Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.
Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.
Som nanomaterialer blir stadig mer brukt i en rekke bransjer og applikasjoner, er det behov for nanoskala bildebehandling og karakterisering metoder som er raskere, rimeligere og praktisk enn tradisjonelle modaliteter, for eksempel elektronmikroskopi. For å visualisere nanopartikkel (NP) interaksjoner med celler, vev og levende systemer, mange optiske teknikker har vært ansatt, inkludert kontrast differensial forstyrrelser (DIC) mikroskopi 1 og flyktige feltbaserte tilnærminger, som total intern refleksjon (TIR) eller nær- feltet skanning optiske mikroskopi (NSOM) 2,3. Men disse er high-end analytiske tilnærminger, utilgjengelig for de fleste ikke-spesialiserte laboratorier 4. Elektronmikroskopi, inkludert transmisjonselektronmikroskopi (TEM), har også blitt brukt til å studere NP interaksjon med celler 5,6,7,8. Høy vinkel ringmørkefelt (HAADF) scanning transmisjonselektronmikroskopi har blitt brukt til å studere samspillet av NPsmed virus 9. Konfokalmikroskopi er en annen populær teknikk som brukes for å studere NP-celle interaksjoner 10.
I de senere årene har mørkefelt-baserte hyperspektral avbildning (HSI) teknikker blitt brukt som et lovende analytisk verktøy for å studere NPs i biologiske matriser 11. HSI-systemer generere en tredimensjonal representasjon av romlig og spektral data, kjent som en hyperkube eller Datacube 12. Den romlige kartet spektralvariasjonen brukes for material identifikasjon. Spektrale profiler av kjente materialer som kan genereres og brukes som referansebibliotek for sammenligning med ukjente prøver. En av de store fordelene med HSI systemer er dens evne til å kombinere avbildning med spektroskopi, for derved å etablere plasseringen og fordelingen av ukjente NPS in vivo eller ex vivo, så vel som at de kobles til en annen referanse partikkel av kjente, lignende sammensetning.
Det er flere fordelerbruker HSI systemer over konvensjonelle bildeteknikker: minimal prøveopparbeidelse er nødvendig; prøveopparbeidelse er typisk ikke-destruktiv i naturen; image innsamling og analyse er raskere; den teknikk som er kostnadseffektivt 13; og den romlige fordelingen og analyse av forbindelser av blandet sammensetning og / eller i komplekse matrikser er lettere oppnås 14.
For nano forskning som involverer kostbare prøver, en av de viktigste hensyn er tilgjengeligheten av en ikke-destruktiv fremgangsmåte for billeddannelse, som gjør det mulig for den potensielle gjentatte ganger å undersøke prøver av en eller flere metoder. Gjentatt eller flere analyser kan være ønskelig å utvikle omfattende datasett som ikke ville være tilgjengelig fra en enkelt metode. Til denne forbindelse, studere sine optiske egenskaper er den tryggeste måten å analysere prøven. Ved å bruke en forbedret mørkefelt mikroskop (EDFM) og HSI system for å studere den optiske responsen av prøven – nemlig Reflectance, men også absorbans og transmisjon – funksjonen identifisering og karakterisering kan utføres 15. Potensielle karakterisering endepunkter omfatter en vurdering av relativ størrelse og form av nanopartikler eller agglomerater og fordeling av nanopartikler i en prøve.
I denne artikkelen beskriver vi kartleggingsmetoder spesifikt for metalloksid nanopartikler i post-mortem vev ved hjelp av en HSI system basert på en piksel-spektral kamp algoritme referert til som en spektral vinkel mapper (SAM). Vi valgte denne søknaden fordi den har potensial til å komplettere nåværende og fremtidige in vivo nanotoxicology forskning, hvor dyremodeller brukes for å vurdere de helsemessige konsekvensene av eksponering for konstruerte nanomaterialer. Anvendelse av denne metoden kan også informere nanomedikamentavgivelses forskning som utnytter vevs- eller dyremodeller. Spesielt nanopartikler absorpsjon, distribusjon, metabolisme og ekskresjon gjennom organs og vev kan bli undersøkt med dette systemet. Et bredt utvalg av applikasjoner blir undersøkt for bruk i biomedisinsk forskning 11.
Denne metoden kan benyttes for vurdering av forskjellige biologiske prøver (for eksempel ulike typer vev, bronkoalveolar lavage prøver, og blodutstryk) som har vært utsatt for nanopartikler av en rekke elementære sammensetninger 16-19. Videre er denne metode som er nyttig for å studere nanopartikkel biodistribusjon in vivo og in vitro, som er relevant for nanomedikamentleverings studier 11. Utover biologiske prøver, kan EDFM og HSI brukes til å vurdere nanopartikler i miljøprøver, for eksempel avløpsvann 20. Yrkeseksponering vurdering kan forenkles ved bruk av denne teknikken også, siden det kan brukes til å evaluere effekten av personlig verneutstyr for å hindre nanopartikkel penetrasjon. Videre forskning team utvikler for tiden en lignende EDFM og HSI protokoll for evalueringen av filtermedie prøver av nanopartikler som samles inn fra yrkeseksponering vurderinger. Selv om fremstillingen av disse forskjellige typer prøve for EDFM og HSI kan variere, er det viktig at de er fremstilt på en slik måte at de lett kan visualiseres ved hjelp av det optiske systemet. Vanligvis bør prøven fremstilles som om det ville bli visualisert via tradisjonell lysfelt mikroskopi. Det er flere hyperspektral bildesystemer kommersielt tilgjengelige 11.
For vevsprøver som har gjennomgått vanlig histologisk farging, identifisering og analyse av metall oksid nanopartikler kan oppnås gjennom en kombinasjon av EDFM, HSI kartlegging og bildeanalyse teknikker. Mens det er fleksibilitet i prøvepreparering for histologi eller immunhistokjemi (for eksempel ved hjelp av faste eller frosne vev, typen flekker), er det viktig at prøvene er seksjonert med en tykkelse på 5-10 um for optimal visualisering. Prøvene som er brukt her var formalinfiksert og parafin-embedded før seksjonering med en rotasjonsmikrotom til 6 mikrometer tykkelse, montert på glass objektglass, farget med hematoxylin og eosin og coverslipped. Svinehud vev fra en ex vivo kutan penetrering toksikologi samarbeid ble anvendt for denne studien. Vevene ble utsatt for metalloksid nanopartikler (alumina, silika, ceria) i vandige suspensjoner. Påvisning av regionen (e) av interesse (høy kontrast elemeNTS) med EDFM er et viktig første skritt som forenkler påfølgende HSI kartlegging og analyse. Positive og negative kontrollprøver skal avbildes og analyseres først for å skape en spektral bibliotek for referanse. Det oppsamlede spektra fra den positive kontrollen blir eksportert til en positiv kontroll spektral bibliotek. Da blir alle spektrene fra de negative kontroll bilder subtraheres fra den positive kontroll spektrale bibliotek for å øke spesifisitet (redusere falske positiver). Det resulterende filtrerte spektrale bibliotek anses RSL som tjener for analyse av materialer av interesse. Alle vevsprøver gjennomgå den samme bildeprosessen og er kartlagt mot RSL. Den resulterende bildet vil bare inneholde områder med elementer av interesse enn en svart bakgrunn. Dette bilde kan så analyseres med ImageJ ved hjelp av sine terskel og partikkelanalysefunksjoner for å oppnå det området av kartlagte partikler pr synsfelt. Numeriske data innhentet fra ImageJ kan være eksported til et regneark for videre analyse.
Det er viktig å tenke på at så biologiske prøver er iboende forskjellige fra hverandre, og fargemetoder kan påvirke visualisering gjennom EDFM og HSI, bør eksponeringsinnstillingene fastsettes i samsvar med hva gir best bilder med høy kontrast for en bestemt type prøve. Selv om reduksjon av falske positiver kan oppnås ved filtrering av spektrale biblioteker, er det avgjørende å oppnå pålitelige negative kontroller som har unngått forurensning med elementet av interesse, som spektrene tilsvarer denne forurensning kan potensielt bli filtrert fra den positive kontroll spektrale bibliotek øker falske negative priser. Dessuten kan spektrum intensiteten som er detekterbart med hyperspektral avbildning programvaren ikke overskrider grensen for den aktuelle programvare (for denne studien, er det 16000 enheter): områder med et høyt antall akkumulerte partikler som frembringer spectral intensiteter over intensitetsgrense er utelatt av den spektrale biblioteket, på grunn av risikoen for å øke antallet av falske negativer.
Mens HSI-systemet overfører mange fordeler fremfor tradisjonelle metoder, er det noen ulemper og begrensninger for å vurdere. Den ene er at den store mengden av optiske data som samles kan kreve betydelig beregningskraft. En annen er at HSI kan være tidkrevende, spesielt i begynnelsen stadier når referanse spektrale bibliotekene blir opprettet. Dessuten kan bildebehandling tid kreve flere minutter per bilde fangst, noe som gjør det tregere enn enkel mørkefelt bildebehandling; Det er imidlertid fortsatt raskere enn å utføre sampling forberedelse og visualisering ved elektronmikroskopi. I tillegg kan komplekse systemer resultere i flere karakteristiske spektra som krever utvikling av høyt spesialiserte kontrollerer og muliggjør etablering av standardiserte, universalreferansebibliotek vanskelige 26. Endelig technique gir lavere oppløsning enn sonde eller elektronmikroskopi teknikker, for eksempel atomkraftmikroskopi eller transmisjonselektronmikroskopi, som kan løse enkeltatomer. Denne teknikken oppløsning er begrenset på grunn av den fotoniske natur, som hindrer den fra å være en høy presisjon verktøy for måling av partikkelstørrelser på nanonivå eller for nøyaktig plassering av materialet på en sub-mikron-nivå. Mens teknikken kan være i stand til å fastslå partikler innenfor visse vevsområder eller cellulære organ større enn 1 mikrometer (for eksempel celle kjerner), er mindre organeller eller funksjoner utfordrende å visualisere nøyaktig med denne metoden. Også verdt å merke, gitt sin romlig oppløsning, kan denne metoden ikke skille mellom enkeltnanopartikler og agglomerater 11.
Andre hensyn er: visse materialer (for eksempel edelmetaller) har mye høyere refleksjon og distinkte spektrale profiler, noe som kan gjøre dem lettere å ANALYze og spektralt kart med dette verktøyet. Andre, slik som de semi-metalliske oksyder som er undersøkt i dette studiet og karbon-nanomaterialer 24, 27, kan være mer utfordrende på grunn av deres grunnlegg sammensetning, form, og avhengig av matrisen. I to murine innånding studier av Mercer et al., Ble et tilsvarende system for den ene som anvendes i denne studien anvendes for å lokalisere karbon nanorør i lungene og i sekundære organer, basert på deres bemerkelsesverdig høy kontrast med omgivende vev. Men hyperspektral kartlegging ble ikke påvist i noen av studiene, sannsynligvis fordi den unike formen på karbonfibre var en tilstrekkelig egenskap for identifisering. En annen vurdering gjelder spesielt for vev: siden deponering nanopartikler av interesse for bestemte organer gjennom normale biofysiske prosesser er uforutsigbar (og ofte seg selv gjenstand for studier), kan bestemmelse av en gjeldende positiv kontroll være vanskelig og krever vurdering av hvordan generasjonen av kontroll might påvirke staten av et materiale av interesse. For eksempel, hvis det opprettes en spektral-bibliotek fra uberørte nanopartikler av interesse, kan det være vanskelig å kartlegge biblioteket til de samme nanopartikler i vev eller celler som skyldes endringer i spektrene som følge av forandring av den partikkel (for eksempel på grunn av endringer i pH, oppløsning, agglomerering, proteinbinding), og den totale mikromiljøet eller matrise. Til slutt blir den teknikk begrenset i sin semi-kvantitativ: det kan bare være så kvantitativt som andre to-dimensjonale mikroskopi teknikker av tilsvarende oppløsning, noe som betyr at det ikke lett kan anvendes for å utføre oppgaver som å karakterisere total organ byrden av et materiale.
Totalt sett, EDFM og HSI gir flere fordeler i forhold til konvensjonelle avbildningsnanomaterial og karakteriseringsteknikker, slik som TEM, HAADF og DIC. EDFM / HSI åpner for raskere bildeopptak og analyse, noe som sparer tid og kostnader i forhold til mer intensiv konvensjonelle teknikker. Dessuten er prøvepreparering for EDFM / HSI typisk både minimalt og ikke-destruktiv, noe som sparer tid og også gir mulighet for mer fleksibel analyse av en gitt prøve, siden det kan da brukes for andre teknikker. Videre er HSI allsidig, slik at for analyse av nanoskala materialer av mange sammensetninger og i en rekke matriser. Forskerteamet arbeider for å avgrense metoden beskrevet her for andre materialer og prøvetyper, inkludert en grundig vurdering av spesifisitet av teknologien. Et kritisk neste trinnet under etterforskning av forskerteamet er validering av disse teknikkene mot tradisjonelle gullstandarder (f.eks Raman, TEM, SEM) for materialene og vevstyper av interesse.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Günter Oberdörster, DVM, PhD and Alison Elder, PhD (University of Rochester) and Mary Frame, PhD (Stony Brook University) for animal research collaborations resulting in tissue samples for analysis. Additionally, the authors thank: Christina Rotondi (Albany Medical College Histology Core); Rani Sellers, DVM, PhD and Barbara Cannella, PhD (Albert Einstein College of Medicine Histology and Comparative Pathology Facility); Leonardo Bezerra and Ahlam Abuawad (Brenner research team members); and Leslie Krauss, Byron Cheatham and Elyse Johnson (CytoViva). This work was supported in part by CDC-NIOSH grant OH-009990-01A1 and the NanoHealth and Safety Center, New York State, awarded to S.B.
CytoViva 150 Unit (condenser) | CytoViva (Auburn, AL) | mounted to Olympus BX43 microscope | |
Olympus BX43 Microscope – Analyzer Slot – HSI with 10x and 40x air objectives and 100x oil immersion objective | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | for use with CytoViva 150 Unit condenser | |
Dagexcel-M Digital Firewire Camera – Cooled; includes Exponent 7 software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | enhanced darkfield camera and software | |
CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | hyperspectral camera and software | |
cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides) | Schott NEXTERION | 1025087 | reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging |
cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22mm x 22mm x 1.45mm) | Schott NEXTERION | custom | reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging |
type A microscopy immersion oil | Fisher Scientific | 12368B | multiple suppliers |
70% isopropanol in water | multiple suppliers | ||
ImageJ software | National Institutes of Health (NIH) | free open-source software online download | |
metal oxide nanoparticles | supplied to the research team by industrial partners | alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed. |