Identification des nanoparticules d'oxyde de métal dans des échantillons histologiques par cartographie Darkfield Microscopie et hyperspectrale Enhanced

Introduction

Comme nanomatériaux sont de plus en plus utilisés dans une variété d'industries et d'applications, il est nécessaire pour l'imagerie à l'échelle nanométrique et de caractérisation des méthodes qui sont plus rapide, abordable et pratique que les modalités traditionnelles, telles que la microscopie électronique. Pour visualiser nanoparticules (NP) interactions avec les cellules, les tissus et les systèmes vivants, de nombreuses techniques optiques ont été employées, y compris contraste d'interférence différentiel (DIC) microscopie ¹ et les approches de terrain évanescentes, tels que la réflexion totale interne (TIR) ​​ou quasi- microscopie à balayage de champ optique (SNOM) ^2,3. Cependant, ce sont les approches analytiques haut de gamme, hors de portée de la plupart des laboratoires non spécialisés ^4. La microscopie électronique, notamment la microscopie électronique à transmission (TEM), a également été utilisée pour étudier l'interaction des cellules avec NP ^5,6,7,8. Haut-angle fond noir annulaire (HAADF) microscopie électronique à transmission à balayage a été utilisée pour étudier l'interaction des IP⁹ par des virus. La microscopie confocale est une autre technique populaire utilisé pour étudier les interactions cellulaires ^NP-10.

Au cours des dernières années, l'imagerie hyperspectrale (HSI) techniques basées sur fond noir-ont été utilisés comme un outil analytique prometteuse pour l'étude des PN dans les matrices biologiques ^11. HSI systèmes génèrent une représentation tridimensionnelle de données spatiales et spectrales, connu comme un hypercube ou Datacube ^12. La carte spatiale de variation spectrale est utilisé pour l'identification des matières. Les profils spectraux des matériaux connus peuvent être générés et utilisés en tant que bibliothèques de référence pour la comparaison avec des échantillons inconnus. L'un des principaux avantages des systèmes d'IHV est sa capacité à combiner l'imagerie par spectroscopie, établissant ainsi l'emplacement et de la distribution des IP inconnus in vivo ou ex vivo ainsi que les relier à une autre particule de connu, composition similaire référence.

Il existe plusieurs avantagesen utilisant des systèmes d'IHV sur les techniques d'imagerie classiques: préparation de l'échantillon minimal est nécessaire; préparation de l'échantillon est typiquement non-destructive dans la nature; acquisition et d'analyse d'image est plus rapide; la technique est rentable ^13; et la distribution spatiale et l'analyse des composés de composition mixte et / ou dans des matrices complexes est plus facilement accompli ^14.

Pour la recherche sur les nanomatériaux impliquant précieux échantillons, l'un des aspects les plus importants est la disponibilité d'une méthode d'imagerie non destructive, ce qui permet d'examiner le potentiel de façon répétée des échantillons par une ou plusieurs méthodes. Répétées ou multiples analyses peut être souhaitable de développer des jeux de données complets qui ne seraient pas disponibles à partir d'une seule méthode. Pour cet égard, l'étude de ses propriétés optiques est le plus sûr moyen d'analyser l'échantillon. En utilisant un microscope à fond noir amélioré (EDFM) et le système HSI pour étudier la réponse optique de l'échantillon - à savoir Reflectance, mais aussi absorbance et de transmission - l'identification et la caractérisation de fonction peut être effectuée ^15. Paramètres de caractérisation potentiels comprennent une évaluation de la taille relative et la forme de nanoparticules ou des agglomérats et la distribution des nanoparticules dans un échantillon.

Dans cet article, nous décrivons les méthodes de cartographie spécifiquement pour les nanoparticules d'oxyde de métal dans les tissus post-mortem en utilisant un système HSI basé sur un algorithme de correspondance pixel-spectrale appelé mappeur angle spectrale (SAM). Nous avons choisi cette application particulière, car elle a le potentiel de compléter actuel et futur de la recherche en nanotoxicologie vivo, dans laquelle des modèles animaux sont utilisés pour évaluer les conséquences sanitaires de l'exposition aux nanomatériaux manufacturés. L'application de cette méthode pourrait également informer recherche à l'échelle nanométrique de délivrance de médicament qui utilise des modèles de tissus ou animales. En particulier, l'absorption de nanoparticules, la distribution, le métabolisme et l'excrétion long organs et les tissus pourraient être étudiés avec ce système. Une grande variété d'applications sont à l'étude pour une utilisation dans la recherche biomédicale ^11.

Cette méthode pourrait être utilisée pour l'évaluation de différents échantillons biologiques (tels que les types différents tissus, d'échantillons de lavage broncho-alvéolaire et les frottis de sang) qui ont été exposés à des nanoparticules d'une variété de compositions élémentaires ^16-19. En outre, ce procédé est utile pour l'étude de la biodistribution des nanoparticules in vivo et in vitro, ce qui est pertinent pour des études d'administration de médicament ¹¹ à l'échelle nanométrique. Au-delà des échantillons biologiques, EDFM et HSI peuvent être utilisés pour évaluer les nanoparticules dans les échantillons environnementaux, comme les eaux usées ^20. Évaluation de l'exposition professionnelle peut être facilitée par l'utilisation de cette technique aussi bien, car il peut être utilisé pour évaluer l'efficacité de l'équipement de protection personnelle pour prévenir la pénétration de nanoparticules. En outre, la te de rechercheh développe actuellement un EDFM similaire et HSI protocole pour l'évaluation d'échantillons de supports filtrants de nanoparticules recueillies lors des évaluations d'exposition professionnelle. Bien que ces types de préparation de l'échantillon pour différents EDFM HSI et peut varier, il est important qu'elles sont préparées d'une manière telle qu'ils peuvent être facilement visualisés par le système optique. Typiquement, l'échantillon doit être préparé comme si elle allait être visualisée par microscopie en fond clair traditionnel. Il existe plusieurs systèmes d'imagerie hyperspectrale disponibles dans le commerce ^11.

Protocol

Protocoles d'animaux ont été approuvés par l'Institutional Animal Care et l'utilisation Comité à l'institution collaboratrice des enquêteurs, Stony Brook University. Une liste des matériaux et équipements utilisés pour le présent document spécifiques peut être trouvé dans le tableau 1.

1. Préparation des échantillons de tissus

1. Préparer les tissus animaux exposés à des nanoparticules d'oxyde métallique pour la coloration histologique ou par des méthodes immunohistochimiques comme ^21-23 décrits précédemment.

2. Imaging

1. Initialisation du Microscope
   NOTE: Pour cette étude, un microscope de qualité de la recherche a été utilisé, équipé d'une source de lumière sur fond noir haute performance, contrôleur XY motorisée de la scène, profondeur 14-bit caméra hyperspectrale, et de multiples lentilles de l'objectif (10X air, 40X air, 100X à immersion d'huile) . Le système utilisé ici a une résolution spatiale de 64 nm à 100X (immersion dans l'huile) grossissement. Le condenseur utilisé pour ce plotY a deux Koehler et critiques fonctionnalités d'éclairage et se concentre une lumière fortement collimatée à des angles obliques sur l'échantillon.
   1. Branchez et mettez sur la source de lumière, contrôleur de XY, caméra optique (pour l'imagerie à fond noir), la caméra hyperspectrale, et le système d'ordinateur. Réglez la source de lumière à 75% de la puissance; élever le stade à la hauteur maximale; connecter le guide de lumière au condenseur à fond noir renforcée imagerie ou pour le collimateur sur l'arrière du microscope pour l'imagerie en fond clair réfléchi.
      REMARQUE: En réglant la source de lumière à 75% de la puissance, il est suffisant, un éclairage uniforme de tous les pixels au sein de l'ensemble du champ de vision qui améliore ternes pixels tout en permettant de contraste entre les pixels ternes et brillants.
   2. Soulever le condenseur en position de fonctionnement. Appliquer 3-5 gouttes de type A l'huile d'immersion de la lentille de condenseur avec soin, en évitant la formation de toutes les bulles. Essuyez l'huile et réappliquer, si des bulles doivent se former.
   3. Placez la lame on la scène. Soulevez lentement le condenseur jusqu'à ce que l'huile d'immersion est en contact avec la lame. Ce sera perceptible à travers l'anneau éclaircissement rapide de l'illumination où l'huile entre en contact avec la lame.
2. Mettez l'objectif 10X en place. Concentrer et aligner le condenseur en examinant à travers les oculaires.
   1. Déplacez la scène de haut en bas avec le bouton de mise au point grossière objectif jusqu'à la luminosité est maximisée.
   2. Déplacez le condenseur concentrer haut et en bas via le bouton de réglage du condenseur jusqu'à ce que la luminosité maximale est trouvé. Tenter de créer la plus brillante tache centrale possible dans le champ de vision.
   3. Ajustez l'alignement boutons nécessaire à condensateur pour centrer la tache, si nécessaire.
   4. Utilisez le bouton de mise au point objectif amende pour amener la tache lumineuse dans le foyer. Lorsque l'évolution des objectifs d'obtenir un grossissement différent, réajuster le plan de mise au point. Lors de l'utilisation de l'objectif 100X, appliquer une goutte d'huile d'immersion sur la lamelle pour améliorer èmeimage e et éviter d'endommager l'objectif.
3. Capture d'images
   1. Utilisez contrôleur de scène pour trouver une région d'intérêt. Cette région sera déterminé par les besoins de l'expérience. Un indicateur typique sera fort contraste avec les régions environnantes, comme des zones baignés de nanoparticules d'oxyde de métal apparaissent souvent plus lumineuse que les zones sans eux.
   2. Apportez la région au point en utilisant le bouton de mise au point objectif bien, le réglage de la mise au point nécessaire pour équilibrer l'éclairage du condenseur. Atteindre une région à fort contraste, bien définie dans le champ de vision.
   3. Déterminer quelles images (pour la caméra optique) ou cubes de données (pour la caméra hyperspectrale) sera capturé, et dans quel ordre. Typiquement, les images optiques sont obtenus avec un objectif 10X de l'air, de l'air objectif 40X et 100X objectif à immersion d'huile et un cube de données HSI correspondant avec un objectif à immersion d'huile 100X.
      1. Ouvrez le logiciel d'imagerie optique. Cliquez sur "Paramètres &# 8221; dans la barre de menu. Sélectionnez "Capture Image Button pour l'événement de capture". Sélectionnez le format d'image stockée (TIFF a été utilisé pour cette expérience); attribuer un nom de fichier; rechercher et sélectionner un dossier d'image stockée; Timelapse garder défaut; cliquez sur "OK".
      2. Sélectionnez les paramètres d'exposition qui créent l'image de contraste le plus élevé dans le menu "d'exposition" (pour cette étude, un niveau de 0,0%, le gain de 3,0 dB, et l'obturateur de 35 ms ont été utilisés).
