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Bioengineering

बढ़ी Darkfield माइक्रोस्कोपी और हाइपरस्पेक्ट्रल मानचित्रण द्वारा ऊतकीय नमूने में धातु ऑक्साइड नैनोकणों की पहचान

doi: 10.3791/53317 Published: December 8, 2015

Introduction

Nanomaterials के तेजी से उद्योगों और अनुप्रयोगों की एक किस्म में इस्तेमाल कर रहे हैं, और अधिक तेजी से सस्ती है, और इस तरह के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में पारंपरिक तौर तरीकों से भी सुविधाजनक हैं कि nanoscale इमेजिंग और लक्षण के तरीकों के लिए एक की जरूरत है। अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी 1 और इस तरह कुल आंतरिक प्रतिबिंब (TIR) ​​या पास के रूप में क्षणभंगुर क्षेत्र-आधारित दृष्टिकोण, सहित कई ऑप्टिकल तकनीक नियोजित किया गया है कोशिकाओं, ऊतकों, और रहने वाले सिस्टम, साथ nanoparticle (एनपी) बातचीत कल्पना करने के लिए क्षेत्र स्कैनिंग ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी (NSOM) 2,3। हालांकि, इन सबसे गैर विशेषज्ञ प्रयोगशालाओं 4 की पहुंच से बाहर उच्च अंत विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण, कर रहे हैं। संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) सहित इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, यह भी कोशिकाओं 5,6,7,8 साथ एनपी बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। उच्च कोण कुंडलाकार darkfield (HAADF) स्कैनिंग संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी एनपीएस की बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैवायरस 9 के साथ। Confocal माइक्रोस्कोपी एनपी सेल बातचीत 10 अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया एक और लोकप्रिय तकनीक है।

हाल के वर्षों में, darkfield आधारित हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग (एचएसआई) तकनीक जैविक मेट्रिसेस 11 में एनपीएस के अध्ययन के लिए एक आशाजनक विश्लेषणात्मक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है। एचएसआई सिस्टम एक hypercube या datacube 12 के रूप में जाना स्थानिक और वर्णक्रमीय डेटा की एक तीन आयामी प्रतिनिधित्व उत्पन्न करते हैं। वर्णक्रम भिन्नता के स्थानिक नक्शा सामग्री की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है। ज्ञात सामग्री की स्पेक्ट्रल प्रोफाइल उत्पन्न होता है और अज्ञात नमूनों की तुलना के लिए संदर्भ पुस्तकालयों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। एचएसआई सिस्टम के साथ प्रमुख लाभ में से एक है, जिससे जाना जाता है, इसी तरह की संरचना का एक और संदर्भ कण करने के लिए उन्हें जोड़ने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से या पूर्व vivo विवो में स्थान और अज्ञात एनपीएस के वितरण की स्थापना स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ इमेजिंग गठबंधन करने के लिए इसकी क्षमता है।

के कई फायदे हैंपारंपरिक इमेजिंग तकनीक पर एचएसआई सिस्टम का उपयोग: न्यूनतम नमूना तैयार करने की आवश्यकता है; नमूना तैयार प्रकृति में आम तौर पर गैर विनाशकारी है; छवि अधिग्रहण और विश्लेषण तेजी से होता है; तकनीक लागत प्रभावी 13 है; और मिश्रित रचना की और / या जटिल matrices में यौगिकों के स्थानिक वितरण और विश्लेषण और अधिक आसानी से 14 से पूरा किया है।

कीमती नमूने शामिल nanomaterials के अनुसंधान के लिए, सबसे महत्वपूर्ण कारणों में से एक संभावित बार-बार एक या एक से अधिक तरीकों से नमूनों की जांच करने के लिए अनुमति देता है जो एक गैर विनाशकारी इमेजिंग विधि, की उपलब्धता है। बार-बार या एकाधिक विश्लेषण के लिए एक एकल विधि से उपलब्ध नहीं होगा कि व्यापक डेटासेट को विकसित करने के लिए वांछित जा सकता है। इस संबंध के लिए, अपनी ऑप्टिकल गुणों का अध्ययन नमूना विश्लेषण करने के लिए सबसे सुरक्षित तरीका है। एक बढ़ाया darkfield माइक्रोस्कोप (EDFM) और एचएसआई प्रणाली का उपयोग करके नमूने के ऑप्टिकल प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए - अर्थात् Reflectance, लेकिन यह भी absorbance और संप्रेषण - सुविधा पहचान और लक्षण वर्णन 15 किया जा सकता है। संभावित लक्षण वर्णन समापन के सापेक्ष आकार और एक नमूना भीतर नैनोकणों या agglomerates और नैनोकणों के वितरण के आकार के एक आकलन में शामिल हैं।

इस पत्र में, हम एक वर्णक्रम कोण मैपर (एसएएम) के रूप में संदर्भित एक पिक्सेल स्पेक्ट्रल मैच एल्गोरिथ्म पर आधारित एक एचएसआई प्रणाली का उपयोग कर पोस्टमार्टम के ऊतकों में धातु ऑक्साइड नैनोकणों के लिए विशेष रूप मानचित्रण विधियों का वर्णन। यह पशु मॉडल इंजीनियर nanomaterials के लिए जोखिम के स्वास्थ्य निहितार्थ का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं जिसमें विवो nanotoxicology अनुसंधान, में वर्तमान और भविष्य के पूरक करने की क्षमता है, क्योंकि हम इस विशेष आवेदन चुना है। इस विधि के आवेदन भी ऊतक या पशु मॉडलों का इस्तेमाल करता है कि nanoscale दवा वितरण अनुसंधान सूचित कर सकता है। ओ भर में विशेष रूप से, nanoparticle अवशोषण, वितरण, चयापचय, और उत्सर्जन मेंrgans और ऊतकों इस प्रणाली के साथ जांच की जा सकती है। अनुप्रयोगों का एक व्यापक विविधता जैव चिकित्सा अनुसंधान 11 में उपयोग के लिए जांच की जा रही है।

इस विधि मौलिक रचनाओं 16-19 की एक किस्म के नैनोकणों को उजागर किया गया है कि (जैसे विभिन्न ऊतकों प्रकार, ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना नमूने, और रक्त स्मीयर के रूप में) अलग अलग जैविक नमूने के आकलन के लिए उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, इस विधि विवो में और nanoscale दवा वितरण के अध्ययन के लिए 11 के लिए प्रासंगिक है, जो इन विट्रो, में nanoparticle biodistribution अध्ययन के लिए उपयोगी है। जैविक नमूने के अलावा, EDFM और एचएसआई ऐसे अपशिष्ट के रूप में 20 नमूने पर्यावरण में नैनोकणों मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह nanoparticle प्रवेश को रोकने में व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के बाद से व्यावसायिक जोखिम आकलन, साथ ही इस तकनीक के उपयोग से मदद की जा सकती है। इसके अलावा, अनुसंधान तेAM वर्तमान में व्यावसायिक जोखिम आकलन से एकत्र नैनोकणों के फिल्टर मीडिया के नमूने के मूल्यांकन के लिए एक समान EDFM और एचएसआई प्रोटोकॉल विकसित कर रहा है। EDFM और एचएसआई के लिए इन विभिन्न प्रकार नमूना की तैयारी अलग-अलग हो सकता है, यह है कि वे आसानी से ऑप्टिकल प्रणाली द्वारा कल्पना की जा सकती है कि इस तरह से तैयार किया जाता है कि महत्वपूर्ण है। यह पारंपरिक brightfield माइक्रोस्कोपी के माध्यम से देखे जा होता है जैसे कि आमतौर पर, नमूना तैयार किया जाना चाहिए। 11 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कई हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग प्रणालियों रहे हैं।

