Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.
Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.
Som nanomateriale stigende grad benyttes i en lang række industrier og anvendelser, der er behov for nanoskala billedbehandling og karakteriseringsmetoder, der er hurtigere, overkommelige og praktisk end traditionelle fremgangsmåder, f.eks elektronmikroskopi. At visualisere nanopartikler (NP) interaktioner med celler, væv og levende systemer, mange optiske teknikker har været ansat, herunder kontrast differential interferens (DIC) mikroskopi 1 og flygtige felt tilgange, såsom total intern refleksion (TIR), eller nær- skannings optisk mikroskopi (NSOM) 2,3. Men disse er high-end analytiske tilgange, utilgængeligt for de fleste ikke-specialiserede laboratorier 4. Elektronmikroskopi, herunder transmissionselektronmikroskopi (TEM), er også blevet anvendt til at undersøge NP interaktion med celler 5,6,7,8. Høj vinkel ringformede mørkefelt (HAADF) scanning transmissionselektronmikroskopi er blevet anvendt til at undersøge interaktionen NPSmed virus 9. Konfokal mikroskopi er en anden populær teknik, der anvendes til at studere NP-celle-interaktioner 10.
I de senere år har mørkefelt-baserede hyperspektral imaging (HSI) teknikker blevet anvendt som et lovende analytisk redskab til at studere NP'er i biologiske matricer 11. HSI-systemer genererer en tredimensionel repræsentation af rumlige og spektrale data, kendt som en hyperkubus eller datacube 12. Den rumlige kort over spektral variation bruges til materiale identifikation. Spektrale signaturer for kendte materialer kan genereres og anvendes som referencebiblioteker til sammenligning med ukendte prøver. En af de store fordele med HSI systemer er dens evne til at kombinere billeddannelse med spektroskopi, hvorved der etableres placering og fordeling af ukendte NP'er in vivo eller ex vivo såvel som forbinder dem til en anden reference partikel af kendt, lignende sammensætning.
Der er flere fordele vedved hjælp af HSI systemer i forhold til konventionelle billeddannelsesteknikker: minimal prøveforberedelse er påkrævet; prøveforberedelse er typisk ikke-destruktiv i naturen; indsamling og analyse af billedet er hurtigere; teknikken er omkostningseffektiv 13; og den rumlige fordeling og analyse af forbindelser med blandet sammensætning og / eller i komplekse matricer er lettere opnås 14.
For nanomaterialer forskning med værdifulde prøver, en af de vigtigste overvejelser er tilgængeligheden af en ikke-destruktiv billeddannelse metode, som gør det muligt for den potentielle gentagne gange undersøge prøver af en eller flere metoder. Gentagen eller flere analyser kan være ønskeligt at udvikle omfattende datasæt, som ikke ville være til rådighed fra en enkelt metode. Til denne henseende studere dens optiske egenskaber er den sikreste måde at analysere prøven. Ved anvendelse af et forstærket mørkefelt mikroskop (EDFM) og HSI system til at studere den optiske respons af prøven – nemlig REFLEctance, men også absorbans og transmittans – funktionen identifikation og karakterisering kan udføres 15. Potentielle karakterisering endpoints omfatter en vurdering af relative størrelse og form af nanopartikler eller agglomerater og distribution af nanopartikler i en prøve.
I dette papir, beskriver vi kortlægningsmetoder specifikt til metaloxid nanopartikler i post mortem væv ved hjælp af en HSI system baseret på en pixel-spektral match algoritme kaldet en spektral vinkel mapper (SAM). Vi valgte denne særlige anvendelse, fordi det har potentiale til at supplere nuværende og fremtidige in vivo nanotoksikologi forskning, hvor dyremodeller anvendes til at vurdere de sundhedsmæssige konsekvenser af udsættelse for industrielt fremstillede nanomaterialer. Anvendelse af denne metode kunne også informere nanoskala lægemiddelafgivelse forskning, der anvender væv eller dyremodeller. Især nanopartikel absorption, fordeling, metabolisme og udskillelse i hele organs og væv kunne undersøges med dette system. En bred vifte af applikationer bliver undersøgt til brug i biomedicinsk forskning 11.
Denne metode kunne anvendes til vurdering af forskellige biologiske prøver (såsom forskellige typer væv, bronkoalveolære udskylningsprøver, og blodudstrygninger), der har været udsat for nanopartikler af en række elementære sammensætninger 16-19. Desuden er denne fremgangsmåde er anvendelig til undersøgelse af nanopartikel biodistribution in vivo og in vitro, som er relevant for nanoskala lægemiddelafgivelsessystemer undersøgelser 11. Ud over biologiske prøver, kan EDFM og HSI anvendes til at vurdere nanopartikler i miljøprøver, såsom spildevand 20. Vurdering af erhvervsmæssig eksponering kan lettes ved brug af denne teknik så godt, da det kan bruges til at evaluere effekten af personlige værnemidler til forebyggelse af nanopartikel penetration. Desuden forskning team er ved at udvikle en lignende EDFM og HSI protokol for evaluering af filter medier prøver af nanopartikler indsamlet fra vurderinger erhvervsmæssig eksponering. Mens fremstillingen af disse forskellige prøvetyper for EDFM og HSI kan variere, er det vigtigt, at de er forberedt på en sådan måde, at de let kan visualiseres ved det optiske system. Typisk skal prøven være forberedt, som om det ville visualiseres via traditionel brightfield mikroskopi. Der er flere hyperspektral afbildningssystemer kommercielt tilgængelige 11.
For kan opnås vævsprøver, der har undergået konventionelle histologiske farvning, identifikation og analyse af metal oxid nanopartikler gennem en kombination af EDFM, HSI kortlægning, og image analyseteknikker. Mens der er fleksibilitet ved prøvefremstilling til histologi eller immunohistokemi (f.eks ved hjælp af faste eller frosne væv; plettype), er det vigtigt, at prøverne snit til en tykkelse på 5-10 um for optimal visualisering. Prøver bruges her var formalin-fikseret og paraffin-indstøbt før sektionering med en roterende mikrotom til 6 um tykkelse, monteret på objektglas, farvet med hematoxylin og eosin og dækglas. Svinehud væv fra en ex vivo kutan penetration toksikologi samarbejde blev anvendt til denne undersøgelse. Vævene blev udsat for metaloxid nanopartikler (aluminiumoxid, siliciumdioxid, ceria) i vandige suspensioner. Påvisning af regionen (r) af interesse (høj kontrast elemeNTS) med EDFM er et kritisk første skridt, der letter senere HSI kortlægning og analyse. Positive og negative kontrolprøver skal afbildes og analyseret først for at skabe en spektral bibliotek til reference. Den indsamlede spektre fra den positive kontrol udføres til en positiv kontrol spektral bibliotek. Derefter er alle spektrene fra den negative kontrol billeder subtraheres fra den positive kontrol spektrale bibliotek for at forbedre specificiteten (reducere falske positiver). Den resulterende filtrerede spektrale bibliotek anses RSL der tjener til analyse af materialer af interesse. Alle vævsprøver gennemgå den samme billeddannende proces, og er kortlagt mod RSL. Det resulterende billede vil kun indeholde områder med elementer af interesse over en sort baggrund. Dette billede kan derefter analyseres med ImageJ ved hjælp af sine tærskel- og partikel analyse funktioner for at opnå området med kortlagte partikler pr synsfelt. Numeriske data fra ImageJ kan være eksported til et regneark til videre analyse.
Det er vigtigt at overveje, at så biologiske prøver er i sagens natur forskellige fra hinanden, og farvningsmetoder kan påvirke visualisering gennem EDFM og HSI, bør indstillingerne for eksponering bestemmes i overensstemmelse med, hvad der giver den bedste høj kontrast billede til en bestemt type prøve. Selvom der kan opnås reduktion af falske positiver gennem filtrering af spektrale biblioteker, er det afgørende at få pålidelige negative kontroller, der har undgået forurening med det element af interesse, da spektre, der svarer til denne forurening potentielt kunne filtreres fra den positive kontrol er spektrale bibliotek stigende falsk negative. Desuden kan spektret intensitet område, der er påviseligt med den hyperspektral imaging software ikke overstige grænsen for den særlige software (til denne undersøgelse, der er 16.000 enheder): områder med et højt antal akkumulerede partikler, der producerer spectral intensiteter over intensiteten grænse er udeladt af den spektrale biblioteket, på grund af risikoen for at øge antallet af falsk negative resultater.
Mens HSI systemet giver mange fordele i forhold til traditionelle metoder, der er nogle ulemper og begrænsninger at overveje. Den ene er, at den store mængde af optiske data indsamlet kan kræve en betydelig computerkraft. En anden er, at HSI kan være tidskrævende, især i begyndelsen stadier, når reference- spektrale biblioteker bliver skabt. Ligeledes kan imaging tid kræve flere minutter pr billedoptagelse, hvilket gør det langsommere end simpel mørkefelt billeddannelse; dog er det stadig hurtigere end at udføre fremstilling og visualisering prøvetagning ved elektronmikroskopi. Derudover kan komplekse systemer resultere i flere karakteristiske spektre, som kræver udvikling af højt specialiserede kontroller og gøre etablering af standardiserede, universelle referencebiblioteker vanskelige 26. Endelig technique resultater i lavere opløsning end probe- eller elektron-mikroskopi teknikker, såsom atomic force mikroskopi eller transmissionselektronmikroskopi, som kan løse enkelte atomer. Denne teknik beslutning er begrænset på grund af sin fotoniske natur, der forhindrer den fra at være en høj præcision værktøj til måling partikelstørrelser på nanometer-niveau eller for præcist at lokalisere materialer på en sub-micron niveau. Mens teknikken kan være i stand til at lokalisere partikler inden for visse vævsrum eller cellulære organeller større end 1 um (såsom cellekerner), er mindre organeller eller funktioner udfordrende at visualisere nøjagtigt med denne metode. Også at bemærke, givet sin rumlig opløsning, kan denne metode ikke skelne mellem enkelte nanopartikler og agglomerater 11.
Andre overvejelser omfatter: visse materialer (såsom ædle metaller) har meget højere reflektans og adskilte spektrale profiler, som kan gøre dem lettere at ANALYze og kort spektralt med dette værktøj. Andre, såsom de semi-metaloxider undersøgt i dette studie og carbon-baserede nanomaterialer 24, 27, kan være mere udfordrende på grund af deres grundstofsammensætning, form, og afhængigt af matrixen. I to murine inhalationsstudier af Mercer et al., Blev et lignende system til den anvendt i denne undersøgelse anvendes til at lokalisere kulstof-nanorør i lungerne og i de sekundære organer baseret på deres bemærkelsesværdigt høj kontrast med omgivende væv. Imidlertid blev hyperspektral kortlægning ikke påvist i nogen af studierne, sandsynligvis fordi unikke form af kulfibre var en tilstrækkelig træk til identifikation. En anden overvejelse vedrører specifikt til væv: siden deponering nanopartikler af interesse for specifikke organer gennem normale biofysiske processer er uforudsigelig (og ofte selv er genstand for undersøgelsen), kan bestemmelse af en gældende positiv kontrol være svært og kræver overvejelse af, hvordan generation af kontrol might påvirke tilstanden af et materiale af interesse. For eksempel, hvis en spektral bibliotek skabt ud fra uberørte nanopartikler af interesse, kan det være vanskeligt at kortlægge biblioteket til de samme nanopartikler i væv eller celler på grund af ændringer i spektrene som følge af ændring af partikel (f.eks, som følge af ændring i pH, opløsning, agglomerering, proteinbinding) og den samlede mikromiljø eller matrix. Endelig er teknikken begrænset i sin semikvantitativ karakter: Det kan kun være så kvantitativt som andre todimensionale mikroskopiteknikker af lignende opløsning, hvilket betyder, at det ikke let kan anvendes til at udføre opgaver såsom at karakterisere samlede organ belastning af et materiale.
Samlet, EDFM og HSI giver flere fordele i forhold til konventionelle nanomateriale billed- og karakterisering teknikker, såsom TEM, HAADF og DIC. EDFM / HSI giver mulighed for erhvervelse hurtigere image og analyse, hvilket sparer tid og omkostninger i forhold til en mere intensiv konventionnale teknikker. Derudover prøveforberedelse for EDFM / HSI er typisk både minimal og ikke-destruktiv, hvilket sparer tid og giver også mulighed for en mere fleksibel analyse af en given prøve, da det så kan anvendes til andre teknikker. Endvidere HSI er alsidig, giver mulighed for analyse af nanoskala materialer mange præparater og i en række matricer. Forskerholdet arbejder på at forfine beskrives her for andre materialer og prøvetyper, herunder en grundig vurdering af specificitet af teknologien metoden. Et kritisk næste skridt under efterforskning af forskergruppen er validering af disse teknikker mod traditionelle guld standarder (fx Raman, TEM, SEM) for de materialer og vævstyper af interesse.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Günter Oberdörster, DVM, PhD and Alison Elder, PhD (University of Rochester) and Mary Frame, PhD (Stony Brook University) for animal research collaborations resulting in tissue samples for analysis. Additionally, the authors thank: Christina Rotondi (Albany Medical College Histology Core); Rani Sellers, DVM, PhD and Barbara Cannella, PhD (Albert Einstein College of Medicine Histology and Comparative Pathology Facility); Leonardo Bezerra and Ahlam Abuawad (Brenner research team members); and Leslie Krauss, Byron Cheatham and Elyse Johnson (CytoViva). This work was supported in part by CDC-NIOSH grant OH-009990-01A1 and the NanoHealth and Safety Center, New York State, awarded to S.B.
CytoViva 150 Unit (condenser) | CytoViva (Auburn, AL) | mounted to Olympus BX43 microscope | |
Olympus BX43 Microscope – Analyzer Slot – HSI with 10x and 40x air objectives and 100x oil immersion objective | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | for use with CytoViva 150 Unit condenser | |
Dagexcel-M Digital Firewire Camera – Cooled; includes Exponent 7 software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | enhanced darkfield camera and software | |
CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | hyperspectral camera and software | |
cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides) | Schott NEXTERION | 1025087 | reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging |
cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22mm x 22mm x 1.45mm) | Schott NEXTERION | custom | reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging |
type A microscopy immersion oil | Fisher Scientific | 12368B | multiple suppliers |
70% isopropanol in water | multiple suppliers | ||
ImageJ software | National Institutes of Health (NIH) | free open-source software online download | |
metal oxide nanoparticles | supplied to the research team by industrial partners | alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed. |