      3. Capturez l'image en cliquant sur le bouton "Image" dans la barre de menu. Capturer plusieurs images sur fond noir à faible grossissement, en plus de ceux à fort grossissement en changeant les objectifs de microscope, afin de fournir un contexte.
         REMARQUE: Capturez des images optiques au même grossissement que tous les cubes de données qui va être capturée avec l'appareil photo hyperspectrale, que ces images optiques ont tendance à avoir un plus grand champ de vision et une meilleure apparence esthétique pour une inspection visuelle plus tard. Il est essentiel que tout daTacUBE qui seront ensuite analysés spectralement utilisation grossissement cohérente, comme il est possible que la modification de l'objectif va modifier les spectres de transmission de l'optique du microscope, en changeant le spectre capturé, et réduisant ainsi la précision du mappeur de l'angle spectral (SAM). Si un cube de données est comparé à un autre cube de données obtenue avec un objectif différent, la fonction SAM ne peut pas fonctionner.
   4. Sélectionnez le détecteur d'imagerie de la caméra hyperspectrale en redirigeant le bouton de source de lumière sur le microscope à la caméra hyperspectrale. Si la lumière est dirigée vers la caméra hyperspectrale, aucune image sera affichée dans le logiciel de la caméra optique. Réduire mais ne fermez pas la fenêtre du logiciel d'imagerie optique, comme on peut en avoir besoin comme spécifié à l'étape 2.4.4.
4. Capture cubes de données
   1. Ouvrez le logiciel d'imagerie hyperspectrale pour l'acquisition des cubes de données IHV. Vérifiez que le guide de lumière est dirigée vers la caméra hyperspectrale.
   2. Ouvrir "HypMicroscope erspectral "dans la barre de menu et sélectionnez" Contrôles Microscope HSI ".
   3. Réglez le grossissement de l'objectif et le chemin de sauvegarde. Assurez-vous de nommer toutes les images et fichiers distinctement donc pas de l'écrasement se produit. Changer la capture de zone dans les paramètres en ajustant le champ de vision ou le nombre de lignes (720 lignes pour utiliser cette étude), avec une quantité importante de temps supplémentaire nécessaire pour capturer de grandes surfaces. Enfin, réglez le temps d'exposition (0,25 sec pour cette étude). Laissez tout le reste à défaut, et cliquez sur "Aperçu HSI" pour afficher l'image.
      Remarque: Le graphe d'intensité qui apparaît montre le cube de données HSI qui sera enregistrée sur l'axe horizontal. L'axe vertical représente les longueurs d'onde du spectre qui va être capturée dans le cube de données HSI. Plaçant le curseur sur une position quelconque sur le graphe d'intensité correspondant à une longueur d'onde spectrale provoque les intensités de tous les points à travers l'image, à cette longueur d'onde, à être montré.
   4. Ajuster l'intensité de cet aperçu en ajustant la luminosité de la source, d'un condenseur accent, ou en annulant l'aperçu pour ajuster le temps d'exposition. Ce dernier donne les meilleurs résultats, mais l'augmentation du temps d'exposition peut prendre plus de temps à l'image. L'objectif est que les pics les plus importants à être suffisamment grand, mais ne dépassant pas l'intensité maximale pour le détecteur; ici, la plage idéale se situe entre 1.000 et 16.000 unités.
   5. Cliquez sur "capture". Le microscope sera demander de prendre une image du courant d'obscurité. Rediriger la barre coulissante supérieure ou l'ouverture (avec soin, afin de ne pas perturber l'alignementet l'orientation de l'un des autres optiques), et cliquez sur "OK". Restaurer la barre de défilement ou de l'ouverture à la position correcte et cliquez sur "OK" quand invite à l'image apparaît. L'imagerie peut prendre jusqu'à 30 minutes, si les temps d'environ 5 min sont plus typiques. Prolongement de la durée de l'exposition au plomb un allongement des délais d'imagerie. Un indicateur de progression est présente. Soyez prudent de ne pas perturber physiquement la portée avant que l'indicateur de progression complète.
   6. Observez quatre nouvelles fenêtres avec les noms: "la liste des groupes disponibles", "# 1zoom", "# 1scroll" et "# 1 bande de RVB". Maximiser la fenêtre "# 1RGB de bande" comme cela est le cube de données pour toutes les références futures.
   7. Clic droit sur le cube de données et l'enregistrer comme un fichier TIFF et cliquez sur "OK". Si l'imagerie fini; mettre de côté tous les échantillons; nettoyer toutes les surfaces de pétrole exposée avec 70% d'isopropanol dans l'eau; élever stade à la hauteur maximale; condenseur inférieure à la hauteur minimale et la presse en position non-opérationnelle; fermeréteindre ou de débrancher la source de lumière, contrôleur de scène, et les caméras.

3. Création de référence spectrales bibliothèques

1. Sélection de renvoi Spectra
   1. Sélectionnez un contrôle positif qui est connu pour contenir le matériau d'intérêt contenues dans la même matrice que les échantillons expérimentaux, car les profils spectraux IHV sont matrice-dépendante.
      1. Pour cette étude, utiliser la peau de porc injecté de fortes doses de nanoparticules d'oxyde de métal que les contrôles positifs pour la comparaison avec le tissu de la peau de porc expérimentale à partir d'une étude sur l'exposition topique. Les profils spectraux des nanoparticules d'oxyde de métal en suspension ont été générés et examinés et jugés un contrôle positif inapproprié pour les échantillons expérimentaux histologiques en raison des différentes matrices.
   2. Obtenir un cube de données du contrôle positif comme décrit dans l'étape 2.4., En utilisant la caméra hyperspectrale.
      1. Soyez particulièrement prudent lorsque soiPrép l'intensité, comme cela est la métrique primaire par lequel le filtre à particules interne déterminera les matériaux. Tous les intensités supérieures au point de le détecteur (ici, 16.000 unités) se traduira par la saturation des données non valides (voir l'étape 2.4.5.).
   3. Faites un clic droit dans la fenêtre d'image, et à gauche cliquez sur "spectre Z-profil". Une Spectral fenêtre Profil de pop-up apparaîtra. Clic gauche sur des pixels d'intérêt sur le cube de données, en particulier les plus brillants ou ceux qui peuvent être identifiés en toute confiance comme représentant le matériau d'intérêt. Observez la fenêtre de profil spectral montrant le spectre associé. Prenez note en particulier de leur valeur la plus élevée et la plus basse et qui correspond à la longueur d'onde il.
      1. Lorsque l'arpentage de l'échantillon de contrôle positif, l'enquête en cliquant sur les régions d'intérêt qui sont très lumineux par rapport au tissu environnant, en particulier ceux avec des particules facilement identifiables. Ces particules sont plus susceptibles d'être la mèreEIAA d'intérêt, en particulier dans le cas des métaux.
   4. Utilisez la fonction "filtre à particules" sous le menu "Analyse de particules" pour identifier les particules présentes dans le cube de données. Dans la nouvelle fenêtre pop-up, observer la "Spectral Max doit dépasser". Cela sera déterminé par des observations à l'étape 3.1.3. Définir cette valeur si elle est supérieure à des pixels de fond, mais inférieure à celle des matériaux d'intérêt. Le "Données valides Max" est l'intensité maximale (ici, 16.000 unités).
      1. Laissez les autres paramètres par défaut, mais exclure les objets basés sur la taille en ajustant la case "Taille de seuil". Sauvegardez ces données soit à ce point, ou après l'exécution de l'analyse. Pour cette expérience, utiliser les paramètres suivants: Spectral Max doit dépasser: 5000; Données valides Max: 16.000; Seuil de Taille (pixels): 400. Une fois que tous les paramètres ont été définis, cliquez sur "OK".
   5. Observez le graphique obtenu avec les détails departicules détectées dans le seuil d'intensité indiqué; ces données peuvent être exportées. Si la longueur d'onde de réflexion maximale caractéristique du matériau d'intérêt est connue, sélectionner les particules qui ont une valeur similaire "Max WL"; sinon, cliquez sur "Sélectionner tout". Puis cliquez sur "Exporter"; "Pour Spectral Library". Choisissez un nom de fichier puis cliquez sur "OK".
2. Retirer Spectra Faux-positif
   1. Sélectionnez un échantillon qui servira de témoin négatif. Un tel échantillon doit avoir été préparée et traitée de la même manière que tous les échantillons expérimentaux étant entendu que l'absence de nanoparticules similaires ou identiques au matériau d'intérêt est garanti.
      NOTE: Il est important que la matrice du contrôle négatif est le même que la matrice des échantillons expérimentaux, que les profils spectraux IHV sont matrice-dépendante. Pour cette étude, nous avons utilisé la peau de porc qui n'a pas été exposé aux nanomatériaux d'oxyde métallique comme négatifcontrôles.
   2. Obtenir plusieurs cubes de données du contrôle négatif comme décrit dans l'étape 2.4.7, en utilisant la caméra hyperspectrale. Au moins un est requise, mais d'autres peuvent être capturés pour augmenter la sélectivité (ceci est particulièrement important dans le cas où certains des contaminants peut être dans le spectre de référence).
   3. Utilisez le logiciel d'imagerie hyperspectrale pour filtrer la bibliothèque spectrale recueillies dans l'étape 3.1 (contrôle positif) les uns contre les Datacube capturée à l'étape 3.2.2 (contrôles négatifs) en série, comme indiqué dans les étapes suivantes:
      REMARQUE: Save the, bibliothèque spectrale filtrée résultant dans un fichier séparé, et l'utiliser comme la bibliothèque spectrale de référence pour le matériau d'intérêt.
      1. Cliquez sur "filtre spectral Bibliothèque" dans le menu Analyse, situé sur la barre d'outils principale du programme. Cliquez sur "Ouvrir"; "Nouveau Fichier" et sélectionner la bibliothèque spectrale créé à l'étape 3.1. pour le contrôle positif que le fichier d'entrée. Cliquez sur "OK".
      2. Pour ela source xterne, sélectionnez "Image" sous la boîte Spectral données. Gardez les paramètres par défaut dans la boîte des paramètres de traitement. Sélectionnez un nom de sortie Pour filtrée Bibliothèque (ce devrait être différent de l'original, ou la bibliothèque spectrale cru collecté sera perdu). Cliquez sur "OK".
      3. Cliquez sur "Ouvrir"; "Nouveau Fichier" et sélectionner le premier cube de données capturée à l'étape 3.2.2 pour le contrôle négatif, lorsque vous êtes invité à sélectionner une image source.
         REMARQUE: Le logiciel va analyser la bibliothèque spectrale et retirer chaque spectre qui correspond à tout le spectre de la Datacube de contrôle négatif. Retrait de l'arrière-plan des critères de sélection réduit ainsi le potentiel pour faux-positifs. Un résumé sera disponible lorsque cela est fait (note que ce résumé ne sont pas automatiquement enregistrée).
      4. Si le filtrage supplémentaire est souhaitée, recommencer depuis l'étape 3.2.3.1, à l'exception: l'étape 3.2.3.2, sélectionnez la dernière bibliothèque spectrale filtrée créé (résultant après l'étape 3.2.3.3 co.mpletes); à l'étape 3.2.3.3, sélectionnez la prochaine Datacube de l'étape 3.2.2.
         REMARQUE: Correction et de normalisation pour le spectre de la lampe peuvent être nécessaires si les échantillons diffusent une quantité considérable de lumière (par exemple, les nanotubes de carbone) et / ou si les spectres zéro lors du filtrage reste une bibliothèque spectrale de contrôle positif contre un contrôle négatif. Ces circonstances ne se pose pas pour notre étude et ainsi de cette correction n'a pas été effectué.

4. Analyse d'image

1. Cartographie Spectral Angle
   1. Ouvrez le "Spectral Angle Mapper" (SAM) dans le menu spectrale, méthodes de cartographie sous-menu, en utilisant le logiciel d'imagerie hyperspectrale fois tous les cubes de données expérimentales ont été acquis suite à l'étape 2.4. L'angle mapper spectrale compare les spectres en analysant les changements dans géométriquement intensité en fonction de la longueur d'onde (par exemple, il compare les deux spectres en normalisant leur intensité et en comparant les angles recessaires pour tracer le graphique de chaque spectres) ^24.
   2. Avec le cube de données ouverte, sélectionnez le nom du cube de données expérimentale dans la fenêtre pop-up et cliquez sur "OK". Si aucun nom de fichier sont répertoriés, cliquez sur "ouvrir"; "Nouveau fichier", choisissez le cube de données expérimentale, puis cliquez sur "OK".
      1. Observez une nouvelle fenêtre pop-up appelé endmember Collection: SAM. Cliquez sur "Importer" dans la barre de menu, puis sélectionnez "de Spectral fichier de bibliothèque". Une fenêtre pop-up nommée fichier d'entrée Bibliothèque spectrale apparaîtra. Ouvrez la bibliothèque spectrale de référence qui a été créé à l'étape 3.2.3. et cliquez sur "OK". Observez une nouvelle fenêtre pop-up appelée "Input Spectral Library".
      2. Cliquez sur "Sélectionner tous les éléments"; cliquez sur "OK" clic droit sur "Couleur" et sélectionner "Appliquer des couleurs par défaut à tous." Cliquez sur "Sélectionner tout", suivie par "Appliquer" puis choisissez le nom d'un fichier de sortieD cliquez sur "OK". Le Spectral Angle Mapper prendra quelques secondes pour analyser et enregistrer les données.
   3. Ouvrez le cube de données dans le logiciel d'imagerie hyperspectrale. Sélectionnez "classification" dans le menu de superposition de la fenêtre d'image, puis accédez au nom de fichier et cliquez sur "OK". L'utilisateur peut maintenant superposer tout spectre de la bibliothèque pour voir où ils correspondent à l'image.
   4. Sélectionnez l'option "Fusionner classes" dans le menu d'option dans le "outil de classe interactive" a ouvert dans le menu Overlay dans la fenêtre d'image, si un schéma de couleurs unifié est souhaitable, comme pour faciliter l'analyse par un autre logiciel (comme décrit dans l'étape 4.2 .).
   5. Mettez en surbrillance toutes les classifications de combiner (en général, tout sauf "non classés" dans les "classes de fusionner dans la base" liste), et sélectionnez un spectre unique de la liste "de classe de base", puis cliquez sur "OK". Cette couleur va maintenant REPRESEnt tous les spectres sélectionné.
   6. Cliquez sur la couleur choisie et tous les spectres correspondant sera affiché dans cette couleur.
   7. Pour obtenir une image dichromatique qui vous montrera les spectres de correspondance sur un fond noir, cIiquez sur la boîte de couleurs "non classifiés", qui est noire par défaut. Observez une image dichromatique. Cette étape peut être inversé en cliquant à nouveau sur la boîte de couleurs "non classés".
   8. Faites un clic droit pour enregistrer l'image au format TIFF, y compris les superpositions actuellement actif.
      REMARQUE: Pour l'avenir le traitement d'imagerie, une image dichromatique sera utilisé.
   9. Sélectionnez "Classe distribution" dans le menu d'options dans la fenêtre "Outil Classe Interactive" d'acquérir les statistiques de cartographie. Ces données représentent le nombre de pixels étaient unmapped (non classés) et combien ont été identifiés comme le matériau d'intérêt. A noter que le nombre de pixels ne correspond pas avec le nombre de particules mappés. Ces informations ne sont pas automatiquement recorded.
2. Analyse particules dans hyperspectrale mappé Images
   1. Ouvrez les images dans le logiciel NIH ImageJ.
   2. Utilisez le menu Image, Réglez sous-menu, la fonction "seuil". Sélectionnez les paramètres qui différencient particules d'intérêt de tous les autres matériaux. Utilisez les paramètres de seuil suivants pour cette étude: la méthode de seuil par défaut, la couleur rouge, espace couleur TSL, vérifié fond sombre case à cocher, cases de passage vérifiés pour la teinte, la saturation et la luminosité.
      NOTE: Cela peut varier considérablement d'un cas à. Lors de l'analyse d'un cube de données mappé, cela peut être simplifiée par l'unification de toutes les classes pertinentes à une seule couleur et de superposer cette couleur avec toutes les couleurs non classés avant de générer l'image (étapes 4.1.4 à 4.1.8).
   3. Utilisez le menu Analyser, "analyser des particules", ce qui permet de récupérer des informations pour la zone, la moyenne, valeurs minimales et maximales. Pour cette étude, utiliser les paramètres ici: taille 0-infini, la circularité0-1, ne montrent rien, vérifier l'affichage des résultats case.
   4. Pour l'analyse statistique, exporter ces données vers un autre logiciel permettant la comparaison statistique avec le nombre et la taille des particules situées dans des échantillons de contrôle similaires. Nous suggérons d'utiliser un tableur pour l'analyse des données ImageJ. Les données affichées dans le tableau des résultats après l'étape 4.2.4 doivent être copiés sur une feuille de calcul. La fonction MAX peut être utilisé sur la première colonne (sans titre) pour déterminer le nombre de particules, tandis que la fonction MOYENNE peut être utilisé dans la colonne de la région pour déterminer la taille moyenne d'une particule. Dans l'avenir, la validation expérimentale sera poursuivi pour enquêter sur cette fonction dans la détermination de taille moyenne contre une norme établie pour le dimensionnement (par exemple, TEM).

Representative Results

Microscopie hyperspectrale est utile pour sa capacité à identifier les matériaux d'une manière similaire à la spectrophotométrie. Comme indiqué sur la figure 1, chaque matériau a plusieurs spectres caractéristique et une forme générale de sa réflectance, qui est unique. En outre, la figure 1 illustre la nature de la matrice dépendant des profils spectraux: les profils spectraux pour chacun des trois oxydes métalliques dans des échantillons de tissus histologiques (panneau supérieur) sont différents des profils spectraux pour chacun des trois oxydes métalliques, en suspension aqueuse ( panneau inférieur). En cartographiant les profils caractéristiques spectrales à des échantillons inconnus dans la même matrice, la technique est utile pour déterminer la présence ou l'absence d'un matériau, et peut également comparer semi-quantitative des quantités relatives de matière dans des échantillons.

Les bibliothèques spectrales de référence créées à partir d'échantillons de peau du contrôle positif sont appropriés pour la cartographie à l'expérimentaldes échantillons de peau. Comme on le voit sur ​​la figure 2, les bibliothèques de spectres de référence de localisation et les témoins positifs correspondant et ne correspondent pas à des témoins négatifs correspondants.

L'avantage le plus important de la technique est sa capacité à détecter de faibles niveaux de matières d'intérêt dans des échantillons, ainsi que pour les différencier des contaminants. . Par exemple, les nanotubes individuels peuvent être observées dans les poumons lors de l'inhalation des doses aussi faibles que 40 pg dans un 20-30 g rat ²⁵ la figure 3 illustre ce dans des échantillons histologiques de la peau: tandis que certaines particules sont facilement évidente dans l'image optique fond noir (colonne 2), d'autres sont détectés en utilisant l'imagerie hyperspectrale (colonne 3) qui aurait pu être interrompue en utilisant la microscopie en fond clair (colonne 1) ou d'autres méthodes. L'utilisation de HSI fond noir sert également à améliorer la spécificité sur la microscopie en fond clair simple. Ces images peuvent ensuite être soumis à des formes plus quantitatives d'analyse, nanalyse de particules otamment par ImageJ.

Microscopie sur fond noir amélioré a plusieurs applications différentes, même en l'absence d'imagerie hyperspectral. La première est sa capacité à générer de haute qualité, des images à contraste élevé. Ceci est mieux mise en évidence par la figure 3, dans laquelle les particules d'intérêt sont facilement identifiables par rapport à leurs homologues en fond clair. Ces images peuvent également être soumis à une analyse quantitative de particules, mais en l'absence de cartographie hyperspectrale, la prudence est nécessaire pour éviter de confondre une particule contaminant d'une particule d'intérêt.

Figure 1. Référence bibliothèques spectrales (matrice tissulaire) par rapport aux bibliothèques spectrales (nanoparticules en suspension). Ce chiffre démontre l'importance de générer une bibliothèque spectrale de référence à partir nanomaterials d'intérêt dans la même matrice que les échantillons expérimentaux. La première ligne montre la bibliothèque spectrale de référence (RSL) pour chaque matière dans cette étude (alumine, la silice et l'oxyde de cérium). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Cette RSL a été créé par la méthode décrite dans ce protocole, où des échantillons de tissu de contrôle positif ont été filtrés contre les échantillons négatifs de tissus de contrôle. La deuxième ligne montre les bibliothèques spectrales (SL) créés à partir des nanoparticules d'intérêt en suspension liquide sur une lame de verre. Pour l'alumine, un pic à des longueurs d'onde bimodal de 500 et 650 a été trouvé dans la RSL, tandis qu'un pic de plus et moins courbe caractéristique a été observée dans la suspension d'alumine NP SL à environ 600. Pour la silice, un pic à une longueur d'onde d'environ 650 était présent dans la RSL, alors un pic plus courbé et moins distinctif a été vu dans le NP de silice suspension SL à ArouND 600. Pour l'oxyde de cérium, un pic bimodal a été trouvé aux longueurs d'onde de 520 et 620 dans la RSL, alors un pic distinctif est moindre a été observée dans l'oxyde de cérium NP suspension SL à environ 560. Cela suggère que la matrice dans laquelle les infirmières praticiennes sont intégrées crée un changement dans les spectres qui peuvent être considérables lors de la sélection des contrôles pour créer le SL pour l'expérience aussi précis.

Figure 2. Référence bibliothèques spectrales (matrice tissulaire) mappés sur le contrôle positif et le contrôle négatif tissus de la peau de porc. Ce chiffre sert de confirmation des RSL, le cas échéant pour la cartographie d'échantillons expérimentaux, en ce que chaque RSL (colonne de gauche) correspond bien à son contrôle positif (colonne du milieu) correspondant et ne correspond pas à son contrôle négatif (colonne de droite) correspondant. S'il vous plaît cliquez havant pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3. hyperspectrale cartographie des tissus de la peau de porc expérimentale exposés à des nanoparticules d'oxyde de métal. Rangées de haut en bas correspondent aux différentes couches de la peau, du plus superficiel au plus profond couche: épiderme, le derme et tissu sous-cutané, respectivement. La première ligne montre la couche cornée de l'épiderme à partir d'un échantillon de peau qui a été exposée aux IP alumine en suspension; la deuxième rangée été exposés à la silice IP en suspension; et la troisième rangée de Ceria IP en suspension. Chaque colonne représente la même zone de la peau imagée avec des techniques différentes. La première colonne correspond à la microscopie en fond clair (40X mag .; barre d'échelle = 50 pm), où la zone inscrite dans un carré rouge a été agrandie (100X mag; barre d'échelle = 10 um) avec amélioré microscopie sur fond noir (EDFM) dans la deuxième colonne, où des flèches blanches pointent vers le haut contraste IP. La troisième colonne a été obtenue avec une caméra hyperspectrale (HSI), montrant les mêmes IP de contraste élevé (flèches blanches). EDFM et IHV images ont été prises à 100X; barre d'échelle = 10 um. La quatrième colonne montre l'image HSI mappé contre le RSL respectif pour chaque groupe d'exposition, où les IP alumine sont indiquées en vert, les IP de silice en rouge, et d'oxyde de cérium IP en jaune, respectivement. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Pour les échantillons de tissus qui ont subi coloration histologique classique, l'identification et l'analyse des nanoparticules d'oxyde de métal peuvent être atteints grâce à une combinaison de EDFM, cartographie HSI, et des techniques d'analyse d'images. Bien qu'il y ait une flexibilité dans la préparation d'échantillons pour l'histologie ou immuno-histochimie (par exemple, en utilisant des tissus fixes ou congelés; type de tache), il est important que les échantillons sont coupés à une épaisseur de 5 à 10 um pour une visualisation optimale. Les échantillons utilisés étaient ici fixés au formol et inclus en paraffine avant la coupe avec un microtome rotatif à 6 um d'épaisseur, monté sur des lames de microscope en verre, colorées à l'hématoxyline et à l'éosine et lamelle. Tissus de la peau porcine en provenance de l'ex vivo cutanée collaboration pénétration de toxicologie ont été utilisés pour cette étude. Les tissus ont été exposés à des nanoparticules d'oxyde de métal (alumine, silice, oxyde de cérium) dans des suspensions aqueuses. Détection de la région (s) d'intérêt (contraste élevé elements) avec EDFM est une première étape essentielle qui facilite ultérieure cartographie et l'analyse HSI. Échantillons de contrôle positifs et négatifs doivent être visualisés et analysés en premier afin de créer une bibliothèque spectrale pour référence. Les spectres collectés à partir du contrôle positif sont exportés vers une bibliothèque spectrale de contrôle positif. Ensuite, tous les spectres à partir des images de contrôle négatif est soustrait de la bibliothèque spectrale du contrôle positif afin d'améliorer la spécificité (réduire les faux positifs). La bibliothèque spectral filtré résultant est considéré comme le RSL qui sert à l'analyse des matériaux d'intérêt. Tous les échantillons de tissus sont soumis à un même processus de formation d'image sont mis en correspondance et contre la RSL. L'image résultante contiendra seulement dans des zones avec des éléments d'intérêt sur un fond noir. Cette image pourrait alors être analysé avec ImageJ en utilisant ses fonctions de seuil et d'analyse de particules pour obtenir la zone de particules cartographiés par champ de vision. Les données numériques obtenues à partir de ImageJ peuvent être exportationed à une feuille de calcul pour une analyse ultérieure.

Il est important de considérer que les échantillons biologiques sont intrinsèquement différents les uns des autres, et les méthodes de coloration peuvent affecter la visualisation par EDFM et HSI, les paramètres d'exposition doivent être déterminés conformément à ce que produit la meilleure image de contraste élevé pour un type spécifique de l'échantillon. Bien que la réduction des faux positifs peut être obtenue par la filtration de bibliothèques de spectres, il est crucial d'obtenir des témoins négatifs fiables qui ont évité la contamination par l'élément d'intérêt, comme des spectres correspondant à cette contamination pourrait être filtré à partir de la bibliothèque spectrale du contrôle positif , l'augmentation des taux de faux négatifs. En outre, la gamme d'intensité du spectre qui est détectable avec le logiciel d'imagerie hyperspectrale ne peut pas dépasser la limite du logiciel particulier (pour cette étude, qui est de 16.000 unités): zones avec un nombre élevé de particules accumulées qui produisent spectral intensités supérieures à la limite d'intensité sont laissés hors de la bibliothèque spectrale, en raison du risque d'augmenter le nombre de faux négatifs.

