. Picchio, M., et al. Advanced ovarian carcinoma: usefulness of [(18)F]FDG-PET in combination with CT for lesion detection after primary treatment. Quarterly Journal of Nuclear Medicine. 47, 77-84 (2003).
Kwantificering van Intra-peritoneale eierstokkanker Metastase
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lewellen, K. A., Metzinger, M. N., Liu, Y., Stack, M. S. Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis. J. Vis. Exp. (113), e53316, doi:10.3791/53316 (2016).More

Lewellen, K. A., Metzinger, M. N., Liu, Y., Stack, M. S. Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis. J. Vis. Exp. (113), e53316, doi:10.3791/53316 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter