Identificatie van Metal Oxide Nanodeeltjes in histologische monsters door Enhanced Darkfield Microscopie en hyperspectrale Mapping

Introduction

Aangezien nanomaterialen steeds meer worden toegepast in een verscheidenheid van industrieën en toepassingen bestaat er een behoefte nanoschaal beeldvorming en karakterisatie methoden die sneller, betaalbaar en gemakkelijker dan traditionele wijze, zoals elektronen microscopie. Aan nanodeeltjes (NP) interacties met cellen, weefsels en levende systemen, veel optische technieken zijn toegepast, met inbegrip van differentiële interferentie contrast (DIC) microscopie ^{1 en} evanescent veld gebaseerde benaderingen, zoals de totale interne reflectie (TIR) ​​of bijna-visualiseren veld scanning optische microscopie (NSOM) ^2,3. Echter, deze zijn high-end analytische benaderingen, buiten het bereik van de meeste niet-gespecialiseerde laboratoria ^4. Elektronenmicroscopie, zoals transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), werd ook gebruikt om NP interactie met cellen ^5,6,7,8 bestuderen. High angle ringvormige donkerveld (HAADF) scanning transmissie elektronenmicroscopie werd gebruikt om de interactie te bestuderen van NPs⁹ met virussen. Confocale microscopie is een populaire techniek om ^NP-10 cel interacties te bestuderen.

De laatste jaren hebben donkerveld-gebaseerde hyperspectrale (HSI) technieken gebruikt als veelbelovend analytisch instrument voor het bestuderen van NP in biologische matrices ^11. HSI generen een driedimensionale representatie van ruimtelijke en spectrale data, bekend als hypercube of datacube ^12. De ruimtelijke kaart van de spectrale variatie wordt gebruikt voor materiaal identificatie. Spectrale profielen van bekende materialen kunnen worden geproduceerd en gebruikt als referentie bibliotheken ter vergelijking met onbekende monsters. Een van de grote voordelen HSI systemen is de mogelijkheid om beeldvorming te combineren met spectroscopie door aldus de plaats en verdeling van onbekende NPs in vivo of ex vivo en koppeling aan andere referentie deeltje bekende, soortgelijke samenstelling.

Er zijn verscheidene voordelenmet behulp van HSI systemen ten opzichte van conventionele beeldvormende technieken: minimaal monster voorbereiding is vereist; monstervoorbereiding is meestal niet-destructief van aard; beeldacquisitie en analyse is sneller; de techniek is kosteneffectief ^13; en de ruimtelijke verdeling en analyse van verbindingen met gemengde samenstelling en / of in complexe matrices wordt gemakkelijker bewerkstelligd ^14.

Voor nanomaterialen onderzoek waarbij kostbare monsters, een van de belangrijkste overwegingen is de beschikbaarheid van een niet-destructieve beeldvorming, die toelaat de mogelijkheid om herhaaldelijk monsters van één of meer methoden onderzocht. Herhaalde of meervoudige analyses kan gewenst uitgebreide datasets die niet beschikbaar zou zijn van een methode te ontwikkelen. Om dit verband, het bestuderen van de optische eigenschappen is de veiligste manier om het monster te analyseren. Door een verbeterde donkerveld microscoop (EDFM) en HSI systeem om de optische respons van het monster te bestuderen - namelijk Reflectance, maar ook de absorptie en doorlaatbaarheid - feature identificatie en karakterisering kan worden uitgevoerd ^15. Mogelijke eindpunten omvatten karakterisering evaluatie van de relatieve afmeting en vorm van nanodeeltjes of agglomeraten en distributie van nanodeeltjes in een monster.

In dit artikel beschrijven we in kaart brengen van methoden specifiek voor metaaloxide nanodeeltjes in post-mortem weefsel met behulp van een HSI-systeem op basis van een aangeduid als een spectrale hoek Mapper (SAM) pixel-spectrale wedstrijd algoritme. We kozen voor deze specifieke toepassing, omdat het de potentie heeft in vivo nanotoxicologie onderzoek, waarbij de dierlijke modellen worden gebruikt om de gevolgen voor de gezondheid van blootstelling aan technisch vervaardigde nanomaterialen te evalueren de huidige en toekomstige aan te vullen. De toepassing van deze methode zou ook nanoschaal drug delivery onderzoek dat weefsel of dierlijke modellen gebruik maakt van op de hoogte. Vooral nanodeeltjes absorptie, distributie, metabolisme en excretie gedurende organs en weefsels kunnen worden onderzocht met dit systeem. Een grote verscheidenheid van toepassingen worden onderzocht voor toepassing bij biomedisch onderzoek ^11.

Deze methode kan worden gebruikt voor de beoordeling van verschillende biologische monsters (bijvoorbeeld verschillende soorten weefsels, bronchoalveolaire lavage monsters en bloed uitstrijkjes) die zijn blootgesteld aan nanodeeltjes van verschillende elementaire samenstellingen ^16-19. Bovendien is deze werkwijze nuttig voor het bestuderen van nanodeeltjes biodistributie in vivo en in vitro, die relevant is voor nanoschaal geneesmiddelafgifte studies ^11. Beyond biologische monsters kunnen EDFM en HSI worden om nanodeeltjes in milieumonsters zoals afvalwater ²⁰ evalueren. Beroepsmatige blootstelling kan worden vergemakkelijkt door het gebruik van deze techniek ook, omdat het kan worden gebruikt om de werkzaamheid van persoonlijke beschermingsmiddelen voorkomen nanodeeltjes penetratie evalueren. Verder onderzoek teAM ontwikkelt momenteel een soortgelijke EDFM en HSI protocol voor de evaluatie van de filter media monsters van nanodeeltjes verzameld van beroepsmatige blootstelling assessments. Terwijl de bereiding van deze verschillende types monster EDFM en HSI kan variëren, is het belangrijk dat zij worden bereid zodanig dat zij gemakkelijk kunnen worden gevisualiseerd door het optische systeem. Gewoonlijk moet het monster opgesteld alsof het zou worden gevisualiseerd via traditionele helderveld microscopie. Er zijn verschillende hyperspectrale beeldvormende systemen in de handel verkrijgbaar ^11.

Protocol

Dier protocollen werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite aan de onderzoekers 'samenwerkende instelling, Stony Brook University. Een lijst van specifieke materialen en apparatuur gebruikt voor dit document is te vinden in tabel 1.

1. Monstervoorbereiding Weefsels

1. Bereid dierlijke weefsels blootgesteld aan metaaloxide nanodeeltjes voor histologische en immunohistochemische kleuring volgens eerder beschreven werkwijzen ^21-23.

2. Imaging

1. Initialiseren van de microscoop
   LET OP: Voor deze studie werd een onderzoek graad microscoop gebruikt, uitgerust met een high-performance darkfield lichtbron, gemotoriseerde XY podium controller, 14-bit diepte hyperspectrale camera, en meerdere objectieven (10x lucht, 40X lucht, 100x olie-immersie) . Het systeem hier wordt gebruikt heeft een 64 nm ruimtelijke resolutie op 100X (olie-immersie) vergroting. De condensor voor deze study heeft zowel Koehler en kritische verlichting functies en richt een zeer gecollimeerd licht op schuine hoeken op het monster.
   1. Plug in en zet de lichtbron, XY podium controller, optische camera (voor donkerveld imaging), hyperspectrale camera en computer-systeem. Stel de lichtbron tot 75% energie; verhogen het podium om maximale hoogte; Sluit de lichtgeleider naar de condensor voor donkerveld versterkte beeldvorming of de collimator aan de achterkant van de microscoop voor gereflecteerde helderveld beeldvorming.
      OPMERKING: Door het instellen van de lichtbron tot 75% vermogen, is er voldoende, gelijkmatige verlichting van alle pixels binnen het gehele gebied van mening dat saaier pixels verbetert terwijl u toch voor het contrast tussen saai en heldere pixels.
   2. Verhoog de condensor werkpositie. Solliciteer 3-5 druppels van het type-A immersie olie op de condensor lens voorzichtig, het vermijden van de vorming van eventuele luchtbellen. Veeg de olie en opnieuw, als belletjes moeten vormen.
   3. Plaats de dia on het podium. Langzaam verhogen de condensor tot de immersie olie contact maakt met de glijbaan. Deze merkbaar door het snel helderder ring van belichting waarbij de olie in contact komt met de schuif zijn.
2. Zet de 10X objectief op zijn plaats. Focus en lijn de condensor door onderzoek door de oculairs.
   1. Verplaats het podium op en neer via de grove objectieve focusknop totdat helderheid wordt gemaximaliseerd.
   2. Verplaats de condensor zich richten op en neer via de condensor regelknop tot de maximale helderheid is gevonden. Probeer de helderste centrale plek mogelijk het gezichtsveld te creëren.
   3. Stel de condensor aanpassing knoppen die nodig zijn om de blaar centreren, indien nodig.
   4. Gebruik de fijne doel aandacht knop om de heldere vlek in beeld te brengen. Bij het wijzigen van de doelstellingen om een ​​andere vergrotingsfactor te verkrijgen, past de focus vliegtuig. Bij het gebruik van de 100X doelstelling, breng dan een druppel immersie olie over het dekglaasje om th verbeterene beeld en schade aan de objectieflens voorkomen.
3. Vastleggen Afbeeldingen
   1. Gebruik podium controller naar een regio van belang te vinden. Dit gebied wordt bepaald door de behoeften van het experiment. Een typische indicator hoog contrast met de omliggende regio's, als gebieden overgoten met metaaloxide nanodeeltjes lijken vaak helderder dan gebieden zonder hen.
   2. Breng de regio in beeld met behulp van de fijne doel focusknop, het aanpassen van de condensor focus als nodig is om de verlichting in evenwicht. Het bereiken van een hoog contrast, goed gedefinieerde gebied binnen het gezichtsveld.
   3. Bepaal welke beelden (voor de optische camera) of datacubes (de hyperspectrale camera) wordt vastgelegd, en in welke volgorde. Gewoonlijk worden optische beelden verkregen met een 10x lucht doelstelling, 40X lucht objectieve en 100x olie-immersie objectief en een overeenkomstige HSI datacube met een 100x olie-immersie objectief.
      1. Open de optische imaging software. Klik op "Instellingen &# 8221; in de menubalk. Selecteer de "Image Capture knop voor capture event". Selecteer de opgeslagen beeldformaat (TIFF werd gebruikt voor dit experiment); wijs een bestandsnaam; bladeren en selecteer een map opgeslagen afbeelding; houden standaard timelapse; klik op "OK".
      2. Selecteer de belichtingsinstellingen die afbeelding het hoogste contrast te creëren in het menu "Exposure" (voor deze studie, een niveau van 0,0%, winst van 3,0 dB, en de sluiter van 35 ms werden gebruikt).