Bien que le système HSI confère de nombreux avantages par rapport aux méthodes traditionnelles, il ya quelques inconvénients et limitations à considérer. La première est que la grande quantité de données optiques recueillies peuvent nécessiter une puissance de calcul importante. Une autre est que HSI peut être temps-intensive, en particulier aux premiers stades lorsque les bibliothèques spectrales de référence sont en cours de création. En outre, le temps d'imagerie peut nécessiter plusieurs minutes par la capture d'image, ce qui rend plus lent que l'imagerie à fond noir simples; cependant, il est encore plus rapide que d'effectuer la préparation des échantillons et visualisation par microscopie électronique. En outre, les systèmes complexes peuvent entraîner de multiples spectres caractéristiques, qui nécessitent le développement des contrôles hautement spécialisés et font la mise en place de standards, bibliothèques de référence universelles difficiles ^26. Enfin, la technologieRésultats nique en résolution inférieure à celle des techniques Probe- ou microscopie électronique, telles que la microscopie à force atomique ou microscopie électronique en transmission, qui peuvent résoudre des atomes individuels. La résolution de cette technique est limitée en raison de sa nature photonique, ce qui l'empêche d'être un outil de haute précision pour la mesure des tailles de particules à l'échelle du nanomètre ou pour localiser précisément les matériaux à un niveau sous-micron. Bien que la technique peut être en mesure d'identifier des particules au sein de certains compartiments de tissus ou organites cellulaires supérieur à 1 pm (tels que des noyaux de cellules), petits organites ou caractéristiques sont difficiles à visualiser avec précision avec cette méthode. A noter également, compte tenu de sa résolution spatiale, cette méthode ne peut pas différencier entre les nanoparticules et simples agglomérats ^11.

D'autres considérations incluent: certains matériaux (comme les métaux nobles) ont une réflectance beaucoup plus élevé et profils spectrales distinctes, ce qui peut les rendre plus faciles à analyze et carte spectrale avec cet outil. D'autres, tels que les oxydes semi-métalliques étudiés dans cette étude et des nanomatériaux à base de carbone ^{24, 27,} peut-être plus difficile en raison de leur composition élémentaire, la forme, et en fonction de la matrice. Dans deux études d'inhalation murins par Mercer et al., Un système similaire à celui utilisé dans cette étude a été utilisé afin de localiser les nanotubes de carbone dans les poumons et dans les organes secondaires en fonction de leur remarquablement élevé contraste avec les tissus environnants. Cependant, la cartographie hyperspectrale n'a pas été démontrée dans deux études, probablement parce que la forme unique de fibres de carbone était un trait suffisante pour une identification. Une autre considération a trait spécifiquement aux tissus: depuis le dépôt de nanoparticules d'intérêt à des organes spécifiques à travers des processus biophysiques normales est imprévisible (et souvent elle-même l'objet de l'étude), la détermination d'un contrôle positif applicable peut être difficile et exige un examen de la façon dont la génération de la commande might affecter l'état d'un matériau d'intérêt. Par exemple, si une bibliothèque spectrale est créée à partir de nanoparticules cristallines d'intérêt, il peut être difficile de cartographier la bibliothèque pour ces mêmes nanoparticules dans les tissus ou cellules en raison de changements dans les spectres résultant de l'altération de la particule (par exemple, en raison de changer le pH, la dissolution, l'agglomération, la liaison aux protéines) et le micro-environnement global ou matrice. Enfin, la technique est limitée par sa nature semi-quantitative: il peut seulement être aussi quantitative que d'autres techniques de microscopie à deux dimensions de la résolution semblable, ce qui signifie qu'il ne peut pas être facilement utilisé pour réaliser des tâches telles que la caractérisation de la charge d'organes totale d'un matériau.

Dans l'ensemble, EDFM HSI et fournissent plusieurs avantages par rapport nanomatériau imagerie et de caractérisation des techniques classiques, telles que TEM, et HAADF DIC. EDFM / HSI permet plus rapide acquisition et d'analyse d'image, ce qui permet d'économiser du temps et de coût par rapport aux conven plus intensivetechniques supplémentaires. En outre, la préparation de l'échantillon pour EDFM / IHV est généralement à la fois minimale et non destructive, ce qui économise du temps et permet également une analyse plus souple d'un échantillon donné, car il peut alors être utilisé pour d'autres techniques. En outre, HSI est souple, ce qui permet l'analyse des matériaux à l'échelle nanométrique de nombreuses compositions et dans une variété de matrices. L'équipe de recherche travaille à affiner la méthode décrite ici pour d'autres matériaux et les types d'échantillons, y compris une évaluation en profondeur de la spécificité de la technologie. Une prochaine étape cruciale sous enquête par l'équipe de recherche est la validation de ces techniques par rapport aux normes d'or traditionnelles (par exemple, Raman, TEM, SEM) pour les matériaux et les types d'intérêt de tissus.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CytoViva 150 Unit (condenser)	CytoViva (Auburn, AL)		mounted to Olympus BX43 microscope
Olympus BX43 Microscope - Analyzer Slot - HSI with 10x and 40x air objectives and 100X oil immersion objective	obtained through CytoViva (Auburn, AL)		for use with CytoViva 150 Unit condenser
Dagexcel-M Digital Firewire Camera - Cooled; includes Exponent 7 software	obtained through CytoViva (Auburn, AL)		enhanced darkfield camera and software
CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software	obtained through CytoViva (Auburn, AL)		hyperspectral camera and software
cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides)	Schott NEXTERION	1025087	reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging
cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22 mm x 22 mm x  1.45 mm)	Schott NEXTERION	custom	reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging
type A microscopy immersion oil	Fisher Scientific	12368B	multiple suppliers
70% isopropanol in water			multiple suppliers
ImageJ software	National Institutes of Health (NIH)		free open-source software online download
metal oxide nanoparticles	supplied to the research team by industrial partners		alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed.