Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.
Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.
Aangezien nanomaterialen steeds meer worden toegepast in een verscheidenheid van industrieën en toepassingen bestaat er een behoefte nanoschaal beeldvorming en karakterisatie methoden die sneller, betaalbaar en gemakkelijker dan traditionele wijze, zoals elektronen microscopie. Aan nanodeeltjes (NP) interacties met cellen, weefsels en levende systemen, veel optische technieken zijn toegepast, met inbegrip van differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie 1 en evanescent veld gebaseerde benaderingen, zoals de totale interne reflectie (TIR) of bijna-visualiseren veld scanning optische microscopie (NSOM) 2,3. Echter, deze zijn high-end analytische benaderingen, buiten het bereik van de meeste niet-gespecialiseerde laboratoria 4. Elektronenmicroscopie, zoals transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), werd ook gebruikt om NP interactie met cellen 5,6,7,8 bestuderen. High angle ringvormige donkerveld (HAADF) scanning transmissie elektronenmicroscopie werd gebruikt om de interactie te bestuderen van NPs9 met virussen. Confocale microscopie is een populaire techniek om NP-10 cel interacties te bestuderen.
De laatste jaren hebben donkerveld-gebaseerde hyperspectrale (HSI) technieken gebruikt als veelbelovend analytisch instrument voor het bestuderen van NP in biologische matrices 11. HSI generen een driedimensionale representatie van ruimtelijke en spectrale data, bekend als hypercube of datacube 12. De ruimtelijke kaart van de spectrale variatie wordt gebruikt voor materiaal identificatie. Spectrale profielen van bekende materialen kunnen worden geproduceerd en gebruikt als referentie bibliotheken ter vergelijking met onbekende monsters. Een van de grote voordelen HSI systemen is de mogelijkheid om beeldvorming te combineren met spectroscopie door aldus de plaats en verdeling van onbekende NPs in vivo of ex vivo en koppeling aan andere referentie deeltje bekende, soortgelijke samenstelling.
Er zijn verscheidene voordelenmet behulp van HSI systemen ten opzichte van conventionele beeldvormende technieken: minimaal monster voorbereiding is vereist; monstervoorbereiding is meestal niet-destructief van aard; beeldacquisitie en analyse is sneller; de techniek is kosteneffectief 13; en de ruimtelijke verdeling en analyse van verbindingen met gemengde samenstelling en / of in complexe matrices wordt gemakkelijker bewerkstelligd 14.
Voor nanomaterialen onderzoek waarbij kostbare monsters, een van de belangrijkste overwegingen is de beschikbaarheid van een niet-destructieve beeldvorming, die toelaat de mogelijkheid om herhaaldelijk monsters van één of meer methoden onderzocht. Herhaalde of meervoudige analyses kan gewenst uitgebreide datasets die niet beschikbaar zou zijn van een methode te ontwikkelen. Om dit verband, het bestuderen van de optische eigenschappen is de veiligste manier om het monster te analyseren. Door een verbeterde donkerveld microscoop (EDFM) en HSI systeem om de optische respons van het monster te bestuderen – namelijk Reflectance, maar ook de absorptie en doorlaatbaarheid – feature identificatie en karakterisering kan worden uitgevoerd 15. Mogelijke eindpunten omvatten karakterisering evaluatie van de relatieve afmeting en vorm van nanodeeltjes of agglomeraten en distributie van nanodeeltjes in een monster.
In dit artikel beschrijven we in kaart brengen van methoden specifiek voor metaaloxide nanodeeltjes in post-mortem weefsel met behulp van een HSI-systeem op basis van een aangeduid als een spectrale hoek Mapper (SAM) pixel-spectrale wedstrijd algoritme. We kozen voor deze specifieke toepassing, omdat het de potentie heeft in vivo nanotoxicologie onderzoek, waarbij de dierlijke modellen worden gebruikt om de gevolgen voor de gezondheid van blootstelling aan technisch vervaardigde nanomaterialen te evalueren de huidige en toekomstige aan te vullen. De toepassing van deze methode zou ook nanoschaal drug delivery onderzoek dat weefsel of dierlijke modellen gebruik maakt van op de hoogte. Vooral nanodeeltjes absorptie, distributie, metabolisme en excretie gedurende organs en weefsels kunnen worden onderzocht met dit systeem. Een grote verscheidenheid van toepassingen worden onderzocht voor toepassing bij biomedisch onderzoek 11.
Deze methode kan worden gebruikt voor de beoordeling van verschillende biologische monsters (bijvoorbeeld verschillende soorten weefsels, bronchoalveolaire lavage monsters en bloed uitstrijkjes) die zijn blootgesteld aan nanodeeltjes van verschillende elementaire samenstellingen 16-19. Bovendien is deze werkwijze nuttig voor het bestuderen van nanodeeltjes biodistributie in vivo en in vitro, die relevant is voor nanoschaal geneesmiddelafgifte studies 11. Beyond biologische monsters kunnen EDFM en HSI worden om nanodeeltjes in milieumonsters zoals afvalwater 20 evalueren. Beroepsmatige blootstelling kan worden vergemakkelijkt door het gebruik van deze techniek ook, omdat het kan worden gebruikt om de werkzaamheid van persoonlijke beschermingsmiddelen voorkomen nanodeeltjes penetratie evalueren. Verder onderzoek teAM ontwikkelt momenteel een soortgelijke EDFM en HSI protocol voor de evaluatie van de filter media monsters van nanodeeltjes verzameld van beroepsmatige blootstelling assessments. Terwijl de bereiding van deze verschillende types monster EDFM en HSI kan variëren, is het belangrijk dat zij worden bereid zodanig dat zij gemakkelijk kunnen worden gevisualiseerd door het optische systeem. Gewoonlijk moet het monster opgesteld alsof het zou worden gevisualiseerd via traditionele helderveld microscopie. Er zijn verschillende hyperspectrale beeldvormende systemen in de handel verkrijgbaar 11.
Voor weefselmonsters die conventionele histologische kleuring, de identificatie en analyse van metaaloxide nanodeeltjes hebben ondergaan, kan worden bereikt door een combinatie van EDFM, HSI mapping en beeldanalyse technieken. Hoewel flexibel wordt monstervoorbereiding voor histologie en immunohistochemie (bijvoorbeeld via vaste of bevroren weefsels type vlek), is het belangrijk dat de monsters worden coupes met een dikte van 5-10 urn optimale visualisatie. Monsters die hier gebruikt werden in formaline gefixeerd en in paraffine ingebed voorafgaand aan snijden met een roterende microtoom tot 6 pm dikte aangebracht op glazen microscoopglaasjes, gekleurd met hematoxyline en eosine en afgedekt. Varkenshuid weefsel van een ex vivo huidpenetratie toxicologische samenwerking werden gebruikt voor deze studie. De weefsels werden blootgesteld aan metaaloxide nanodeeltjes (alumina, silica, ceria) in waterige suspensies. Detectie van de regio ('s) van belang (hoog contrast elemeNTS) met EDFM is een belangrijke eerste stap die de daaropvolgende HSI in kaart brengen en analyseren vergemakkelijkt. Positieve en negatieve controlemonsters worden afgebeeld en eerst geanalyseerd om een spectrale bibliotheek te creëren voor referentie. De verzamelde spectra van de positieve controle worden uitgevoerd naar een positieve controle spectrale bibliotheek. Vervolgens worden alle spectra van de negatieve controle beelden worden afgetrokken van de spectrale bibliotheek van de positieve controle in om specificiteit te verbeteren (vermindering van valse positieven). De resulterende gefilterde spectrale bibliotheek wordt beschouwd als RSL dat dient voor de analyse van materialen van belang. Alle weefselmonsters ondergaan dezelfde imaging proces en worden in kaart gebracht tegen de RSL. Het resulterende beeld zal alleen gebieden met elementen van rente over een zwarte achtergrond bevatten. Deze afbeelding kan vervolgens worden geanalyseerd met behulp van de ImageJ drempel en deeltjes analysefuncties het gebied toegewezen deeltjes per veld te verkrijgen. Numerieke data verkregen uit ImageJ kan export wordened naar een spreadsheet voor verdere analyse.
Het is belangrijk om te overwegen dat als biologische monsters zijn inherent verschillend van elkaar, en vlekken methoden kunnen visualisatie beïnvloeden door middel van EDFM en HSI, de belichting moet worden in overeenstemming met wat het beste beeld met hoog contrast produceert voor een specifiek type van het monster bepaald. Hoewel de reductie van valse positieven kan worden bereikt door de filtratie van spectrale bibliotheken, is het cruciaal om betrouwbare negatieve controles die verontreiniging vermeden met het element van belang te verkrijgen, aangezien de spectra overeenstemmen met deze vervuiling zou kunnen worden gefilterd uit spectrale bibliotheek de positieve controle van , het verhogen van vals-negatieve tarieven. Ook kan het spectrum intensiteit bereik dat detecteerbaar is met de hyperspectrale imaging software niet de limiet van de specifieke software overtreffen (voor dit onderzoek, dat is 16.000 eenheden): gebieden met een groot aantal van geaccumuleerde deeltjes die sp producerenectral intensiteiten boven het maximum intensiteit worden weggelaten uit de spectrale bibliotheek, vanwege het risico van het verhogen van het aantal valse negatieven.
Terwijl de HSI systeem geeft veel voordelen boven traditionele methoden, zijn er een aantal nadelen en beperkingen te overwegen. Een daarvan is dat de grote hoeveelheid optische verzamelde gegevens kunnen aanzienlijk rekenvermogen nodig. Een andere is dat HSI tijdsintensief kan zijn, vooral in het begin stadia als referentie spectrale bibliotheken worden gecreëerd. Ook kan imaging tijd enkele minuten per beeldopname nodig, waardoor het langzamer dan eenvoudige Darkfield beeldvorming; Het is echter nog steeds sneller dan uitvoeren monsterbereiding en visualisatie door elektronenmicroscopie. Bovendien kunnen complexe systemen in meerdere karakteristieke spectra, die de ontwikkeling van zeer gespecialiseerde controles vereisen en maakt de instelling van gestandaardiseerde, universele referentie bibliotheken moeilijk 26. Ten slotte is de technique resulteert in lagere resolutie dan probe- of elektronen-microscopie technieken zoals atomaire kracht microscopie en transmissie elektronenmicroscopie, waarmee afzonderlijke atomen kunnen oplossen. Resolutie van deze techniek is beperkt als gevolg van de fotonische natuur, die voorkomt dat het een hoge precisie instrument voor het meten van deeltjesgrootte op de nanometer niveau of voor het nauwkeurig lokaliseren van materialen op een sub-micron niveau. Hoewel de techniek in staat zijn om deeltjes binnen bepaalde weefselcompartimenten of cellulaire organellen lokaliseren groter dan 1 urn (zoals celkernen), kleinere organellen of toevoegingen uitdagend om nauwkeurig te visualiseren met deze methode. Ook van belang, gezien de ruimtelijke resolutie, kan deze methode geen onderscheid maken tussen enkele nanodeeltjes en agglomeraten 11.
Andere overwegingen omvatten: bepaalde materialen (bijvoorbeeld edelmetalen) veel hogere reflectie en verschillende spectrale profielen, die ze gemakkelijker te AnalyZe en spectraal kaart met deze tool. Anderen, zoals semi-metallische oxides onderzocht in deze studie en op koolstof gebaseerde nanomaterialen 24, 27 kan moeilijker zijn vanwege hun elementaire samenstelling, vorm, en afhankelijk van de matrix. In twee muizen inhalatie studies van Mercer et al., Een soortgelijk systeem met degene die in deze studie werd gebruikt om de koolstof nanobuisjes vinden in de longen en het afgeleide organen op basis van hun opvallend hoog contrast met omringende weefsels. Toch werd hyperspectrale mapping niet aangetoond in beide studies, waarschijnlijk omdat de unieke vorm van koolstofvezels was voldoende trait identificatie. Een andere overweging betreft specifiek aan weefsels: sinds deponeren nanodeeltjes van belang zijn voor specifieke organen via de normale biofysische processen onvoorspelbaar is (en vaak zelf het onderwerp van studie), kunnen bepalen van een toepasselijke positieve controle moeilijk en vereist een afweging van hoe generatie van de controle might invloed op de toestand van een materiaal van belang. Bijvoorbeeld, wanneer een spectrale bibliotheek wordt gemaakt van ongerepte nanodeeltjes plaats, kan het moeilijk zijn om de bibliotheek om diezelfde nanodeeltjes in weefsels of cellen kaart als gevolg van veranderingen in de spectra gevolg van wijziging van de deeltjes (bijvoorbeeld door verandering pH, ontbinding agglomeratie eiwitbinding) en de totale micro of matrix. Tenslotte is de techniek beperkt de semi-kwantitatieve aard: het kan alleen kwantitatief andere tweedimensionale microscopietechnieken soortgelijke oplossing, wat betekent dat het niet gemakkelijk worden gebruikt om taken uit te voeren zoals kenmerkend totaal orgaan last van een materiaal.
Kortom, EDFM en HSI bieden verschillende voordelen ten opzichte van conventionele nanomaterialen beeldvorming en karakterisatie technieken, zoals TEM, HAADF en DIC. EDFM / HSI zorgt voor een snellere beeldverwerking acquisitie en analyse, die tijd en kosten bespaart in vergelijking met een intensiever conventionele technieken. Bovendien monstervoorbereiding voor EDFM / HSI typisch zowel minimaal en non-destructief, wat tijd bespaart en ook flexibeler analyse van een gegeven monster omdat dan kan worden gebruikt voor andere technieken. Voorts HSI is veelzijdig, waardoor analyse van nanomaterialen vele samenstellingen en in diverse matrices. Het onderzoeksteam werkt aan de hier beschreven voor andere materialen en soorten monsters, met inbegrip van een grondige evaluatie van de specificiteit van de technologie methode te verfijnen. Een kritische volgende stap in onderzoek door het onderzoeksteam is de validatie van deze technieken tegen de traditionele gouden standaard (bijv Raman, TEM, SEM) voor de materialen en de soorten weefsel van belang.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Günter Oberdörster, DVM, PhD and Alison Elder, PhD (University of Rochester) and Mary Frame, PhD (Stony Brook University) for animal research collaborations resulting in tissue samples for analysis. Additionally, the authors thank: Christina Rotondi (Albany Medical College Histology Core); Rani Sellers, DVM, PhD and Barbara Cannella, PhD (Albert Einstein College of Medicine Histology and Comparative Pathology Facility); Leonardo Bezerra and Ahlam Abuawad (Brenner research team members); and Leslie Krauss, Byron Cheatham and Elyse Johnson (CytoViva). This work was supported in part by CDC-NIOSH grant OH-009990-01A1 and the NanoHealth and Safety Center, New York State, awarded to S.B.
CytoViva 150 Unit (condenser) | CytoViva (Auburn, AL) | mounted to Olympus BX43 microscope | |
Olympus BX43 Microscope – Analyzer Slot – HSI with 10x and 40x air objectives and 100x oil immersion objective | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | for use with CytoViva 150 Unit condenser | |
Dagexcel-M Digital Firewire Camera – Cooled; includes Exponent 7 software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | enhanced darkfield camera and software | |
CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | hyperspectral camera and software | |
cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides) | Schott NEXTERION | 1025087 | reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging |
cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22mm x 22mm x 1.45mm) | Schott NEXTERION | custom | reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging |
type A microscopy immersion oil | Fisher Scientific | 12368B | multiple suppliers |
70% isopropanol in water | multiple suppliers | ||
ImageJ software | National Institutes of Health (NIH) | free open-source software online download | |
metal oxide nanoparticles | supplied to the research team by industrial partners | alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed. |