      3. Leg het beeld door te klikken op de "Image" knop in de menubalk. Leg verscheidene lage vergroting donkerveld afbeeldingen naast de enorme vergroting door het veranderen van de microscoop doelstellingen om context te verschaffen.
         OPMERKING: Leg optische beelden met dezelfde vergroting als elk datacubes die wordt vastgelegd met de hyperspectrale camera, zoals deze optische beelden neiging om een ​​groter gezichtsveld en een beter esthetisch uiterlijk voor latere visuele inspectie hebben. Het is essentieel dat DATACubes dat later spectraal geanalyseerd worden gebruikt in overeenstemming vergroting, aangezien het mogelijk is dat het veranderen van de doelstelling zal de transmissie spectra van de optische microscoop, veranderen de gevangen spectra en daarmee de nauwkeurigheid van de spectrale hoek mapper (SAM) reduceren veranderen. Als men datacube wordt vergeleken met een andere datacube verkregen met een andere doelstelling, kan de SAM functie niet.
   4. Selecteer de hyperspectrale camera beelddetector door heroriëntering van de lichtbron knop op de microscoop om de hyperspectrale camera. Als het licht is gericht op de hyperspectrale camera, zal er geen beeld wordt weergegeven in de optische camera software. Minimaliseren maar de optische beeldverwerkingssoftware venster niet, zoals men het nodig heeft zoals gespecificeerd in stap 2.4.4.
4. Vastleggen Datacubes
   1. Open de hyperspectrale imaging software voor de verwerving van HSI datacubes. Zorg ervoor dat de lichtgeleider is gericht op de hyperspectrale camera.
   2. Open "Hyperspectral Microscoop "in de menubalk en selecteer" HSI Microscope Controls ".
   3. Stel de doelstelling vergroting en het opslaan pad. Zorg ervoor dat alle beelden en bestanden opvallend dus geen overschrijven optreedt noemen. Verander het gebied opname in instellingen door aanpassing van het gezichtsveld of aantal lijnen (720 lijnen gebruikt voor deze studie), met een aanzienlijke hoeveelheid extra tijd vereist voor het vastleggen grotere gebieden. Tot slot stelt u de belichtingstijd (0.25 sec voor deze studie). Laat de rest om de standaardinstellingen en klik op "Preview HSI" om de afbeelding te bekijken.
      Opmerking: De intensiteit grafiek die verschijnt toont HSI datacube dat de horizontale as wordt opgenomen. De verticale as geeft de golflengte van de spectra die worden meegenomen in de HSI datacube. De cursor op elke positie op de intensiteit grafiek overeenkomt met een spectrale golflengte veroorzaakt dat de intensiteiten van alle locaties in het beeld, bij die golflengte, worden weergegeven.
   4. Stel de intensiteit van deze voorvertoning door het aanpassen van de helderheid van de bron, condensor focus, of door het annuleren van de voorvertoning om de belichting aan te passen. De laatste levert de beste resultaten, maar verhoogde blootstelling tijd kan langer duren om de afbeelding. Het doel is voor de meer significante pieken voldoende groot, maar niet meer dan de maximale intensiteit van de detector zijn; hier is de ideale bereik ligt tussen 1.000 en 16.000 eenheden.
   5. Klik op "capture". De microscoop zal vragen om een ​​donkere afbeelding huidige nemen. Omleiden bovenste schuifbalk of opening (voorzichtig, om niet de uitlijning verstorenen de focus van een van de andere optiek), en klik op "OK". Herstel de schuifbalk of het diafragma op de juiste positie en klik opnieuw op "OK" wanneer gevraagd om de afbeelding wordt weergegeven. Beeldvorming kan tot 30 min, hoewel tijden van ongeveer 5 minuten zijn meer typisch. Langere belichtingstijden leiden tot langere beeldvorming tijden. Een vooruitgang indicator is aanwezig. Wees voorzichtig niet om de omvang fysiek verstoren voordat de voortgangsindicator voltooid.
   6. Observeren vier nieuwe vensters met de namen: "Beschikbare bands lijst", "# 1zoom", "# 1scroll" en "# 1 RGB band". Maximaliseren van het venster "# 1RGB band" aangezien dit de datacube voor alle toekomstige referenties.
   7. Klik rechts op de datacube en opslaan als TIFF en klik op "OK". Als klaar beeldvorming; weggezet alle monsters; Reinig alle olie blootgestelde oppervlakken met 70% isopropanol in water; verhogen podium om maximale hoogte; lagere condensor minimum hoogte in en druk op in niet-operationele positie; geslotenomlaag of trek de lichtbron, podium controller en camera's.

3. Oprichting van Reference Spectral Bibliotheken

1. Selectie van Reference Spectra
   1. Selecteer een positieve controle waarvan bekend is dat het materiaal van belang in dezelfde matrix als de experimentele monsters bevatten, aangezien HSI spectrale profielen matrix-afhankelijk.
      1. Voor dit onderzoek gebruikt varkenshuid geïnjecteerd met hoge doses metaaloxide nanodeeltjes als positieve controles ter vergelijking met de experimentele varkenshuid weefsel van een dermale studie. De spectrale profielen van het metaaloxide nanodeeltjes in suspensie geproduceerd en onderzocht en bleek een ongepaste positieve controle voor de histologische experimentele monsters als gevolg van de verschillende matrices.
   2. Verkrijgen van een datacube van de positieve controle zoals beschreven in stap 2.4., Met de hyperspectrale camera.
      1. Wees bijzonder voorzichtig bij sestelle n de intensiteit, omdat dit de belangrijkste statistiek waarmee de interne partikelfilter het materiaal identificeren. Elk intensiteiten boven het verzadigingspunt van de detector (hier 16.000 eenheden) leiden tot ongeldige data (zie stap 2.4.5.).
   3. Klik met de rechtermuisknop in het beeld venster, en links klik op "Z-profiel spectrum". Een pop-up Spectral Profiel venster verschijnt. Klik met de linkermuisknop op pixels van de rente op de datacube, met name de helderste degenen of die vol vertrouwen kunnen worden geïdentificeerd als vertegenwoordiger van het materiaal van belang. Let op de Spectral Profile venster met het bijbehorende spectrum. Neem nota vooral van de laagste en de hoogste waarde en welke golflengte overeenkomt met het.
      1. Bij meting van de positieve controle monster onderzoek door op de gebieden van belang die zeer licht ten opzichte van het omringende weefsel, vooral die met omlijnd deeltjes. Deze deeltjes zijn het meest waarschijnlijk de mater wordenIALS plaats, vooral in het geval van metalen.
   4. Gebruik de 'Particle Filter "tool onder het menu" Particle Analysis "om deeltjes in de datacube identificeren. In de nieuwe pop-up venster, observeert de "Spectral Max mag overschrijden". Dit wordt bepaald door observaties in stap 3.1.3. Stel deze waarde zodat deze boven achtergrondpixels, maar lager dan het materiaal van belang. De "geldige data Max" is de maximale intensiteit (hier, 16.000 eenheden).
      1. Verlaat andere parameters op standaard, maar exclusief objecten op basis van de grootte van het aanpassen van de box "Size Threshold". Bewaar deze informatie ook op dit moment, of na het uitvoeren van de analyse. Voor dit experiment, gebruikt u de volgende parameters: Spectral Max mag overschrijden: 5000; Geldige gegevens Max: 16.000; Grootte Threshold (pixels): 400. Zodra alle parameters zijn ingesteld, klikt u op "OK".
   5. Observeer de resulterende grafiek met de details vandeeltjes waargenomen binnen de aangegeven intensiteit drempel; Deze gegevens kunnen worden geëxporteerd. Als het karakteristieke maximale reflectie golflengte van het materiaal van belang is bekend, selecteert die deeltjes die een soortgelijke "Max WL" waarde; anders is, klikt u op "Alles selecteren". Klik vervolgens op "Export"; "Om Spectral Library". Kies een bestandsnaam en klik op "OK".
2. Verwijder vals-positieve Spectra
   1. Selecteer een sample dat zal dienen als een negatieve controle. Een dergelijk monster moet opgesteld en behandeld op dezelfde wijze als alle experimentele monsters behalve dat het ontbreken van nanodeeltjes vergelijkbaar of identiek aan het materiaal van belang is gewaarborgd.
      Opmerking: Het is van belang dat de matrix van de negatieve controle is dezelfde als de matrix van de experimentele monsters, zoals HSI spectrale profielen matrix-afhankelijk. Voor dit onderzoek varkenshuid dat niet was blootgesteld aan metaaloxide nanomaterialen als negatief gebruikten wecontrols.
   2. Verkrijgen verschillende datacubes van de negatieve controle zoals beschreven in stap 2.4.7, met het hyperspectrale camera. Ten minste één vereist, maar kunnen naar selectiever worden (dit is vooral belangrijk in het geval dat bepaalde verontreiniging kan in de referentiespectra).
   3. Gebruik de hyperspectrale imaging software om de spectrale bibliotheek in stap 3.1 (positieve controle) tegen elkaar datacube verzameld serieel filteren gevangen in stap 3.2.2 (negatieve controles), zoals aangegeven in de volgende stappen:
      OPMERKING: Sla de resulterende, gefilterde spectrale bibliotheek om een ​​apart bestand, en gebruiken als referentie spectrale bibliotheek voor het materiaal van belang.
      1. Klik op "Filter Spectral Library" onder het menu Analyse, gelegen op de belangrijkste programma werkbalk. Klik op "Open"; "Nieuw bestand" en selecteer de spectrale bibliotheek gemaakt in stap 3.1. voor de positieve controle als Input bestand. Klik op "OK".
      2. Voor externe bron, selecteer "Beeld" onder het vak spectrale gegevens. Houd standaardinstellingen onder het vak Processing Parameters. Selecteer een Output naam voor Gefilterd Library (dit verschilt van het origineel moet zijn, of de ruwe spectrale bibliotheek verzameld gaat verloren). Klik op "OK".
      3. Klik op "Open"; "Nieuw bestand" en selecteer de eerste datacube gevangen in stap 3.2.2 voor de negatieve controle, wanneer u wordt gevraagd om een ​​beeld te selecteren.
         OPMERKING: De software analyseert de spectrale bibliotheek en verwijder elk spectrum dat een spectrum van de negatieve controle datacube wedstrijden. Het verwijderen van de achtergrond van de selectiecriteria vermindert daardoor kans op vals-positieven. Een samenvatting zal beschikbaar zijn wanneer dit wordt gedaan (let op dat deze samenvatting niet automatisch opgeslagen).
      4. Als extra filtering gewenst is, herhaal stap 3.2.3.1, met uitzondering van: stap 3.2.3.2, selecteert u de laatste gefilterde spectrale bibliotheek gecreëerd (resulterend na stap 3.2.3.3 co.mpletes); in stap 3.2.3.3, selecteert u de volgende datacube uit stap 3.2.2.
         Opmerking corrigeren en het normaliseren van de lamp spectrum kan nodig zijn als de monsters verstrooien een aanzienlijke hoeveelheid licht (bijvoorbeeld, koolstof nanotubes) en / of zero spectra blijven bij het ​​filteren een positieve controle spectrale bibliotheek tegen een negatieve controle. Deze omstandigheden niet aan de orde voor onze studie en dus deze correctie werd niet uitgevoerd.

4. beeldanalyse

1. Spectrale Hoek Mapping
   1. Open de "Spectral Angle Mapper" (SAM) in het menu Spectral, submenu Mapping methoden, met behulp van de hyperspectrale beeldbewerkingssoftware zodra alle experimentele datacubes zijn verworven volgende stap 2.4. De spectrale hoek mapper vergeleken spectra van geometrische analyse van de veranderingen in intensiteit als functie van de golflengte (dat wil zeggen, vergelijkt twee spectra door het normaliseren van de intensiteit en het vergelijken van de hoeken rewenste de grafiek van elke spectra) ²⁴ sporen.
   2. Met de datacube geopend, selecteert u de naam van de experimentele datacube in het pop-upvenster en klik op "OK". Als er geen bestandsnamen worden weergegeven, klikt u op "open"; "Nieuw bestand", kiest de experimentele datacube, klik op "OK".
      1. Zich aan een nieuwe pop-up venster opgeroepen endmember Collection: SAM. Klik op "Import" in de menubalk en selecteer "van Spectral bestand Library". Een pop-up venster met de naam Spectral Bibliotheek Input File verschijnt. Open de Spectral Bibliotheek referentie die is gemaakt in stap 3.2.3. en klik op "OK". Zich aan een nieuwe pop-up venster met de naam "Input Spectral Library".
      2. Klik op "Alle items te selecteren"; klik op "OK" klik rechts op "Kleur" en selecteer "Apply standaardkleuren voor iedereen." Klik op "Alles selecteren", gevolgd door "Apply" en kies vervolgens de output bestandsnaam eend Klik op "OK". De Spectral Angle Mapper zal een paar seconden duren om de gegevens te analyseren en op te slaan.
   3. Open de datacube in de hyperspectrale imaging software. Selecteer "Classificatie" in het Overlay menu van het beeld venster, navigeer naar de bestandsnaam en klik op "OK". De gebruiker kan nu overlay elk spectrum van de bibliotheek om te zien waar ze in kaart in de afbeelding.
   4. Selecteer de "Lessen Merge" optie in het optiemenu in de "Interactive klasse functie" geopend door de overlay-menu in het beeld venster, als een uniforme kleurenschema gewenst is, zoals voor een betere analyse door andere software (zoals beschreven in stap 4.2 .).
   5. Markeer alle classificaties te combineren (meestal alles behalve "categorieën" in de "klassen samen te voegen in de basis" lijst) en selecteer een spectrum van de "basis class" lijst, klik op "OK". Die kleur zal nu Represent alle geselecteerde spectra.
   6. Klik op de geselecteerde kleur en alle overeenkomende spectra zullen in die kleur worden getoond.
   7. Om een ​​tweekleurig afbeelding die de bijbehorende spectra over een zwarte achtergrond, cIick op de "geclassificeerde" kleuren doos, die is zwart standaard zal tonen te verkrijgen. Observeren een tweekleurig afbeelding. Deze stap kan worden teruggedraaid door op de doos "geclassificeerde" kleuren weer te klikken.
   8. Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding op te slaan als een TIFF, inclusief overlays momenteel actief is.
      LET OP: Voor toekomstige beeldvorming verwerking, zal een tweekleurig afbeelding worden gebruikt.
   9. Selecteer "Class Distribution" uit het optiemenu in het venster "Interactive Class Tool" om het in kaart brengen van de statistieken te verwerven. Deze data geeft aan hoeveel pixels waren unmapped (categorieën) en hoeveel werden geïdentificeerd als het materiaal van belang. Merk op dat het aantal pixels niet overeenkomt met het aantal deeltjes in kaart gebracht. Deze informatie is niet automatisch recorded.
2. Deeltje analyse in Hyperspectrale Toegewezen Afbeeldingen
   1. Open de beelden in NIH ImageJ software.
   2. Gebruik het menu Afbeelding, Adjust submenu 'Threshold' functie. Selecteer parameters die deeltjes van de belangstelling van alle andere materialen te onderscheiden. Gebruik de volgende drempel parameters voor deze studie: default drempel methode, kleur rood, kleurruimte HSB, gecontroleerd donkere achtergrond checkbox, gecontroleerd pas vakjes voor tint, verzadiging en helderheid.
      NB: Dit kan aanzienlijk verschillen van geval tot geval. Bij het analyseren van een toegewezen datacube, kan dit worden vereenvoudigd door het verenigen van alle relevante klassen één kleur en bedekken die kleur alle categorieën kleuren voor het opwekken van het beeld (stappen 4.1.4 tot 4.1.8).
   3. Gebruik het menu Analyseren "Analyseren deeltjes" functie, die informatie op te halen voor het gebied betekenen, minimale en maximale waarden. Voor deze studie, gebruik maken van de parameters hier: maat 0-oneindig, circulariteit0-1, tonen niets, gecontroleerd resultaten weergeven checkbox.
   4. Voor statistische analyse, exporteren van deze gegevens naar een ander programma op statistische vergelijking met het aantal en de grootte van de deeltjes zich in soortgelijke controle monsters. We raden het gebruik van een spreadsheet voor analyse van ImageJ gegevens. De gegevens in de tabel weergegeven resultaten na stap 4.2.4 moeten worden gekopieerd naar een spreadsheet. De MAX-functie kan worden gebruikt op de eerste (naamloze) kolom om het aantal deeltjes te bepalen, terwijl de gemiddelde functie kan worden gebruikt op de kolom Microregio gemiddelde grootte van een deeltje te bepalen. In de toekomst, zullen experimentele validatie worden voortgezet om deze functie te onderzoeken bij het ​​bepalen van gemiddelde grootte met een gevestigde standaard voor de dimensionering (bijvoorbeeld TEM).

Representative Results

Hyperspectrale microscopie is nuttig om zijn vermogen om materialen op een wijze vergelijkbaar met spectrofotometrie te identificeren. Zoals aangegeven in Figuur 1, elk materiaal verschillende karakteristieke spectra en een algemene vorm van de reflectie, die uniek is. Verder Figuur 1 toont de matrix-afhankelijke karakter van de spectrale profielen: de spectrale profielen voor elk van de drie metaaloxiden in histologische weefselmonsters (bovenste paneel) verschillen van de spectrale profielen voor elk van de drie metaaloxiden in waterige suspensie ( onderste paneel). Toewijst de karakteristieke spectrale profielen onbekende monsters in dezelfde matrix, de techniek is bruikbaar voor het bepalen van de aanwezigheid of afwezigheid van een materiaal, en kan ook semi-kwantitatief relatieve hoeveelheden materiaal vergelijken monsters.

De verwijzing spectrale bibliotheken gemaakt op basis van de positieve controle huid monsters zijn geschikt voor het in kaart brengen van experimentelehuidmonsters. Zoals blijkt uit figuur 2, de referentie spectrale libraries kaart goed aan de corresponderende positieve controles en niet toegewezen aan de corresponderende negatieve controles.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de mogelijkheid om lage niveaus van stoffen plaats in monsters te detecteren, en om hen van verontreinigingen. . Zo kunnen individuele nanobuizen in longen worden waargenomen tijdens inhalatie van doses zo laag als 40 pg in een 20-30 g rat ²⁵ Figuur 3 toont dit in histologische huidmonsters: sommige deeltjes gemakkelijk duidelijk in het donkerveld optische beeld (column 2), anderen zijn gedetecteerd met behulp van hyperspectrale beeldvorming (kolom 3) die mogelijk zijn gemist met helderveld microscopie (kolom 1) of andere methoden. Het gebruik van Darkfield HSI dient ook om specificiteit meer dan eenvoudige helderveld microscopie verbeteren. Deze beelden kunnen vervolgens worden onderworpen aan meer kwantitatieve vormen van analyse, notably analyse van deeltjes via ImageJ.

Verbeterde donkerveld microscopie heeft verschillende toepassingen, zelfs bij afwezigheid van hyperspectrale. De eerste is de mogelijkheid om hoge kwaliteit, contrastrijke beelden te genereren. Dit wordt het best getoond in figuur 3, waarbij deeltjes van belang duidelijk herkenbaar in vergelijking met hun tegenhangers helderveld. Deze beelden kunnen ook worden onderworpen aan kwantitatieve analyse van deeltjes, maar in de afwezigheid van hyperspectrale mapping, voorzichtigheid is noodzakelijk om te voorkomen dat verwarring een verontreiniging deeltje van een deeltje van belang.

Figuur 1. Referentie spectrale bibliotheken (weefsel matrix) vergeleken met spectrale bibliotheken (nanodeeltjes in suspensie). Deze figuur toont het belang van het genereren van een referentie spectrale bibliotheek nanomaterials plaats in dezelfde matrix als experimentele monsters. De eerste rij toont de referentie spectrale bibliotheek (RSL) voor elk materiaal in deze studie (aluminiumoxide, silica en ceriumoxide). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Dit RSL is gemaakt door de in dit protocol, waar de positieve controle weefselmonsters werden gefilterd tegen negatieve controle weefselmonsters beschreven methode. De tweede rij toont spectrale bibliotheken (SL) gemaakt op basis van de nanodeeltjes interesse in vloeibare suspensie op een glasplaatje. Aluminiumoxide, een bimodale piek bij golflengten van 500 en 650 werd gevonden in de RSL, terwijl een meer gebogen en minder opvallende piek werd waargenomen bij het alumina NP suspensie SL ongeveer 600. Voor silica, een piek bij een golflengte van ongeveer 650 werd aanwezig in de RSL, terwijl een meer gebogen en minder opvallende piek werd gezien in de silica NP schorsing SL bij around 600. Voor ceriumoxide, een bimodale piek werd gevonden bij golflengten van 520 en 620 in de RSL, terwijl een minder opvallende piek werd waargenomen bij het ceriumoxide NP suspensie SL ongeveer 560. Dit suggereert dat de matrix waarin de NP zijn ingebed creëert een verschuiving van spectra die aanzienlijk kunnen zijn bij het selecteren van de controles voor de SL specifieke experiment maken.

Figuur 2. Referentie spectrale bibliotheken (weefsel matrix) in kaart gebracht op de positieve controle en de negatieve controle varkens huidweefsel. Dit getal dient als bevestiging van de RSL afhankelijk van mapping naar proefmonsters, dat elk RSL (linker kolom) beeldt goed op zijn corresponderende positieve controle (middelste kolom) en niet toegewezen aan de corresponderende negatieve controle (rechterkant). Gelieve Klik here voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Hyperspectrale in kaart brengen van experimentele varkens huidweefsel blootgesteld aan metaaloxide nanodeeltjes. Rijen van boven naar beneden corresponderen met verschillende lagen van de huid, van oppervlakkig diepste laag: epidermis, dermis en subcutaan weefsel resp. De eerste rij toont de hoornlaag van de opperhuid van de huid monster dat werd blootgesteld aan alumina NP in suspensie; de tweede rij werd blootgesteld aan NP silica in suspensie; en de derde rij om NP ceriumoxide in suspensie. Elke kolom toont hetzelfde gebied van de huid afgebeeld met verschillende technieken. De eerste kolom correspondeert met helderveld microscopie (40X mag .; schaal bar = 50 pm), waarbij het gebied omsloten door een rood vierkant werd vergroot (100X mag; schaal bar = 10 micrometer) met verbeterde donkerveld microscopie (EDFM) in de tweede kolom, waar de witte pijlen wijzen op het hoge contrast NPs. De derde kolom verkregen met een hyperspectrale camera (HSI), met dezelfde hoge contrast NP (witte pijlen). EDFM en HSI beelden werden genomen bij 100X vergroting; schaal bar = 10 micrometer. De vierde kolom toont de HSI afbeelding afgezet tegen de respectievelijke RSL voor elke blootstelling groep, waarbij aluminiumoxide NP's worden weergegeven in het groen, silica NP's in de kleuren rood en ceriumoxide NP in geel, respectievelijk. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Voor weefselmonsters die conventionele histologische kleuring, de identificatie en analyse van metaaloxide nanodeeltjes hebben ondergaan, kan worden bereikt door een combinatie van EDFM, HSI mapping en beeldanalyse technieken. Hoewel flexibel wordt monstervoorbereiding voor histologie en immunohistochemie (bijvoorbeeld via vaste of bevroren weefsels type vlek), is het belangrijk dat de monsters worden coupes met een dikte van 5-10 urn optimale visualisatie. Monsters die hier gebruikt werden in formaline gefixeerd en in paraffine ingebed voorafgaand aan snijden met een roterende microtoom tot 6 pm dikte aangebracht op glazen microscoopglaasjes, gekleurd met hematoxyline en eosine en afgedekt. Varkenshuid weefsel van een ex vivo huidpenetratie toxicologische samenwerking werden gebruikt voor deze studie. De weefsels werden blootgesteld aan metaaloxide nanodeeltjes (alumina, silica, ceria) in waterige suspensies. Detectie van de regio ('s) van belang (hoog contrast elemeNTS) met EDFM is een belangrijke eerste stap die de daaropvolgende HSI in kaart brengen en analyseren vergemakkelijkt. Positieve en negatieve controlemonsters worden afgebeeld en eerst geanalyseerd om een ​​spectrale bibliotheek te creëren voor referentie. De verzamelde spectra van de positieve controle worden uitgevoerd naar een positieve controle spectrale bibliotheek. Vervolgens worden alle spectra van de negatieve controle beelden worden afgetrokken van de spectrale bibliotheek van de positieve controle in om specificiteit te verbeteren (vermindering van valse positieven). De resulterende gefilterde spectrale bibliotheek wordt beschouwd als RSL dat dient voor de analyse van materialen van belang. Alle weefselmonsters ondergaan dezelfde imaging proces en worden in kaart gebracht tegen de RSL. Het resulterende beeld zal alleen gebieden met elementen van rente over een zwarte achtergrond bevatten. Deze afbeelding kan vervolgens worden geanalyseerd met behulp van de ImageJ drempel en deeltjes analysefuncties het gebied toegewezen deeltjes per veld te verkrijgen. Numerieke data verkregen uit ImageJ kan export wordened naar een spreadsheet voor verdere analyse.

Het is belangrijk om te overwegen dat als biologische monsters zijn inherent verschillend van elkaar, en vlekken methoden kunnen visualisatie beïnvloeden door middel van EDFM en HSI, de belichting moet worden in overeenstemming met wat het beste beeld met hoog contrast produceert voor een specifiek type van het monster bepaald. Hoewel de reductie van valse positieven kan worden bereikt door de filtratie van spectrale bibliotheken, is het cruciaal om betrouwbare negatieve controles die verontreiniging vermeden met het element van belang te verkrijgen, aangezien de spectra overeenstemmen met deze vervuiling zou kunnen worden gefilterd uit spectrale bibliotheek de positieve controle van , het verhogen van vals-negatieve tarieven. Ook kan het spectrum intensiteit bereik dat detecteerbaar is met de hyperspectrale imaging software niet de limiet van de specifieke software overtreffen (voor dit onderzoek, dat is 16.000 eenheden): gebieden met een groot aantal van geaccumuleerde deeltjes die sp producerenectral intensiteiten boven het maximum intensiteit worden weggelaten uit de spectrale bibliotheek, vanwege het risico van het verhogen van het aantal valse negatieven.

Terwijl de HSI systeem geeft veel voordelen boven traditionele methoden, zijn er een aantal nadelen en beperkingen te overwegen. Een daarvan is dat de grote hoeveelheid optische verzamelde gegevens kunnen aanzienlijk rekenvermogen nodig. Een andere is dat HSI tijdsintensief kan zijn, vooral in het begin stadia als referentie spectrale bibliotheken worden gecreëerd. Ook kan imaging tijd enkele minuten per beeldopname nodig, waardoor het langzamer dan eenvoudige Darkfield beeldvorming; Het is echter nog steeds sneller dan uitvoeren monsterbereiding en visualisatie door elektronenmicroscopie. Bovendien kunnen complexe systemen in meerdere karakteristieke spectra, die de ontwikkeling van zeer gespecialiseerde controles vereisen en maakt de instelling van gestandaardiseerde, universele referentie bibliotheken moeilijk ^26. Ten slotte is de technique resulteert in lagere resolutie dan probe- of elektronen-microscopie technieken zoals atomaire kracht microscopie en transmissie elektronenmicroscopie, waarmee afzonderlijke atomen kunnen oplossen. Resolutie van deze techniek is beperkt als gevolg van de fotonische natuur, die voorkomt dat het een hoge precisie instrument voor het meten van deeltjesgrootte op de nanometer niveau of voor het nauwkeurig lokaliseren van materialen op een sub-micron niveau. Hoewel de techniek in staat zijn om deeltjes binnen bepaalde weefselcompartimenten of cellulaire organellen lokaliseren groter dan 1 urn (zoals celkernen), kleinere organellen of toevoegingen uitdagend om nauwkeurig te visualiseren met deze methode. Ook van belang, gezien de ruimtelijke resolutie, kan deze methode geen onderscheid maken tussen enkele nanodeeltjes en agglomeraten ^11.

Andere overwegingen omvatten: bepaalde materialen (bijvoorbeeld edelmetalen) veel hogere reflectie en verschillende spectrale profielen, die ze gemakkelijker te AnalyZe en spectraal kaart met deze tool. Anderen, zoals semi-metallische oxides onderzocht in deze studie en op koolstof gebaseerde nanomaterialen ^{24, 27} kan moeilijker zijn vanwege hun elementaire samenstelling, vorm, en afhankelijk van de matrix. In twee muizen inhalatie studies van Mercer et al., Een soortgelijk systeem met degene die in deze studie werd gebruikt om de koolstof nanobuisjes vinden in de longen en het afgeleide organen op basis van hun opvallend hoog contrast met omringende weefsels. Toch werd hyperspectrale mapping niet aangetoond in beide studies, waarschijnlijk omdat de unieke vorm van koolstofvezels was voldoende trait identificatie. Een andere overweging betreft specifiek aan weefsels: sinds deponeren nanodeeltjes van belang zijn voor specifieke organen via de normale biofysische processen onvoorspelbaar is (en vaak zelf het onderwerp van studie), kunnen bepalen van een toepasselijke positieve controle moeilijk en vereist een afweging van hoe generatie van de controle might invloed op de toestand van een materiaal van belang. Bijvoorbeeld, wanneer een spectrale bibliotheek wordt gemaakt van ongerepte nanodeeltjes plaats, kan het moeilijk zijn om de bibliotheek om diezelfde nanodeeltjes in weefsels of cellen kaart als gevolg van veranderingen in de spectra gevolg van wijziging van de deeltjes (bijvoorbeeld door verandering pH, ontbinding agglomeratie eiwitbinding) en de totale micro of matrix. Tenslotte is de techniek beperkt de semi-kwantitatieve aard: het kan alleen kwantitatief andere tweedimensionale microscopietechnieken soortgelijke oplossing, wat betekent dat het niet gemakkelijk worden gebruikt om taken uit te voeren zoals kenmerkend totaal orgaan last van een materiaal.

Kortom, EDFM en HSI bieden verschillende voordelen ten opzichte van conventionele nanomaterialen beeldvorming en karakterisatie technieken, zoals TEM, HAADF en DIC. EDFM / HSI zorgt voor een snellere beeldverwerking acquisitie en analyse, die tijd en kosten bespaart in vergelijking met een intensiever conventionele technieken. Bovendien monstervoorbereiding voor EDFM / HSI typisch zowel minimaal en non-destructief, wat tijd bespaart en ook flexibeler analyse van een gegeven monster omdat dan kan worden gebruikt voor andere technieken. Voorts HSI is veelzijdig, waardoor analyse van nanomaterialen vele samenstellingen en in diverse matrices. Het onderzoeksteam werkt aan de hier beschreven voor andere materialen en soorten monsters, met inbegrip van een grondige evaluatie van de specificiteit van de technologie methode te verfijnen. Een kritische volgende stap in onderzoek door het onderzoeksteam is de validatie van deze technieken tegen de traditionele gouden standaard (bijv Raman, TEM, SEM) voor de materialen en de soorten weefsel van belang.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CytoViva 150 Unit (condenser)	CytoViva (Auburn, AL)		mounted to Olympus BX43 microscope
Olympus BX43 Microscope - Analyzer Slot - HSI with 10x and 40x air objectives and 100X oil immersion objective	obtained through CytoViva (Auburn, AL)		for use with CytoViva 150 Unit condenser
Dagexcel-M Digital Firewire Camera - Cooled; includes Exponent 7 software	obtained through CytoViva (Auburn, AL)		enhanced darkfield camera and software
CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software	obtained through CytoViva (Auburn, AL)		hyperspectral camera and software
cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides)	Schott NEXTERION	1025087	reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging
cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22 mm x 22 mm x  1.45 mm)	Schott NEXTERION	custom	reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging
type A microscopy immersion oil	Fisher Scientific	12368B	multiple suppliers
70% isopropanol in water			multiple suppliers
ImageJ software	National Institutes of Health (NIH)		free open-source software online download
metal oxide nanoparticles	supplied to the research team by industrial partners		alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed.