Introduction
Epitelyal over kanseri (EOC) 2015 yılında ABD'de tahminen 21.290 yeni tanı ve tahminen 14.180 ölüm 1 ile jinekolojik malignite gelen ölümlerin en sık nedenidir. Kadınların büyük çoğunluğu (>% 75) geç evre hastalığı tanısı (evre III veya IV) yaygın-içi periton metastazı ve kötü prognoz ile karakterizedir. Birinci basamak kemoterapi sonrası periton boşluğuna Hastalık nüks da yaygındır ve mortalite 2,3 önemli bir nedenini oluşturmaktadır. EOC doğrudan komşu periton organların birincil tümörden hem de ayrışma ile uzantı veya tek hücre ya da çok hücreli agregatlar halinde primer tümör yüzeyinden hücre dökülmesi her ikisinin de dahil benzersiz bir mekanizma ile metastaz. Onlar dekolmanı kaynaklı apoptoz 4 direnmek burada Hücreler, periton boşluğuna dökülür. döken tümör hücreleri periton lenfatik drenajı ve t blok olarak periton asit birikimi, yaygınumors vasküler geçirgenliğini değiştirerek büyüme faktörlerini üretir. Onlar çapa ve birden çok yaygın ikincil lezyonlar 3,5 üretmek için çoğalırlar bunun üzerine döken tümör hücrelerinin bir kısmı, bağırsak, karaciğer, omentum ve mezenter dahil periton organ ve yapıların yüzeyine tutunur. Hematojen metastaz nadirdir. Böylece, klinik yönetimi yaygın (kadar küçük olursa olsun) tüm görünür tümör rezeksiyonu olarak tanımlanan "Optimal bir sitoredüksiyon sonrası" olmak üzere sitoredüktif cerrahi oluşur. Komple sitoredüksiyon genel sağkalım 6,7 belirgin bir artış ile ilişkilidir ve tanımlanması ve lezyonların çıkarılması <0.5 cm meydan okuma ile ilişkilidir.
Küçük hayvan modelleri prognostik biyolojik ve yeni kemoterapi veya kombine tedavi yaklaşımları test belirlenmesi yanı hastalığın ilerlemesi anlayışımızı geliştirmeye yumurtalık kanseri araştırmalarında yarar kanıtlanmıştır. birincil olarakyumurtalık kanseri insidansı ve metastaz yeri periton boşluğu, EOC metastaz ortotopik modelleri intraperitoneal hastalığın analizi ve karakterizasyonu dahil olduğunu. Görüntü tümör hücrelerine yeteneği son gelişmeler olmasına rağmen, hatta tek hücre düzeyinde, hala EOC metastatik tümör yükü miktarının önemli zorlukları da bulunmaktadır. Bu sorunlar nedeniyle sayısı, büyüklüğü ve metastatik lezyonların anatomik konuma ortaya çıkar. Ayrıca, normal konakçı hücrelerden ayırmak için etiket kanser hücreleri için bir ihtiyaç söz konusudur. Daha önceki çalışmalar, antikor bazlı etiketleme protokolleri ya da lusiferaz 8,9 tümör hücrelerinin transfeksiyonu kullanmışlardır. Kanser hücrelerinin direkt floresan etiketleme ilk olarak 1997 yılında 10 Chishima ve arkadaşları tarafından rapor edilmiştir. Floresan etiketleri kanser metastazı 11,12 izlemek için eksojen substratın ilave edilmesini gerektirebilir ve zarif tümör hücre özgüllük sağlamak, daha etkin bir araç temin yok
Bu yazıda fare ID8 yumurtalık kanseri hücreleri 13 ve bağışıklık yetkili C57 / BL6 farelerinde kırmızı floresan proteini (RFP) oluşan bir singeneik ortotopik ksenograft modeli kullanılarak metastatik hastalık kantitatif analizi için bir optik görüntüleme yöntemi etiketli açıklanmaktadır. Göreceli tümör yükü ölçümü için yeni bir yöntem, doku otomatik floresans kaldırılması ile in vivo ve ex vivo görüntüleme birleştirerek göstermektedir. Bu yaklaşım yumurtalık kanseri organa özgü metastaz belirli genetik, epigenetik veya mikro-çevre değişiklik ve / veya tedavi yöntemlerinin etkisini değerlendirmek için tasarlanmış çalışmalarda potansiyel yarar vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bütün in vitro çalışmalar, Notre Dame Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanan ve dişi C57 / BL6J fareler kullanıldı.
1. Fare Yumurtalık Kanseri Hücre Kültürü
- şöyle ID8 murin yumurtalık kanseri hücre kültürü kullanım sağlar:% 4 fetal sığır serumu (FBS),% 1 Penisilin / Streptomisin, 5 ug / ml insülin, 5 mg / ml transferrin ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1 L ve 5 ng / mL sodyum selenit.
- RFP ve bir seçim işaretleyici (geni blasticidin) ifade ticari olarak temin lentiviral parçacıklar kullanılarak kırmızı flöresanlı proteinin (RFP) ifade etmek için ID8 fare yumurtalık kanseri hücreleri 13 transdüksiyonu. Yeşil floresan proteini, ancak daha zayıf bir flüoresans sinyali sağlanır unutmayın.
- Hemen önce transdüksiyon için, kültür hücreleri 50 -% 70 Final 1 ml polybrene (5 mg / ml içeren izdiham ve (penisilin / streptomisin olmadan) taze orta ekleyinkonsantrasyon).
- Yavaşça pipet RFP-lentivirüs (20 ul) kabına damla damla ve 72 saat süreyle 37 o C'de inkübe edin. Ortamı çıkarın ve 24 saat boyunca taze ortam ile inkübe edilir. Kültür ortamında (5 ug / ml) blastisidin eklenerek kalıt aktarımlı hücrelerin seçimi başlayın ve floresan mikroskobu (Şekil 1) kullanılarak, kırmızı hücreler için izler.
- Kültür bir doku kültürü çanak içine yaklaşık 10 6 hücre tohumlama ve hücre tek tabaka konfluent kadar bir ışık mikroskobu kullanarak günlük görselleştirerek ID8 ortamında RFP-etiketli hücreler.
- Konfluent, tripsin (% 0.25, 3 dk) kullanarak hücrelerin hasat ve hücreler müstakil kadar 37 o C inkübatör şişeyi geri döndüğünüzde.
- serum içeren kültür ortamı ID8 6 ml tripsin nötralize. yukarı pipet ve çanak alt karşı aşağı, sonra 15 ml konik tüp transfer. 2 dakika boyunca 1.200 rpm'de santrifüj, ardından GL kullanılarak ortam aspireeşek pipet.
- hafifçe sıcak PBS 6 ml yeniden süspanse yukarıda 1.5 gibi santrifüjleme ile fosfat tamponlu tuz (PBS) hücreleri yıkayın. 5 x 10 6 hücre / ml'lik bir son konsantrasyona PBS içinde yeniden askıya. Enjeksiyona kadar ılık hücreleri (37 ° C) saklayın.
2. içi periton ID8 Hücrelerinin Enjeksiyon ve in vivo Imaging
- Intra-peritoneal (ip) enjeksiyon yoluyla 10.000.000 hücre toplam sıcak ID8-PBS çözeltisi 2 mL her fare enjekte edilir. Tümör hücreleri haftada canlı görüntüleme yaklaşık 10 hafta boyunca in vivo olarak büyümeye olanak sağlar.
- Hemen (0.5 L / dk O 2 akışında% 2,5 debisi) isofluorane kullanarak her fare uyutmak sonra fareler tartmak ve bundan sonra enjeksiyon ve her hafta takip. Not: farelere olmayan tümör yükünün kantitatif ölçüm değil, çalışma boyunca bir fare, fiziksel ilerlemesi daha genel bir tedbir olarak, tartılmıştır. fareler tartmakts kendi önceki ağırlık değerleri ile karşılaştırıldı.
- Bir isofluorane odasında koyarak fareler anestezi. işlem boyunca% 2.5 debisi isofluorane maruz kalma burun-koni fare kafasını konumlandırarak tarama sırasında sabit anestezi koruyun.
- siyah saçlı floresan sinyal zayıflamasını neden olacağından, her fare gövde ve karın saç kaldırmak için tüy dökücü krem kullanın. Fareler tüy dökücü krem uygulamasından sonra ılık su ile yıkanmış ve RT kağıt havlu ile kurutulur.
- anestezi ederken, küçük bir hayvan optik görüntüleme sistemi kullanılarak her bir farenin tüm vücudu tarar. Her bir zaman noktasında bir grupta tüm fareleri tarayın. Aşağıdaki iki adımlı protokolü (Şekil 2A) kullanın:
- 1. Adımda, floresan etiketli (RFP) tümör hücrelerini gözlemlemek 440 nm, 460 nm, 4 uyarma filtreler kullanılarak 5 görüntülerin toplam toplamak için çok bantlı satın yürütmek80 nm, 520 nm ve 540 nm ve 600 nm'lik bir emisyon filtresi. 15 saniyelik bir standart pozlama, 2 x 2 binning, 160 mm FOV ve 1.1 f durağı: Aşağıdaki toplama parametrelerini kullanın.
- 2. Adımda, bütün hayvan gözlemlemek açık uyarma filtresi (beyaz ışık), bir açık emisyon filtresi, 2 x 2 binning ile 0.2 sn standart pozlama ve 16 cm FOV kullanarak bir yansıma görüntü elde etmek. Not: Gerçek görüntüleme süresi ~ 1 dk.
3. Fare Diseksiyon ve Image Acquisition
- Canlı görüntüleme (karın şişliği ile kanıtlandığı gibi) asitli geniş intra-peritoneal hastalık ya da hayvan sergi birikimi, kayıp veya vücut ağırlığının% 20'den fazla, uyuşukluk ya da sıkıntı diğer belirtileri kazanç varlığını gösterdiğinde, CO 2 kullanarak her fare euthanize anestezi servikal dislokasyon.
- sivri dissectio kullanarak, fare ventral orta hat boyunca öne deri kesmen makas, göğüs kafesinin alt uyluk üst. Sadece deri tabakasının (Şekil 2BI) kesmek için aşırı özen gösterin. Yavaşça periton duvar delmeyin için emin olmak, periton dokusu cilt ayırmak.
- Derinin iki flep oluşturmak için göğüs kafesinin alt ve uyluk üst kısmında hem yanal kesilmiş sivri diseksiyon makas kullanılarak (Şekil 2B ii, iii).
- Açık cilt flepleri ile ventral tarafta her fare (periton boşluğu aşağı bakacak) çekti yerleştirin ve küçük hayvan optik görüntüleme sistemi kullanılarak yerinde onun organları ile her fare tarama (Şekil 3A, B).
- 2.4.1.-2.4.2 tarif edildiği gibi aynı görüntü tedarik parametreleri kullanarak.
- karaciğer, omentum / pankreas, mide, diyafram, ince bağırsak, kalın bağırsak, sol ve sağ periton, yumurtalıklar, kidne içeren bireysel periton organları çıkartarak fare diseksiyon devam edinys, mezenter ve yağ yastığı.
- , Gözlemlemek numaralandırmak ve her organ üzerinde görünür tümör kaydedin. Her tümörün çapı ölçmek için bir kumpas kullanın.
- Ortam olarak 2 ve 5 mm kadar büyük daha büyük 5 mm arasında, küçük bir çap olarak 2 mm'den daha az tümör belirtin.
- Organ tarama şablonuna her organ için önceden belirlenmiş bir konumunu tanımlar (Şekil 4) üzerine organları yerleştirin. nemli organları tutmak için PBS kullanın.
- Küçük hayvan optik görüntüleme sistemi (Şekil 3C, D) ile organların her sayfayı tarayın.
- Adım 2.4 açıklandığı gibi aynı görüntü elde etme parametrelerini kullanın.
- Taramadan sonra,% 10 formaldehit yer organları histoloji için sonraki işlem sağlamaktır.
th Tümör Yükü 4. sayısallaştırılmasıe Floresan Görüntüleri
- Her bir çok bantlı taramada otomatik floresans miktarının azaltılması amacıyla, ilk küçük hayvan görüntüleme sistemi ile uygun yazılımı kullanarak dosyaları unmix.
- Vivo spektral dosyasında, Autofluor ardından: İlk RFP yükleyin Karışmamış Görüntüler penceresinde Vivo Kırmızı dosyasında ve Unmix seçin.
- 16 bit .tiff (ölçeklenmemiş) biçimi olarak .bip dosyaları aktarın.
- (In situ organları ile ex vivo organ ve ardından tam fare gövdesini) ImageJ yazılımı kullanın.
- ImageJ organ tarama şablon dosyalarını 16 bit .tiff dosyalarını açmak için> Dosya Aç kullanın.
- Görüntü> Ayarlama altında> Parlaklık / Kontrast, Minimum değeri 0 görüntülenen ve Maksimum +35353 değer gösterilir ve daha sonra altında yer alan tercihGörüntü> Arama Tabloları, Red Hot seçin. Not: Çeşitli hayvan modelleri, farklı parlaklık seviyeleri gerektirir, ancak belirli bir çalışma boyunca tutarlı parlaklık tutmak önemlidir.
- Serbest Seçim aracını kullanarak, her organın etrafında faiz seçimi (ROI) serbest biçimli bir bölgesini çizmek ve her organın yüzey alanını hesaplamak için Ölçü aracını (CTRL + M) kullanın; Bir e-tablodaki her bir organın yüzey alanı kaydedin.
- Her organın etrafında çizilen ROI ile, sağ ROI içinde tıklayın ve sadece organı dahil etmek için Çoğalt seçeneğini seçin.
- Eşik> Ayarla> Görüntü altında, bireysel organa bakarken, onl seçmek için + 1200 Alt Eşik Düzeyi ve + 1700 Üst Eşik Seviyesi görüntünün eşiğini ayarlayın tercihy en parlak fluoresan bölgeler ve Karanlık Arka Plan seçmek için kontrol edin; Tamam seçeneğini seçin. Not: Daha önce parlak alanlar analiz aşaması için seçilen böylece yukarıda gösterildiği gibi görüntüler, ImageJ eşik sürgü elle manipülasyon gerektirebilir. Farklı hastalık modelleri farklı eşik kısıtlamaları gerektirir, ancak belirli bir çalışma boyunca tutarlı eşik seviyesini düşük tutmak için önemlidir.
- Analiz altında> değiştirmek Boyutu, Parçacıklar Analiz (piksel ^ 2) 10-Infinity, Show tercih: Anahat, sadece "sonuçlarını görüntüle" seçeneğini ve alanları ve bu aydınlık bölgelerin ham entegre yoğunluğu hem ölçmek için Tamam 'ı kontrol, sayılır tümörler.
- Yüzey Alanı değerlerini ve görüntülenen her tümör seçimi Ham Entegre Yoğunluk kaydedin
- Analiz altında> Araçlar> Kalibrasyon Bar, organların görüntülere bir kalibrasyon ölçek çubuğu ekleyin. Not: Bu örnekte, bu Üst Hakkı, Siyah Dolgu Rengi, Beyaz Etiket Renk, 5'e Etiketler sayısı, 0 Ondalık, 12 Yazı Boyutu ve Zoom Yer değiştirerek yapıldı 4.0 faktör ve Kalın Metin sağlayan.
- Dosya altında> Farklı Kaydet ... Bir .TIFF ve .jpeg olarak montaj kaydedin.
- .jpeg Organların dosya ve sonra Ekle altında> Metin Kutusunu açmak için> Dosya Aç kullanın
- Fare sayısının sırasına ImageJ tam vücut taramalarının 16 bit tiff dosyaların her biri açmak için> Dosya Aç kullanın.
- Değeri 0 gösterilir ve Maksimum + 35353 değerini görüntülenen ve ardından Görüntü altında> Arama Tabloları, Red Hot seçin Görüntü altında>> Parlaklık / Kontrast ayarlama Minimum Set seçin.
- Dosya altında> Farklı Kaydet ..., a. TIFF ve .jpeg olarak montaj kaydedin.
5. Veri Analizi
- her bir farenin Her organ için sırasıyla tümörün Seçim alanları ve ham entegre yoğunlukları ekleyin ve her bir fare için toplam organı tümör alanı kaydedilir.
- Kaydedilen alanı ve ham bütünleşik Normaleİlgili Organ yüzey alanı (Tablo 1) toplam tümör alanı ve toplam ham entegre yoğunluk değerleri bölerek her organın boyutu için ed yoğunluk değerleri.
- Hesaplamak ve normalize tümör yüzey alanları ve normalize ham entegre yoğunluk değerleri, her iki ortalamasını arsa (Şekil 5a, b).
- görsel metastatik lezyonlar her organın denetim sırasında çıplak gözle görülebilen tümörlerin sayarak elde edilen bu ortalama değerleri karşılaştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
yumurtalık kanseri, metastatik bir mekanizma çok küçük (<2 mm) lezyonlar da dahil olmak üzere, farklı büyüklüklerde, çok sayıda lezyon arasında oluşan yüksek yaygın intra-peritoneal metastaz ile karakterize edilir. Bu nedenle, RFP etiketli tümör hücrelerinin kullanımı (Şekil 1) ve optik görüntüleme kılavuzu sayım ve lezyon boyutu ölçümü için alternatif bir yöntem sağlar. Zamanla tümör yükünün gelişmesi haftada asit potansiyel varlığı ölçmek için fare ve karın çevresi ölçümü tartılarak belirlenebilir. In vivo optik görüntüleme tümör yükünü (Şekil 2) değerlendirmek için tamamlayıcı bir yaklaşım sağlar. Yumurtalık kanseri periton boşluğuna birden fazla sitede ve site-spesifik metastaz moleküler sürücüler metastaz henüz bilinmemektedir. Genel olarak tümör yükü belirlenmesi ve buna ek olarak, aşağıdaki kurban dikkatli bir diseksiyon değerlendirilmesi ve sahaya özel pa ölçmek için gerçekleştirilebilirmetastaz tterns. Böylece, tek tek organların ex vivo değerlendirilmesi (Şekil 3C, D) ile kombine in situ periton organlara (Şekil 3A, B) optik görüntüleme genel vs organa özgü tümör yükü yararlı veriler sağlayabilir. Şekil 3'te tarama tümör yükünün değişen derecelerde farelerin karın boşluklarında ve bireysel organları tarama sonuçlarını temsil etmektedir. Sinyali anlamlı bir fark görülür Fare B (Şekil 3D) bu aynı organlara karşılaştırıldığında Örneğin, Şekil 3C omentum / pankreas, yumurtalık ve Fare A. mezenterinde en tümör yükünü gösterir. Organ tarama şablon (Şekil 4) kullanımı, organa özgü tümör yükü belirlenmesine yardımcı olur. Ayırıcı tümör yükünün gözlem, tümörlü yüzey alanı ve tümör sinyal yoğunluğu (Tablo 1, Şekil 5) açısından kantitatif hem doğrulanır.
Şekil 2 ve 3'te görüldüğü sinyalinin değişen derecelerde görüntülenmiş ve bu yöntemi kullanarak ölçülebilir tümör yükünün çok çeşitli göstermektedir. Tablo 1 deki veriler, her iki tümör yüzey alanı ve tümör sinyal yoğunluğu miktarının uygulanabilme Bu geniş bir ürün yelpazesi göstermektedir. omentum bakarken Fare B. Ayrıca, sinyal yoğunluğu geniş bir ürün yelpazesi de omentum örneklenmiştir daha Örneğin, / Fare A pankreas, normalize tümör yüzey alanı Fare A 26 kat daha fazladır Fare B ile karşılaştırıldığında Fareler A ve B / pankreas; Fare A normalize ham entegre yoğunluk Bu sonuçlar Bir karşılaştırma geçerliliğini kanıtlamaya Fare B. daha 56 kat daha fazladırBirçok test tümör yükü ng başka histolojik analiz gerektirmeyen bu pratik bir yöntem kullanarak, tümör yüzey alanı ve tümör sinyal yoğunluğu açısından daha, birbirlerine göre maruz bırakır.
ID8 hücrelerinin Şekil 1. ID8 Fare Yumurtalık Kanseri Hücreleri Express RFP. (A) Faz görüntüsü. (B) ID8 hücrelerinin Floresan görüntü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
İçi periton Tümör Yükü ile C56 / BL6 Mouse Şekil 2. Canlı Optik Görüntüleme. (A) Tüy dökücü krem hai kaldırmak için kullanılan Tarama öncesinde fare ventral yüzeyinden r. İlk ventral orta hat ve lateral kesiler gösteren (B) Diyagram. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3.. Endpoint Tarama Intra-Periton Tümör yükü. (A, B) Fare ilk. Yerinde organları ile fare ventral yüzeyi açılmasını takiben (aşağı ventral tarafı) görüntülü bireysel organların (C, D) Görüntüleme edilir. Her organ, disseke görsel tümör yükü kaydedilir ve analiz organ tarama şablonuna yerleştirilir.target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
4. Organ Tarama Şablon Şekil. Disseke organlar tarama sırasında bireysel organlarının pozisyonel kimlik korumak için, organ tarama şablonuna yerleştirilir.
.. Protokolde açıklandığı gibi ve Tablo 1'de görüldüğü gibi Omentum / Pankreas, Yumurtalıklar ve mezenter Veri Şekil 5. Normalize Sayısal Veriler analiz edildi Fare bir panel 3A taranan fare anlamına gelir; Fare B paneli 3B taranmış fare anlamına gelir. (A) Normalize tümör alanı. Bu üç organların floresans sinyali miktar analizi oranı bakımından yapılmış ve nicelleştirilmiştirHer iki fare için tüm organ yüzey alanına tümör yüzey alanının. (B) Normalize ham entegre yoğunluğu. Bu üç organların floresans sinyali ölçümü analizi yapılmış ve her iki fare için tüm organ yüzey alanı ham entegre yoğunlukta bir oranı olarak ölçülmüştür.
| Omentum / Pankreas | |||
| Normalize Tümör Alanı | Normalize Ham Entegre Yoğunluk | ||
| fare A | 0,5346 | 5.11E + 07 | |
| fare B | 0,0203 | 8.97E + 05 | |
| yumurtalıklar | |||
| Normalize Tümör Alanı | Normalize Ham Entegre Yoğunluk | ||
| fare A | 4.79E + 07 | ||
| fare B | 0.0123 | ||
| mesenter | |||
| Normalize Tümör Alanı | Normalize Ham Entegre Yoğunluk | ||
| fare A | 0,2951 | 2.22E + 07 | |
| fare B | 0.0098 | 4.15E + 05 | |
Tablo 1. Normalize Tümör Alanı ve Normalize HamOmentum / Pankreas, Yumurtalıklar ve Fare A ve Fare B. Mesaj hem diseksiyon ve tarama mezenterinde Entegre Yoğunluk değerleri, her organ segmente edilmiş ve floresan toplam organı yüzey alanına tümör alanının oranını ve şiddetini belirlemek için sayısal bu tümör alanları için ışık vermiştir. her ikisi de pozitif ve negatif kontrol grupları içinde en güçlü floresan sinyalleri vardı omentum / pankreas, yumurtalıklar ve mezenter seçildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
bağışıklık yetersizliği olan farelerde yapılmalıdır insan yumurtalık kanser hücrelerinin kullanan çalışmaların tersine, protokol, yukarıda tarif edilen imünokompetan C57 / BL6 fareleri ve genetik olarak özdeş fare yumurtalık kanseri hücreleri kullanır. Bu tümör büyümesi ve metastazı bağışıklık infiltrasyonların potansiyel rolünün değerlendirilmesi sağlarken, karın yüzeyinde siyah saçlı varlığı görüntüleme az duyarlı hale getirir. tüy dökücü kullanımı görüntüleme öncesinde saç görüntü toplama artırır kaldırmak, ancak zaman alıcı özellikle uzunlamasına görüntüleme gerektiren deneyler için, da. Tüysüz 'çıplak' fareler Bu protokolde kullanılan olabilir ve tüy dökücü tabanlı epilasyon gerekmez. Bundan başka, çıplak farelere işleyen bir bağışıklık sistemine sahip değillerdir, bu yüzden, bağışıklık sisteminin katılım analizi kapsamında olduğu deneylerde insan yumurtalık kanser hücrelerinin büyümesini değerlendirmek için kullanılabilir.
Ayrıca intraper derinliği unutulmamalıdırOptik floresan görüntüleme genellikle 5 mm'den büyük derinliklerde tümör tespit olmayacak gibi itoneal tümörler de, teknik zorluklar getirmektedir. Ayrıca, asit sıvısı yaygınlığı ve asitik tümör hücrelerinin varlığı ek komplikasyonlar sağlar. Aynı hücre hattı ile enjekte edildiği zaman bile, assit sıvısı oluşumunda önemli bir fare için-fare değişkenlik gözlenmiştir. Böylece asit mevcudiyetinde, bu yöntem son nokta organa özgü tümör yükünün analizi yerine ilerlemesi rutin boyuna görüntüleme için tercih edilir. Mevcut durumda, tümör yükü dramatik değişiklikler dört ila beş fare kohortlar genellikle istatistiksel analiz için yeterli olacak şekilde, örneğin fareler arasında bir fark görülmemiştir. tümör yükü daha az dramatik farklılıklar durumunda, ek deneysel konular istatistiksel güce ulaşması için gerekli olacaktır. Bu tarifnamede gösterilen örnekler tümör hacminde önemli ölçüde farklılık ise, optik flüoresan görüntüleme için kullanılabilirağırlık olarak göre ya da küçük lezyonlar üzerinde çap pergeli dayalı ölçümleri (gösterilmemiş olan) .Resolution ve duyarlılık hücre çizgisi ve görüntüleme sistemi ile değişir, özellikle organ spesifik tümör yükü çok daha küçük farklılıkları tespit. Mevcut durumda, çapı 400 mikron kadar küçük metastatik implantlar çözülmesi ve ölçülebilir. Kontrastlı bilgisayarlı tomografi (BT), manyetik rezonans (MR) görüntüleme ve pozitron emisyon tomografisi (PET) gibi alternatif yöntemler boyuna görüntüleme 14,15 tarif edilmiştir. Kombine anatomik ve işlevsel görüntüleme gibi yöntemleri geliştirme 16 altındadır.
Tümör yükü miktarının tayini için, bu önerilen yöntem ile ilgili olarak, floresans eşik [Aşama 4.3.5.] belirlenmesi organı görüntüleri görülen floresan yoğunluğuna dayalı olduğu unutulmamalıdır [Aşama 4.3.2.] ve relat sadece en floresan bölgeleri içerecek şekilde kullanıcı tarafından seçilirorganın geri kalanına ive. Değişen eşik değerleri, bu çalışmada kullanılan nihai eşik değerinin belirlenmesine yer önce analizde kullanılmıştır. belirlendikten sonra, bu aynı eşikleri araştırmacı tarafından yapılan ilk görsel analizi ile metastatik doku sayılır ne nicelleştirmesinde tutarlılığı sağlamak amacıyla analiz, her organ için kullanıldı. Bu eşiklerin belirlenmesi bireysel araştırmacı tarafından belirlenen bir projeden diğerine değişebilir potansiyel yordamı kritik bir adımdır ve. sadece en yüksek yoğunluklu floresan sinyalleri tutmak üzere, bu durumda, büyük bir alt eşik kullanıldı. analiz her organ için aynı eşik kullanarak, analiz ve sonuçları farelerin bu grupta kapsamında karşılaştırmalı kantitatif sonuçlar sunuyoruz. Bu yöntem, tümör yüzey alanının mutlak değerlerinin ölçümü sınırlı iken, araştırmacılara aynı a arasındaki göreli normalize tümör yükünü karşılaştırmak için yeteneği sağlarnd farelerin kohortlarda içinde farklı organlar. Yaklaşım, çıplak gözle görülemez tümörler da kapsamaktadır unutulmamalıdır.
Birden fazla doku ve organlar, teknik açıdan zor optimum sitoredüktif cerrahi render içeren geniş yayılmış intraperitoneal karsinomatozis içinde EOC sonuçlarının eşsiz metastatik mekanizması. tam sitoredüksiyon olumlu genel sağkalım ile korelasyon gibi, yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi içi periton metastazı garanti edilir mücadele izler. terapötik etkinliğinin değerlendirilmesi, ancak, organa özel metastaz değerlendirme dahil olmak üzere tümör yükü doğru nicelenmesi bağlıdır. Dikkatli ex vivo Organ görüntüleme ile kombine Organ otofloresansı için düzeltilmiş yerinde RFP-etiketli tümör hücreleri, optik görüntüleme kullanarak, periton organ-spesifik tümör yükünü ölçmek için bir yaklaşım geliştirdik. İlginçtir, bizim analizler gösteriyorBu modelde metastaz tercih siteleri, tümör yükü / yüzey alanı ile tanımlanan, yumurtalık kanseri (omentum, yumurtalık, barsak, mezenter) 2,4,5 kadınlarda bulunanlara benzemektedir. Bu nedenle, bu yaklaşım metastatik hastalık hedef için tasarlanmış deneysel tedavilerin değerlendirilmesinde gelecekte yarar olmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu makale Bruker BioSpin sponsorluğunda Multimodal Klinik Öncesi Görüntüleme üzerinde bir özel sayısında, bir parçasıdır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning | 10-014-CM | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437-028 | |
| penicillin/streptomycin | |||
| Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement | Sigma | I-1884 | |
| Bruker Xtreme small animal imaging system | Bruker Corp. | ||
| Bruker Multispectral software | Bruker Corp | ||
| lentiviral particles with Red fluorescent protein | GenTarget, Inc. | LVP023 | |
| trypsin for cell culture | Corning | 25-053-CI | |
| PBS | Corning | 21-040-CM | |
| depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion) | purchases from drugstore | n/a | |
| ImageJ software | http://imagej.nih.gov/ij/ | free download | |
| dissecting tools (forceps) | Roboz Surgical Instrument | RS 5130 | |
| dissecting tools (Scissors) | Roboz Surgical Instrument | RS 5910 |
References
- American Cancer Society. , Available from: http://www.cancer.org/cancer/ovariancancer/overviewguide/ovarian-cancer-overview-key-statistics (2015).
- Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).
- Halkia, E., Spiliotis, J., Sugarbaker, P. Diagnosis and management of peritoneal metastases from ovarian cancer. Gastroenterology Research and Practice. 2012, 541842-541854 (2012).
- Barbolina, M. V., et al. Microenvironmental regulation of ovarian cancer metastasis. Cancer Treatment and Research. 149, 319-334 (2009).
- Lengyel, E., et al. Epithelial ovarian cancer experimental models. Oncogene. 33 (28), 3619-3633 (2014).
- Harter, P., duBois, A. The role of surgery in ovarian cancer with special emphasis on cytoreductive surgery for recurrence. Current Opinion in Oncology. 17 (5), 505-514 (2005).
- Bristow, R. E., Puri, I., Chi, D. S. Cytoreductive surgery for recurrent ovarian cancer: a meta-analysis. Gynecologic Oncology. 112 (1), 265-274 (2009).
- Hoffman, R. M. In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins. Cell Death and Differentiation. 9, 786-789 (2002).
- Sweeney, T. J., et al. Visualizing the kinetics of tumor-cell clearance in living animals. Proceedings of the National Academy of Science USA. 96, 12044-12049 (1999).
- Chishima, T., et al. Cancer invasion and micrometastasis visualized in live tissue by green fluorescent protein expression. Cancer Research. 57, 2042-2047 (1997).
- Bouvet, M., et al. Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model. Cancer Research. 62, 1534-1540 (2002).
- Hoffman, R. M. The Multiples Uses of Fluorescent Proteins to Visualize Cancer in vivo. Nature Reviews. 5, 796-806 (2005).
- Roby, K. F., et al. Development of a syngeneic mouse model for events related to ovarian cancer. Carcinogenesis. 21 (4), 585-591 (2000).
- Rampurwala, M., Ravoori, M. K., Wei, W., Johnson, V. E., Vikram, R., Kundra, V. Visualization and quantification of intraperitoneal tumors by in vivo computed tomography using negative contrast enhancement strategy in a mouse model of ovarian cancer. Translational Oncology. 2 (2), 96-106 (2009).
- Kim, T. J., et al. Antitumor and antivascular effects of AVE8062 in ovarian carcinoma. Cancer Research. 67, 9337-9345 (2007).
- Picchio, M., et al. Advanced ovarian carcinoma: usefulness of [(18)F]FDG-PET in combination with CT for lesion detection after primary treatment. Quarterly Journal of Nuclear Medicine. 47, 77-84 (2003).