Protocol

पशु प्रोटोकॉल 'जांचकर्ताओं सहयोग संस्था, स्टोनी ब्रूक विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया। विशिष्ट सामग्री और इस पत्र के लिए इस्तेमाल किया उपकरणों की एक सूची तालिका 1 में पाया जा सकता है।

ऊतकों की 1. नमूना तैयार

  1. पहले से वर्णित विधि 21-23 के अनुसार ऊतकीय या प्रतिरक्षाऊतकरसायन धुंधला के लिए धातु आक्साइड नैनोकणों के संपर्क में जानवरों के ऊतकों को तैयार है।

2. इमेजिंग

  1. माइक्रोस्कोप आरंभ कर रहा है
    नोट: इस अध्ययन के लिए, एक अनुसंधान ग्रेड माइक्रोस्कोप, एक उच्च प्रदर्शन darkfield प्रकाश स्रोत के साथ outfitted, इस्तेमाल किया गया था मोटर चालित XY चरण नियंत्रक, 14-बिट गहराई हाइपरस्पेक्ट्रल कैमरा, और कई ऑब्जेक्टिव लेंस (10X हवा, 40X हवा, 100X तेल विसर्जन) । यहां इस्तेमाल किया प्रणाली 100X (तेल विसर्जन) बढ़ाई पर एक 64 एनएम स्थानिक संकल्प किया है। इस संवर्धन के लिए इस्तेमाल किया कंडेनसरY कोहलर और महत्वपूर्ण दोनों रोशनी सुविधाओं की है और नमूना पर परोक्ष कोण पर एक अत्यधिक collimated प्रकाश केंद्रित है।
    1. में प्लग और प्रकाश स्रोत, (darkfield इमेजिंग के लिए) XY चरण नियंत्रक, ऑप्टिकल कैमरा, हाइपरस्पेक्ट्रल कैमरा, और कंप्यूटर प्रणाली पर बारी। 75% बिजली के लिए प्रकाश स्रोत सेट करें; अधिकतम ऊंचाई करने के लिए मंच बढ़ा; बढ़ाया darkfield इमेजिंग के लिए या परिलक्षित brightfield इमेजिंग के लिए माइक्रोस्कोप की पीठ पर collimator को कंडेनसर करने के लिए प्रकाश गाइड कनेक्ट।
      नोट: 75% बिजली के लिए प्रकाश स्रोत की स्थापना करके, अभी भी सुस्त और उज्ज्वल पिक्सल के बीच विपरीत के लिए अनुमति है, जबकि duller पिक्सल को बढ़ाता है कि देखने के पूरे क्षेत्र के भीतर सभी पिक्सल की पर्याप्त रोशनी वर्दी नहीं है।
    2. परिचालन की स्थिति के लिए कंडेनसर उठाएँ। किसी भी बुलबुले के गठन से परहेज है, ध्यान से कंडेनसर लेंस पर टाइप-ए विसर्जन के तेल की 3-5 बूंदें लागू करें। बुलबुले फार्म चाहिए, अगर तेल दूर साफ कर लें और इसे पुन: लागू।
    3. स्लाइड ओ स्थितिमंच एन। विसर्जन के तेल स्लाइड के साथ संपर्क में आता है, जब तक धीरे धीरे कंडेनसर बढ़ा। इस तेल स्लाइड के साथ संपर्क में आता है, जहां रोशनी की तेजी से brightening अंगूठी के माध्यम से ध्यान देने योग्य हो जाएगा।
  2. जगह में 10X उद्देश्य रखो। ध्यान दें और oculars के माध्यम से परीक्षण करके कंडेनसर पंक्ति में।
    1. चमक को बड़ा किया जाता है जब तक मोटे उद्देश्य ध्यान केंद्रित घुंडी के माध्यम से ऊपर और नीचे मंच ले जाएँ।
    2. अधिकतम चमक पाया जाता है जब तक कंडेनसर ऊपर ध्यान केंद्रित करने और नीचे कंडेनसर समायोजन घुंडी के माध्यम से ले जाएँ। देखने के क्षेत्र में संभव प्रतिभाशाली केंद्रीय स्थान बनाने का प्रयास।
    3. यदि आवश्यक हो तो, उज्ज्वल हाजिर केंद्र के लिए आवश्यक के रूप में कंडेनसर संरेखण knobs समायोजित करें।
    4. ध्यान में उज्ज्वल हाजिर लाने के लिए ठीक उद्देश्य ध्यान केंद्रित घुंडी का प्रयोग करें। एक अलग बढ़ाई प्राप्त करने के उद्देश्यों को बदल रहा है, फोकस विमान बदल डालना। 100X उद्देश्य का उपयोग करते समय, वें बढ़ाने के लिए coverslip पर विसर्जन के तेल की एक बूंद लागूई छवि और उद्देश्य लेंस को नुकसान से बचने।
  3. छवियों पर कब्जा
    1. ब्याज की एक क्षेत्र को खोजने के चरण नियंत्रक का प्रयोग करें। इस क्षेत्र में प्रयोग की जरूरतों से निर्धारित किया जाएगा। धातु ऑक्साइड नैनोकणों के साथ suffused क्षेत्रों में अक्सर उनके बिना क्षेत्रों की तुलना में उज्जवल दिखाई के रूप में एक ठेठ सूचक, आसपास के क्षेत्रों के साथ उच्च विपरीत हो जाएगा।
    2. रोशनी संतुलित करने के लिए आवश्यक के रूप में कंडेनसर ध्यान समायोजन, ठीक उद्देश्य फोकस घुंडी का उपयोग ध्यान में क्षेत्र लाओ। देखने के क्षेत्र के भीतर एक उच्च विपरीत, अच्छी तरह से परिभाषित क्षेत्र पाने की।
    3. (हाइपरस्पेक्ट्रल कैमरे के लिए) निर्धारित (ऑप्टिकल कैमरे के लिए) क्या छवियों या datacubes पर कब्जा कर लिया है, और क्या अनुक्रम में किया जाएगा। आमतौर पर, ऑप्टिकल छवियों को एक 10X हवा उद्देश्य, 40X हवा उद्देश्य, और 100X तेल विसर्जन उद्देश्य और एक 100X तेल विसर्जन उद्देश्य के साथ एक इसी एचएसआई datacube के साथ प्राप्त कर रहे हैं।
      1. ऑप्टिकल इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें। सेटिंग & "पर क्लिक करें# 8221; मेनू पट्टी में। "कब्जा घटना के लिए छवि पर कब्जा बटन" का चयन करें। (झगड़ा इस प्रयोग के लिए इस्तेमाल किया गया था) संग्रहीत छवि प्रारूप का चयन करें; एक फ़ाइल नाम आवंटित; ब्राउज़ करें और एक संग्रहीत छवि फ़ोल्डर का चयन करें; डिफ़ॉल्ट timelapse रखना; ओके पर क्लिक करें"।
      2. "जोखिम" मेनू में उच्चतम विपरीत छवि बनाने कि प्रदर्शन सेटिंग्स का चयन करें (इस अध्ययन, 0.0% के स्तर, 3.0 डीबी के लाभ, और 35 एमएस के शटर के लिए इस्तेमाल किया गया)।
      3. मेनू पट्टी में "छवि" बटन पर क्लिक करके छवि पर कब्जा है। संदर्भ प्रदान करने के लिए, माइक्रोस्कोप उद्देश्यों को बदलकर उच्च वृद्धि पर उन लोगों के अलावा कई कम बढ़ाई darkfield छवियों पर कब्जा।
        नोट: इन ऑप्टिकल छवियों को देखने के लिए और बाद में दृश्य निरीक्षण के लिए बेहतर सौंदर्य उपस्थिति का एक बड़ा क्षेत्र है करते हैं, के रूप में हाइपरस्पेक्ट्रल कैमरा के साथ कब्जा कर लिया जाएगा कि किसी भी datacubes के रूप में ही बढ़ाई ऑप्टिकल छवियों पर कब्जा। यह किसी भी datac जरूरी है कियह उद्देश्य बदलते माइक्रोस्कोप प्रकाशिकी के संचरण स्पेक्ट्रा, पर कब्जा कर लिया स्पेक्ट्रा बदल रहा है, और इस तरह वर्णक्रम कोण मैपर (एसएएम) की सटीकता को कम करने में परिवर्तन संभव है कि के रूप में बाद में प्रेतसंबंधी, उपयोग लगातार बढ़ाई विश्लेषण किया जाएगा कि ubes। एक datacube एक अलग उद्देश्य के साथ प्राप्त की एक और datacube की तुलना में है, तो सैम समारोह काम नहीं कर सकते।
    4. हाइपरस्पेक्ट्रल कैमरे के लिए माइक्रोस्कोप पर प्रकाश स्रोत घुंडी द्वारा पुनः निर्देशित हाइपरस्पेक्ट्रल कैमरा इमेजिंग डिटेक्टर का चयन करें। प्रकाश हाइपरस्पेक्ट्रल कैमरे की दिशा में निर्देशित किया जाता है, तो कोई छवि ऑप्टिकल कैमरा सॉफ्टवेयर में दिखाया जाएगा। कदम 2.4.4 में निर्दिष्ट के रूप में एक यह आवश्यकता हो सकती हो, कम लेकिन ऑप्टिकल इमेजिंग सॉफ्टवेयर खिड़की बंद नहीं करते।
  4. Datacubes कैप्चरिंग
    1. एचएसआई datacubes के अधिग्रहण के लिए हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग सॉफ्टवेयर खोलें। प्रकाश गाइड हाइपरस्पेक्ट्रल कैमरे को निर्देश दिया है सुनिश्चित करें।
    2. ओपन "हाईपerspectral माइक्रोस्कोप एचएसआई माइक्रोस्कोप नियंत्रण "" मेनू पट्टी में और चुनें "।
    3. उद्देश्य बढ़ाई सेट और पथ बचाने के लिए। विशिष्ट तो कोई ओवरराइटिंग होता है सभी छवियों और फ़ाइलों के नाम करने के लिए सुनिश्चित करें। बड़े क्षेत्रों पर कब्जा करने के लिए आवश्यक अतिरिक्त समय का एक महत्वपूर्ण राशि के साथ, दृश्य या लाइनों (इस अध्ययन के लिए 720 लाइनों का उपयोग) की संख्या के क्षेत्र का समायोजन करके सेटिंग्स में क्षेत्र पर कब्जा बदलें। अंत में, जोखिम समय (इस अध्ययन के लिए 0.25 सेकंड) की स्थापना की। डिफ़ॉल्ट करने के लिए और सब कुछ छोड़ दो, और छवि को देखने के लिए "पूर्वावलोकन एचएसआई" पर क्लिक करें।
      नोट: प्रतीत होता है कि तीव्रता ग्राफ क्षैतिज अक्ष में दर्ज हो जाएगा कि एचएसआई datacube से पता चलता है। ऊर्ध्वाधर अक्ष एचएसआई datacube में कब्जा कर लिया जाएगा कि स्पेक्ट्रा की तरंग दैर्ध्य का प्रतिनिधित्व करता है। एक वर्णक्रमीय तरंग दैर्ध्य के लिए इसी तीव्रता ग्राफ पर किसी भी स्थिति में कर्सर रखकर छवि भर में सभी बिंदुओं की तीव्रता का कारण बनता है, कि तरंग दैर्ध्य में, दिखाया जा सकता है।
    4. , या जोखिम समय समायोजित करने के लिए पूर्वावलोकन रद्द करके स्रोत चमक, कंडेनसर फोकस समायोजन करके इस पूर्वावलोकन से तीव्रता को समायोजित करें। उत्तरार्द्ध सबसे अच्छा परिणाम प्राप्त होते हैं, लेकिन वृद्धि की जोखिम समय छवि के लिए लंबे समय तक ले जा सकते हैं। उद्देश्य अधिक महत्वपूर्ण चोटियों पर्याप्त बड़ी है, लेकिन डिटेक्टर के लिए अधिकतम तीव्रता से अधिक नहीं होना करने के लिए है; यहाँ, आदर्श रेंज 1000 के बीच और 16,000 यूनिट है।
    5. "कब्जा" पर क्लिक करें। माइक्रोस्कोप एक अंधेरे वर्तमान छवि लेने के लिए पूछना होगा। संरेखण परेशान करने के लिए नहीं, ताकि ऊपरी स्लाइड पट्टी या ध्यान एपर्चर (रीडायरेक्ट करेंऔर अन्य प्रकाशिकी के किसी का ध्यान केंद्रित), और "ठीक" पर क्लिक करें। सही स्थिति के लिए स्लाइड पट्टी या एपर्चर को बहाल करने और छवि प्रकट करने के लिए जब शीघ्र फिर "ठीक" पर क्लिक करें। के बारे में 5 मिनट के समय में अधिक विशिष्ट हैं, हालांकि इमेजिंग, 30 मिनट तक का समय लग सकता है। अब जोखिम बार अब इमेजिंग बार पैदा होती हैं। एक प्रगति सूचक मौजूद है। प्रगति सूचक पूरा होने से पहले शारीरिक रूप से दायरे से परेशान करने के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
    6. नाम के साथ चार नए खिड़कियों का निरीक्षण करें: "उपलब्ध बैंड सूची", "# 1zoom", "# 1scroll" और "# 1 आरजीबी बैंड"। यह सब भविष्य में संदर्भ के लिए datacube जैसा है "# 1RGB बैंड" खिड़की को अधिकतम।
    7. सही datacube क्लिक करें और एक झगड़ा के रूप में इसे बचाने के लिए और "ठीक" पर क्लिक करें। समाप्त इमेजिंग हैं; सभी नमूनों को दूर करो; पानी में 70% isopropanol साथ सभी तेल उजागर सतहों को साफ; अधिकतम ऊंचाई करने के लिए मंच बढ़ा; गैर परिचालन की स्थिति में कम से कम ऊंचाई और प्रेस करने के लिए निचले कंडेनसर; बंदया नीचे प्रकाश स्रोत, चरण नियंत्रक, और कैमरों हाल चलाना।

संदर्भ स्पेक्ट्रल पुस्तकालय 3. निर्माण

  1. संदर्भ स्पेक्ट्रा का चयन
    1. एचएसआई वर्णक्रम प्रोफाइल मैट्रिक्स निर्भर कर रहे हैं, के बाद से प्रयोगात्मक नमूने के रूप में एक ही मैट्रिक्स में निहित हित की सामग्री को रोकने के लिए जाना जाता है कि एक सकारात्मक नियंत्रण का चयन करें।
      1. इस अध्ययन के लिए, एक सामयिक जोखिम अध्ययन से प्रयोगात्मक सुअर त्वचा के ऊतकों की तुलना के लिए धातु ऑक्साइड के रूप में नैनोकणों सकारात्मक नियंत्रण की उच्च खुराक के साथ इंजेक्शन सुअर त्वचा का उपयोग करें। निलंबन में धातु ऑक्साइड नैनोकणों के वर्णक्रम प्रोफाइल की वजह से विभिन्न matrices के लिए उत्पन्न होता है और जांच की और ऊतकीय प्रयोगात्मक नमूने के लिए एक अनुचित सकारात्मक नियंत्रण होना पाया गया है।
    2. 2.4 चरण में वर्णित के रूप में सकारात्मक नियंत्रण से एक datacube प्राप्त करते हैं।, हाइपरस्पेक्ट्रल कैमरे का उपयोग।
      1. विशेष रूप से सतर्क रहो, जब एसईइस आंतरिक कण फिल्टर सामग्री की पहचान करेगा जिसके द्वारा प्राथमिक मीट्रिक है, के रूप में तीव्रता tting। डिटेक्टर (यहाँ, 16,000 इकाइयों) की संतृप्ति बिंदु से ऊपर कोई भी तीव्रता (2.4.5 कदम को देखें।) अमान्य डेटा का परिणाम देगा।
    3. सही छवि विंडो में, क्लिक करें और "Z-प्रोफाइल स्पेक्ट्रम" पर क्लिक करें छोड़ दिया है। एक पॉप-अप स्पेक्ट्रल प्रोफाइल विंडो दिखाई देगा। Datacube पर ब्याज की पिक्सल, विशेष रूप से प्रतिभाशाली लोगों को या आत्मविश्वास से ब्याज की सामग्री प्रतिनिधित्व के रूप में पहचाना जा सकता है कि उन पर क्लिक करें छोड़ दिया। जुड़े स्पेक्ट्रम दिखा स्पेक्ट्रल प्रोफ़ाइल खिड़की का निरीक्षण करें। विशेष रूप से उनके निम्नतम और उच्चतम मूल्य और जो तरंग दैर्ध्य यह करने के लिए संगत का ध्यान रखना।
      1. आसपास के ऊतकों को बहुत उज्ज्वल रिश्तेदार, आसानी से पहचाने कणों के साथ विशेष रूप से उन लोगों के हैं कि ब्याज के क्षेत्रों पर क्लिक करके सकारात्मक नियंत्रण नमूना सर्वेक्षण सर्वेक्षण है। इन कणों मेटर होने की संभावना सबसे अधिक हैविशेष रूप से धातुओं के मामले में ब्याज की ials।
    4. Datacube में मौजूद कणों की पहचान करने के लिए "कण विश्लेषण" मेनू के तहत "कण फिल्टर" उपकरण का उपयोग करें। नई पॉप-अप विंडो में, "स्पेक्ट्रल मैक्स से अधिक होना चाहिए" निरीक्षण करते हैं। यह कदम 3.1.3 में टिप्पणियों द्वारा निर्धारित किया जाएगा। यह ब्याज की सामग्री की तुलना में पृष्ठभूमि पिक्सल से अधिक है, लेकिन कम है तो यह मूल्य निर्धारित करें। "मान्य डेटा मैक्स" अधिकतम तीव्रता (यहाँ, 16,000 इकाइयों) है।
      1. डिफ़ॉल्ट करने के लिए अन्य मानकों को छोड़ दें, लेकिन "आकार थ्रेशोल्ड" बॉक्स का समायोजन करके आकार के आधार पर वस्तुओं बाहर। या तो इस बिंदु पर, या विश्लेषण चलाने के बाद इस डेटा को बचाओ। इस प्रयोग के लिए, निम्न पैरामीटर का उपयोग करें: स्पेक्ट्रल मैक्स से अधिक होना चाहिए: 5000; मान्य डेटा मैक्स: 16,000; आकार थ्रेशोल्ड (पिक्सेल): एक बार सभी मापदंडों निर्धारित किया गया है 400, "ठीक" पर क्लिक करें।
    5. के विवरण के साथ जिसके परिणामस्वरूप ग्राफ का निरीक्षणसंकेत दिया तीव्रता दहलीज के भीतर पता लगाया कणों; इस डेटा का निर्यात किया जा सकता है। ब्याज की सामग्री की विशेषता अधिकतम परावर्तन तरंग दैर्ध्य में जाना जाता है, तो एक समान "मैक्स WL" मूल्य नहीं है कि उन कणों का चयन करें; अन्यथा, "सभी का चयन करें" पर क्लिक करें। फिर "निर्यात" पर क्लिक करें; "करने के लिए स्पेक्ट्रल पुस्तकालय"। एक फ़ाइल नाम फिर "ठीक" पर क्लिक करें चुनें।
  2. झूठी सकारात्मक स्पेक्ट्रा हटाये
    1. एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करेंगे कि एक नमूना चयन करें। इस तरह की एक नमूना तैयार किया है और सभी प्रयोगात्मक नमूने ब्याज की सामग्री के लिए समान या नैनोकणों के अभाव की गारंटी है कि बचाने के रूप में एक ही तरीके से इलाज किया जाना चाहिए था।
      नोट: यह एचएसआई वर्णक्रम प्रोफाइल मैट्रिक्स निर्भर कर रहे हैं के रूप में नकारात्मक नियंत्रण की मैट्रिक्स, प्रयोगात्मक नमूनों की मैट्रिक्स के रूप में एक ही है कि महत्वपूर्ण है। इस अध्ययन के लिए, हम नकारात्मक रूप में धातु ऑक्साइड से nanomaterials के संपर्क में नहीं था कि सुअर त्वचा का इस्तेमाल कियानियंत्रित करता है।
    2. हाइपरस्पेक्ट्रल कैमरे का उपयोग कर, कदम 2.4.7 में वर्णित के रूप में नकारात्मक नियंत्रण से कई datacubes प्राप्त करते हैं। (यह कुछ दूषित पदार्थों संदर्भ स्पेक्ट्रा में हो सकता है कि इस घटना में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है) कम से कम एक की आवश्यकता है, लेकिन अधिक चयनात्मकता बढ़ाने के लिए लिया जा सकता है।
    3. निम्न चरणों में निर्देश के रूप में, क्रमानुसार कदम में कब्जा 3.2.2 (नकारात्मक नियंत्रण) प्रत्येक datacube के खिलाफ कदम 3.1 (सकारात्मक नियंत्रण) में एकत्र वर्णक्रमीय पुस्तकालय फिल्टर करने के लिए हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करें:
      नोट: एक अलग फाइल करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप, फ़िल्टर वर्णक्रमीय पुस्तकालय को बचाने, और ब्याज की सामग्री के लिए संदर्भ वर्णक्रमीय पुस्तकालय के रूप में इस्तेमाल करते हैं।
      1. मुख्य कार्यक्रम टूलबार पर स्थित विश्लेषण मेनू के तहत "फिल्टर स्पेक्ट्रल पुस्तकालय" पर क्लिक करें। "ओपन" पर क्लिक करें; "नई फाइल" और 3.1 कदम में बनाया वर्णक्रमीय पुस्तकालय का चयन करें। इनपुट फ़ाइल के रूप में सकारात्मक नियंत्रण के लिए। ओके पर क्लिक करें"।
      2. ई के लिएxternal स्रोत, वर्णक्रमीय डेटा बॉक्स के तहत "छवि" का चयन करें। प्रसंस्करण मानकों बॉक्स के तहत डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स रखें। छानने का पुस्तकालय के लिए एक आउटपुट का नाम (इस मूल की तुलना में अलग होना चाहिए, या एकत्र कच्चे वर्णक्रमीय पुस्तकालय खो जाएगा) का चयन करें। ओके पर क्लिक करें"।
      3. "ओपन" पर क्लिक करें; "नई फाइल" और एक स्रोत छवि चुनने के लिए कहा जब नकारात्मक नियंत्रण के लिए कदम 3.2.2 में कब्जा पहली datacube का चयन करें।
        नोट: सॉफ्टवेयर वर्णक्रमीय पुस्तकालय का विश्लेषण और नकारात्मक नियंत्रण datacube के किसी भी स्पेक्ट्रम मेल खाता है कि प्रत्येक स्पेक्ट्रम निकाल देंगे। चयन के मापदंड से पृष्ठभूमि निकाल रहा है, जिससे झूठी सकारात्मक के लिए क्षमता कम कर देता है। इस (इस सार स्वचालित रूप से सहेजा नहीं गया है उस पर ध्यान दें) किया जाता है जब एक सारांश उपलब्ध हो जाएगा।
      4. कदम 3.2.3.3 बाद परिणामस्वरूप (बनाया पिछले फ़िल्टर्ड वर्णक्रमीय पुस्तकालय का चयन करें, कदम 3.2.3.2 सह: अतिरिक्त छानने वांछित है, को छोड़कर, कदम 3.2.3.1 से दोहराएँ।mpletes); कदम 3.2.3.3 में, कदम 3.2.2 से अगले datacube का चयन करें।
        नोट: नमूने के प्रकाश की एक काफी मात्रा में (जैसे, कार्बन नैनोट्यूब) और बिखराव यदि दीपक स्पेक्ट्रम के लिए सही करने और सामान्य आवश्यक हो सकता है / या एक नकारात्मक नियंत्रण के खिलाफ एक सकारात्मक नियंत्रण के वर्णक्रम पुस्तकालय छान जब शून्य स्पेक्ट्रा रहते हैं। इन परिस्थितियों हमारे अध्ययन के लिए ही नहीं उठता था और इसलिए इस सुधार प्रदर्शन नहीं था।

4. छवि विश्लेषण

  1. स्पेक्ट्रल कोण मानचित्रण
    1. सभी प्रयोगात्मक datacubes 2.4 कदम निम्नलिखित अधिग्रहण किया गया है एक बार हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, स्पेक्ट्रल मेनू, मानचित्रण विधियों सबमेनू से "स्पेक्ट्रल कोण मैपर '(एसएएम) को खोलें। वर्णक्रम कोण मैपर ज्यामितीय तरंग दैर्ध्य के एक समारोह के रूप में तीव्रता में परिवर्तन का विश्लेषण करके स्पेक्ट्रा तुलना (यानी, यह उनकी तीव्रता को सामान्य बनाने और कोणों फिर से तुलना करके दो स्पेक्ट्रा तुलनाप्रत्येक स्पेक्ट्रा का ग्राफ) 24 ट्रेस करने के लिए करनी।
    2. खुले datacube के साथ, पॉप-अप विंडो में प्रयोगात्मक datacube के नाम का चयन करें और "ठीक" पर क्लिक करें। कोई फ़ाइल नाम सूचीबद्ध कर रहे हैं, "खुला" पर क्लिक करें; "नई फ़ाइल", प्रयोगात्मक datacube चुनते हैं, तो "ठीक" पर क्लिक करें।
      1. Endmember संग्रह नामक एक नए पॉप-अप विंडो का निरीक्षण करें: सैम। फिर "स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी फ़ाइल से" का चयन करें, मेनू पट्टी में "आयात" पर क्लिक करें। नामित स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी इनपुट फ़ाइल में दिखाई देगा एक पॉप-अप विंडो। कदम 3.2.3 में बनाया गया था कि संदर्भ की स्पेक्ट्रल लाइब्रेरी खोलें। और "ठीक" पर क्लिक करें। "इनपुट स्पेक्ट्रल पुस्तकालय" नाम का एक नया पॉप-अप विंडो का निरीक्षण करें।
      2. "सभी आइटम का चयन करें" पर क्लिक करें; "ठीक है" ठीक है "रंग" पर क्लिक करें और क्लिक करें "सभी के लिए डिफ़ॉल्ट रंग लागू करें" क्लिक करें। "लागू करें" के बाद ", सभी का चयन करें" और फिर आउटपुट फ़ाइल नाम एक चुनें"ठीक" क्लिक घ। स्पेक्ट्रल कोण मैपर डेटा का विश्लेषण करने और बचाने के लिए एक कुछ सेकंड ले जाएगा।
    3. हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग सॉफ्टवेयर में datacube खोलें। छवि खिड़की के ओवरले मेनू में "वर्गीकरण" का चयन करें, तो फ़ाइल नाम नेविगेट करने के लिए और "ठीक" पर क्लिक करें। उपयोगकर्ता अब वे छवि में करने के लिए मैप देखने के लिए जहां पुस्तकालय से किसी भी स्पेक्ट्रम ओवरले कर सकते हैं।
    4. 4.2 कदम के रूप में वर्णित एक एकीकृत रंग योजना (जैसे अन्य सॉफ्टवेयर के द्वारा आसान विश्लेषण के लिए, के रूप में वांछित है, छवि विंडो में ओवरले मेनू के माध्यम से खोला "इंटरएक्टिव वर्ग उपकरण" में विकल्प मेनू से "वर्गों मर्ज" विकल्प का चयन करें ।)।
    5. (आमतौर पर, में "अवर्गीकृत" के अलावा सब कुछ सूची "वर्गों के आधार में विलय करने के लिए") गठबंधन है, और "आधार वर्ग 'की सूची में से एक भी स्पेक्ट्रम का चयन करें, फिर" ठीक "क्लिक करने के लिए सभी वर्गीकरण पर प्रकाश डाला। अब होगा repres यही रंगसभी चयनित स्पेक्ट्रा ईएनटी।
    6. चयनित रंग पर क्लिक करें और सभी मिलान स्पेक्ट्रा कि रंग में दिखाया जाएगा।
    7. डिफ़ॉल्ट रूप से काला है, जो "अवर्गीकृत" रंग बॉक्स, पर एक काले रंग की पृष्ठभूमि, cIick से अधिक मिलान स्पेक्ट्रा दिखा देंगे कि एक दुरंगा छवि प्राप्त करने के लिए। एक दुरंगा छवि का पालन। यह कदम "अवर्गीकृत" रंग बॉक्स पर फिर से क्लिक करके उलट हो सकता है।
    8. सही किसी भी ओवरले वर्तमान में सक्रिय सहित एक झगड़ा के रूप में छवि को बचाने के लिए क्लिक करें।
      नोट: भविष्य इमेजिंग प्रसंस्करण के लिए, एक दुरंगा छवि का इस्तेमाल किया जाएगा।
    9. मानचित्रण के आँकड़े प्राप्त करने के लिए "इंटरएक्टिव कक्षा उपकरण" विंडो में विकल्प मेनू से "कक्षा वितरण" का चयन करें। इस डाटा को कई पिक्सल तुच्छ (अवर्गीकृत) और कितने ब्याज की सामग्री के रूप में पहचान की गई कैसे थे प्रतिनिधित्व करता है। बॉलीवुड की संख्या मैप किया कणों की संख्या के साथ अनुरूप नहीं है कि ध्यान दें। यह जानकारी स्वचालित रूप से r नहीं हैecorded।
  2. हाइपरस्पेक्ट्रल में कण विश्लेषण छवियाँ मैप
    1. एनआईएच ImageJ सॉफ्टवेयर में छवियों को खोलें।
    2. सबमेनू, "सीमा" समारोह को समायोजित, छवि मेनू का प्रयोग करें। अन्य सभी सामग्री से ब्याज के कणों को अलग है कि मापदंडों का चयन करें। इस अध्ययन के लिए निम्नलिखित सीमा मापदंडों का उपयोग करें: डिफ़ॉल्ट सीमा विधि, लाल रंग, रंग अंतरिक्ष HSB, अंधेरे पृष्ठभूमि चेकबॉक्स, रंग, संतृप्ति और चमक के लिए जाँच पास चेक बॉक्स की जाँच की।
      नोट: इस मामले में काफी भिन्न हो सकते हैं। एक मैप किए गए datacube का विश्लेषण, यह एक ही रंग के लिए सभी प्रासंगिक वर्गों को एकीकृत करने और छवि (4.1.8 के लिए 4.1.4 कदम) पैदा करने से पहले सभी अवर्गीकृत रंगों के साथ कि रंग overlaying द्वारा सरल बनाया जा सकता है।
    3. क्षेत्र के लिए जानकारी प्राप्त मतलब होगा जो समारोह, न्यूनतम और अधिकतम मानों "कणों का विश्लेषण", विश्लेषण मेनू का प्रयोग करें। आकार 0-अनंत, घेरा: इस अध्ययन के लिए, यहाँ मापदंडों का उपयोग0-1, इस शो में कुछ भी नहीं, प्रदर्शन परिणामों चेक बॉक्स की जाँच।
    4. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, इसी तरह के नियंत्रण के नमूने में स्थित कणों की संख्या और आकार के साथ सांख्यिकीय तुलना सक्रिय करने के लिए एक और सॉफ्टवेयर प्रोग्राम के लिए इस डेटा निर्यात। हम ImageJ डेटा के विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट का उपयोग कर सुझाव देते हैं। कदम 4.2.4 के बाद परिणाम तालिका में प्रदर्शित डेटा एक स्प्रेडशीट के लिए कॉपी किया जाना चाहिए। औसत समारोह में एक कण का मतलब आकार निर्धारित करने के लिए क्षेत्र स्तंभ पर इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि मैक्स समारोह, कणों की संख्या निर्धारित करने के लिए पहले (शीर्षकहीन) स्तंभ पर इस्तेमाल किया जा सकता है। भविष्य में, प्रयोगात्मक सत्यापन (जैसे, मंदिर) नौकरशाही का आकार घटाने के लिए एक स्थापित मानक के खिलाफ मतलब आकार निर्धारित करने में इस समारोह की जांच करने के लिए काम किया जाएगा।

Representative Results

हाइपरस्पेक्ट्रल माइक्रोस्कोपी स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री के समान तरीके में सामग्री की पहचान करने की क्षमता के लिए उपयोगी है। चित्रा 1 में संकेत के रूप में, प्रत्येक सामग्री कई विशेषता स्पेक्ट्रा और अद्वितीय है, जो अपने reflectance के लिए एक समग्र आकार की है। इसके अलावा, चित्रा 1 वर्णक्रम प्रोफाइल के मैट्रिक्स निर्भर प्रकृति दिखाता है: ऊतकीय ऊतकों के नमूनों में तीन धातु आक्साइड के प्रत्येक (शीर्ष पैनल) के लिए वर्णक्रम प्रोफाइल जलीय निलंबन में तीन धातु आक्साइड से प्रत्येक के लिए वर्णक्रम प्रोफाइल (से अलग कर रहे हैं नीचे का पैनल)। एक ही मैट्रिक्स में अज्ञात के नमूने के लिए विशिष्ट वर्णक्रम प्रोफाइल मानचित्रण द्वारा, तकनीक एक सामग्री की उपस्थिति या अनुपस्थिति का निर्धारण करने के लिए उपयोगी है, और यह भी अर्द्ध मात्रात्मक नमूनों में सामग्री के रिश्तेदार मात्रा तुलना कर सकते हैं।

सकारात्मक नियंत्रण त्वचा के नमूनों से बनाए संदर्भ वर्णक्रमीय पुस्तकालयों प्रयोगात्मक को मानचित्रण के लिए उपयुक्त हैंत्वचा के नमूनों। चित्रा 2 में देखा, संदर्भ वर्णक्रमीय पुस्तकालयों इसी सकारात्मक नियंत्रण करने के लिए अच्छी तरह से नक्शा और इसी नकारात्मक नियंत्रण करने के लिए मैप नहीं है।

तकनीक का सबसे महत्वपूर्ण लाभ के नमूनों में ब्याज की सामग्री के निम्न स्तर का पता लगाने के लिए, साथ ही contaminants से उन्हें अलग करने की क्षमता है। । उदाहरण के लिए, अलग-अलग नैनोट्यूब एक 20-30 ग्राम चूहा 25 में 40 माइक्रोग्राम प्रति के रूप में के रूप में कम खुराक की साँस लेना दौरान फेफड़ों में मनाया जा सकता है 3 आंकड़ा इस ऊतकीय त्वचा के नमूनों में दर्शाता है: कुछ कणों darkfield ऑप्टिकल छवि में आसानी से स्पष्ट कर रहे हैं, जबकि (स्तंभ 2), दूसरों brightfield माइक्रोस्कोपी (स्तंभ 1) या अन्य तरीकों का उपयोग कर याद किया गया हो सकता है कि हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग (कॉलम 3) का उपयोग कर पता चला रहे हैं। darkfield एचएसआई का उपयोग भी सरल brightfield माइक्रोस्कोपी से अधिक विशिष्टता को सुधारने के लिए कार्य करता है। ये चित्र तो, विश्लेषण के अधिक मात्रात्मक रूपों के लिए विषय हो सकता है nImageJ के माध्यम से otably कण विश्लेषण।

बढ़ी darkfield माइक्रोस्कोपी भी हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग के अभाव में कई अलग अलग आवेदन किया है। पहली उच्च गुणवत्ता, उच्च विपरीत छवियों को उत्पन्न करने की क्षमता है। यह सबसे अच्छा है जिसमें ब्याज के कणों को अपने brightfield समकक्षों की तुलना में आसानी से पहचाने जा सकते हैं, चित्रा 3 द्वारा प्रदर्शन किया है। हाइपरस्पेक्ट्रल मानचित्रण के अभाव में, सावधानी हित के एक कण से दूषित पदार्थों कण भ्रमित बचने के लिए आवश्यक है, हालांकि इन छवियों को भी, मात्रात्मक कण विश्लेषण करने के लिए विषय हो सकता है।

आकृति 1
वर्णक्रमीय पुस्तकालयों (निलंबन में नैनोकणों) की तुलना में चित्रा 1. संदर्भ वर्णक्रमीय पुस्तकालयों (ऊतक मैट्रिक्स)। यह आंकड़ा नेन से एक संदर्भ वर्णक्रमीय पुस्तकालय पैदा करने के महत्व को दर्शाताप्रयोगात्मक नमूने के रूप में एक ही मैट्रिक्स में ब्याज की omaterials। पहली पंक्ति इस अध्ययन (एल्युमिना, सिलिका और Ceria) में प्रत्येक सामग्री के लिए संदर्भ वर्णक्रमीय पुस्तकालय (आरएसएल) से पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

इस आरएसएल सकारात्मक नियंत्रण के ऊतकों के नमूनों नकारात्मक नियंत्रण ऊतकों के नमूनों के खिलाफ फ़िल्टर किया गया है, जहां इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि द्वारा बनाया गया था। दूसरी पंक्ति एक गिलास स्लाइड पर तरल निलंबन में ब्याज की नैनोकणों से बनाए वर्णक्रमीय पुस्तकालयों (एसएल) से पता चलता है। एक अधिक घुमावदार और कम विशिष्ट चोटी के चारों ओर 650 की तरंग दैर्ध्य में चारों ओर 600 सिलिका, एक चोटी के लिए कम से एल्यूमिना एनपी निलंबन SL में देखा गया था, जबकि एल्यूमिना के लिए, 500 और 650 की तरंग दैर्ध्य में एक bimodal शिखर, आरएसएल में पाया गया था एक अधिक घुमावदार और कम विशिष्ट शिखर arou पर सिलिका एनपी निलंबन SL में देखा गया था, जबकि आरएसएल में मौजूदएक कम विशिष्ट चोटी यह एनपीएस एम्बेडेड रहे हैं, जिसमें मैट्रिक्स बनाता चलता है कि चारों ओर 560 पर Ceria एनपी निलंबन SL में देखा गया था, जबकि एन डी Ceria के लिए 600, एक bimodal शिखर, आरएसएल में 520 और 620 के तरंग दैर्ध्य में पाया गया था के रूप में विशिष्ट प्रयोग के लिए SL बनाने के लिए नियंत्रण का चयन करते समय काफी हो सकता है कि स्पेक्ट्रा में एक बदलाव।

चित्र 2
चित्रा 2. संदर्भ वर्णक्रमीय पुस्तकालयों (ऊतक मैट्रिक्स) सकारात्मक नियंत्रण और नकारात्मक नियंत्रण सुअर त्वचा के ऊतकों पर मैप किया। प्रत्येक आरएसएल (बाएं स्तंभ) अपनी इसी सकारात्मक नियंत्रण (मध्य स्तंभ) को अच्छी तरह से नक्शे और इसके नकारात्मक नियंत्रण (सही कॉलम) इसी को मैप नहीं है कि यह आंकड़ा।, प्रयोगात्मक नमूने के मानचित्रण के लिए उचित रूप RSLs की पुष्टि के रूप में कार्य करता है कृपया ज क्लिक करेंअरे यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्र तीन
धातु ऑक्साइड नैनोकणों के संपर्क में प्रयोगात्मक सुअर त्वचा के ऊतकों के चित्रा 3. हाइपरस्पेक्ट्रल मानचित्रण। क्रमश: एपिडर्मिस, डर्मिस, और चमड़े के नीचे ऊतक: ऊपर से नीचे तक पंक्तियाँ अलग सतही से गहरी परत करने के लिए त्वचा की परतों के अनुरूप हैं। पहली पंक्ति निलंबन में एल्यूमिना एनपीएस से अवगत कराया गया था कि एक त्वचा के नमूने से एपिडर्मिस की परत corneum पता चलता है; दूसरी पंक्ति के निलंबन में एनपीएस सिलिका के लिए अवगत कराया गया था; और तीसरी पंक्ति के निलंबन में एनपीएस Ceria करने के लिए। प्रत्येक स्तंभ विभिन्न तकनीकों के साथ imaged त्वचा के एक ही क्षेत्र दर्शाया गया है। प्रथम स्तंभ एक लाल चौक में संलग्न क्षेत्र बढ़ाया गया था, जहां brightfield माइक्रोस्कोपी (40X पत्रिका .; पैमाने बार = 50 माइक्रोन), से मेल खाती है (100x पत्रिका; पैमाने बार = 10 माइक्रोन) बढ़ाया darkfield माइक्रोस्कोपी के साथ (ईडीएफसफेद तीर उच्च विपरीत एनपीएस की ओर इशारा कर रहे हैं, जहां दूसरे कॉलम में एम)। तीसरे स्तंभ में एक ही उच्च विपरीत एनपीएस (सफेद तीर) दिखा रहा है, एक हाइपरस्पेक्ट्रल कैमरा (एचएसआई) के साथ प्राप्त किया गया था। EDFM और एचएसआई छवियों 100X बढ़ाई लिया गया था; पैमाने बार 10 माइक्रोन =। चौथे स्तंभ एल्यूमिना एनपीएस में हरे, लाल रंग में सिलिका एनपीएस और Ceria एनपीएस में दिखाए गए हैं, जहां प्रत्येक जोखिम समूह, के लिए संबंधित आरएसएल के खिलाफ मैप किया एचएसआई छवि को दर्शाता है, पीले, क्रमशः। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

पारंपरिक ऊतकीय धुंधला, धातु ऑक्साइड नैनोकणों की पहचान और विश्लेषण आया है कि ऊतकों के नमूनों EDFM, एचएसआई मानचित्रण, और छवि विश्लेषण तकनीक का एक संयोजन के माध्यम से हासिल किया जा सकता है। , यह नमूने इष्टतम दृश्य के लिए 5-10 माइक्रोन की मोटाई को sectioned हैं कि महत्वपूर्ण है, ऊतक विज्ञान या immunohistochemistry के लिए नमूना तैयार करने में लचीलापन (दाग के प्रकार के उदाहरण के लिए, निश्चित या जमे हुए ऊतकों का उपयोग) जबकि वहाँ। यहां इस्तेमाल नमूने hematoxylin और eosin के साथ दाग और coverslipped, कांच खुर्दबीन स्लाइड पर मुहिम शुरू की, formalin-तय की और आयल एम्बेडेड पहले 6 माइक्रोन मोटाई के लिए एक रोटरी microtome साथ सेक्शनिंग के लिए गए थे। एक पूर्व vivo त्वचीय पैठ विष विज्ञान सहयोग से सुअर त्वचा के ऊतकों इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया। ऊतकों जलीय निलंबन में धातु ऑक्साइड नैनोकणों (एल्युमिना, सिलिका, Ceria) से अवगत कराया गया। हित के क्षेत्र (एस) की जांच (उच्च विपरीत Elemeएनटीएस) EDFM के साथ बाद में एचएसआई मानचित्रण और विश्लेषण की सुविधा है कि एक महत्वपूर्ण पहला कदम है। सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के नमूने imaged और संदर्भ के लिए एक वर्णक्रमीय पुस्तकालय बनाने के क्रम में पहले विश्लेषण किया जाना चाहिए। सकारात्मक नियंत्रण से एकत्र स्पेक्ट्रा एक सकारात्मक नियंत्रण के वर्णक्रम पुस्तकालय के लिए निर्यात कर रहे हैं। फिर, नकारात्मक नियंत्रण छवियों से सभी स्पेक्ट्रा विशिष्टता को सुधारने के लिए सकारात्मक नियंत्रण के वर्णक्रम पुस्तकालय से घटाया जाता है (झूठी सकारात्मक कम)। जिसके परिणामस्वरूप फ़िल्टर किया वर्णक्रमीय पुस्तकालय ब्याज की सामग्री के विश्लेषण के लिए कार्य करता है कि आरएसएल माना जाता है। सभी ऊतकों के नमूनों ही इमेजिंग प्रक्रिया से गुजरना और आरएसएल के खिलाफ मैप कर रहे हैं। परिणामस्वरूप छवि एक काले रंग की पृष्ठभूमि पर ब्याज के तत्वों के साथ ही क्षेत्रों में शामिल होंगे। इस छवि को तो ImageJ देखने के क्षेत्र प्रति मैप किया कणों के क्षेत्र प्राप्त करने के लिए अपनी सीमा और कण विश्लेषण कार्यों का उपयोग कर के साथ विश्लेषण किया जा सकता है। ImageJ से प्राप्त संख्यात्मक डेटा निर्यात किया जा सकता हैआगे के विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट के लिए एड।

यह जैविक नमूने एक दूसरे से स्वाभाविक अलग कर रहे हैं, और धुंधला तरीकों EDFM और एचएसआई के माध्यम से दृश्य को प्रभावित कर सकता है, प्रदर्शन सेटिंग्स नमूने के एक विशिष्ट प्रकार के लिए सबसे अच्छा उच्च विपरीत छवि का उत्पादन करने के लिए क्या अनुसार निर्धारित किया जाना चाहिए कि विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। झूठी सकारात्मक की कमी वर्णक्रमीय पुस्तकालयों की छानने के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, हालांकि इस संक्रमण के लिए इसी स्पेक्ट्रा संभावित सकारात्मक नियंत्रण के वर्णक्रम पुस्तकालय से फ़िल्टर किया जा सकता है, यह ब्याज के तत्व के साथ संदूषण से परहेज किया है कि विश्वसनीय नकारात्मक नियंत्रण प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है , झूठी नकारात्मक दर बढ़ रही है। सपा का उत्पादन है कि संचित कणों की एक उच्च संख्या के साथ क्षेत्रों: इसके अलावा, हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ detectable है कि स्पेक्ट्रम तीव्रता रेंज विशेष सॉफ्टवेयर की सीमा को पार नहीं कर सकते हैं (इस अध्ययन के लिए, कि 16,000 यूनिट है)तीव्रता सीमा से ऊपर ectral तीव्रता के कारण झूठी नकारात्मक की संख्या में वृद्धि के जोखिम के लिए, वर्णक्रमीय पुस्तकालय के बाहर छोड़ दिया जाता है।

एचएसआई प्रणाली पारंपरिक तरीकों पर कई फायदे प्रदान करते हैं, पर विचार करने के लिए कुछ कमियां और सीमाएं हैं। एक है पर्याप्त कंप्यूटिंग शक्ति की आवश्यकता हो सकती एकत्र ऑप्टिकल डेटा की एक बड़ी राशि है। एक अन्य संदर्भ वर्णक्रमीय पुस्तकालयों बनाया जा रहा है जब एचएसआई विशेष रूप से शुरुआत चरणों में, समय लेने वाला हो सकता है। इसके अलावा, इमेजिंग समय सरल darkfield इमेजिंग की तुलना में यह धीमी है, जिससे छवि पर कब्जा प्रति कई मिनट की आवश्यकता हो सकती है; हालांकि, यह अभी भी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा नमूना तैयार करने और दृश्य प्रदर्शन करने से भी तेज है। इसके अतिरिक्त, जटिल प्रणालियों अति विशिष्ट नियंत्रण के विकास की आवश्यकता होती है और 26 मुश्किल मानकीकृत, सार्वभौमिक संदर्भ पुस्तकालयों की स्थापना करना है, जो कई विशेषता स्पेक्ट्रा, में हो सकता है। अंत में, तकनीकअलग-अलग परमाणुओं को हल कर सकते हैं, जो इस तरह के परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी या संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में probe- या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक, की तुलना में कम संकल्प में nique का परिणाम है। इस तकनीक के संकल्प की वजह से नैनोमीटर स्तर पर या ठीक एक उप माइक्रोन स्तर पर सामग्री का पता लगाने के लिए कण आकार को मापने के लिए एक उच्च परिशुद्धता उपकरण होने से रोकता है, जो अपने फोटोनिक प्रकृति, तक सीमित है। तकनीक निश्चित ऊतक डिब्बों या सेलुलर अंगों के भीतर कणों पहचानने में सक्षम हो सकता है (जैसे सेल नाभिक के रूप में) से अधिक 1 माइक्रोन, छोटे अंगों या सुविधाओं को इस विधि के साथ सही ढंग से कल्पना करने के लिए चुनौती दे रहे हैं। इसके अलावा अपनी स्थानिक संकल्प दिया ध्यान दें, की, इस विधि एकल नैनोकणों और agglomerates 11 के बीच अंतर नहीं कर सकते हैं।

अन्य कारणों में शामिल हैं: (जैसे महान धातु के रूप में) कुछ सामग्री उन्हें आसानी से ANALY करने के लिए कर सकता है, जो बहुत अधिक परावर्तन और विशिष्ट वर्णक्रम प्रोफाइल हैज़ी और इस उपकरण के साथ प्रेतसंबंधी नक्शा। ऐसे अर्द्ध धातु इस अध्ययन में जांच की आक्साइड और कार्बन आधारित nanomaterials के 24, 27, के रूप में दूसरों की वजह से उनके मौलिक रचना, आकार के लिए अधिक चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और मैट्रिक्स के आधार पर हो सकता है। द्वारा मर्सर एट अल। दो murine साँस लेना अध्ययन में, इस अध्ययन में कार्यरत एक के लिए एक समान प्रणाली फेफड़ों में और आसपास के ऊतकों के साथ उनकी उल्लेखनीय उच्च विपरीत के आधार पर माध्यमिक अंगों में कार्बन नैनोट्यूब का पता लगाने के क्रम में इस्तेमाल किया गया था। कार्बन फाइबर की अद्वितीय आकार की पहचान के लिए एक पर्याप्त विशेषता थी क्योंकि हालांकि, हाइपरस्पेक्ट्रल मानचित्रण, या तो अध्ययन में संभावना का प्रदर्शन नहीं किया गया था। सामान्य biophysical प्रक्रियाओं के माध्यम से विशिष्ट अंगों के लिए ब्याज की नैनोकणों जमा (और अक्सर खुद को अध्ययन का विषय) अप्रत्याशित है, के बाद से एक भी लागू सकारात्मक नियंत्रण के निर्धारण के लिए मुश्किल हो सकता है और नियंत्रण मीटर की कैसे पीढ़ी के विचार की आवश्यकता: एक और विचार ऊतकों को विशेष रूप से संबंधितब्याज की एक माल की स्थिति को प्रभावित ight। एक वर्णक्रमीय पुस्तकालय ब्याज की प्राचीन नैनोकणों से बनाया जाता है, तो उदाहरण के लिए, यह कारण में परिवर्तन के कारण जैसे कण (के परिवर्तन से उत्पन्न स्पेक्ट्रा में परिवर्तन, ऊतकों या कोशिकाओं में वे एक ही नैनोकणों के लिए पुस्तकालय नक्शा करने के लिए मुश्किल हो सकता है पीएच, विघटन, ढेर, प्रोटीन बाध्यकारी) और समग्र microenvironment या मैट्रिक्स। अंत में, तकनीक इसकी अर्द्ध मात्रात्मक प्रकृति में सीमित है: यह केवल यह आसानी से एक ऐसी सामग्री की कुल अंग बोझ निस्र्पक के रूप में कार्य करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है जिसका अर्थ समान संकल्प के अन्य दो आयामी माइक्रोस्कोपी तकनीक के रूप में के रूप में मात्रात्मक हो सकता है।

कुल मिलाकर, EDFM और एचएसआई ऐसे मंदिर, HAADF और डीआईसी के रूप में पारंपरिक nanomaterial इमेजिंग और तकनीकों के लक्षण वर्णन, पर कई लाभ प्रदान करते हैं। EDFM / एचएसआई अधिक गहन conven की तुलना में समय और लागत की बचत होती है, जो तेजी से छवि अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए अनुमति देता हैराष्ट्रीय तकनीक। इसके अतिरिक्त, EDFM / एचएसआई के लिए नमूना तैयार करने के लिए समय की बचत होती है और यह तो अन्य तकनीकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के बाद भी किसी नमूने के और अधिक लचीला विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, जो आम तौर पर कम से कम और गैर विनाशकारी दोनों है। इसके अलावा, एचएसआई कई रचनाओं का nanoscale सामग्री के विश्लेषण के लिए और matrices की एक किस्म में अनुमति देता है, बहुमुखी है। अनुसंधान दल प्रौद्योगिकी की विशिष्टता के बारे में गहराई से मूल्यांकन सहित अन्य सामग्री और नमूना प्रकार के लिए यहाँ वर्णित विधि को निखारने के लिए काम कर रहा है। अनुसंधान दल द्वारा जांच के तहत एक महत्वपूर्ण अगले कदम के पारंपरिक सोने मानकों के खिलाफ इन तकनीकों की मान्यता है (उदाहरण के लिए, रमन, मंदिर, SEM) सामग्री और ब्याज के प्रकार के ऊतकों के लिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
CytoViva 150 Unit (condenser) CytoViva (Auburn, AL) mounted to Olympus BX43 microscope
Olympus BX43 Microscope - Analyzer Slot - HSI with 10x and 40x air objectives and 100X oil immersion objective obtained through CytoViva (Auburn, AL) for use with CytoViva 150 Unit condenser
Dagexcel-M Digital Firewire Camera - Cooled; includes Exponent 7 software obtained through CytoViva (Auburn, AL) enhanced darkfield camera and software
CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software obtained through CytoViva (Auburn, AL) hyperspectral camera and software
cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides) Schott NEXTERION 1025087 reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging
cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22 mm x 22 mm x  1.45 mm) Schott NEXTERION custom reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging
type A microscopy immersion oil Fisher Scientific 12368B multiple suppliers
70% isopropanol in water multiple suppliers
ImageJ software National Institutes of Health (NIH) free open-source software online download
metal oxide nanoparticles supplied to the research team by industrial partners alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed.

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References

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बढ़ी Darkfield माइक्रोस्कोपी और हाइपरस्पेक्ट्रल मानचित्रण द्वारा ऊतकीय नमूने में धातु ऑक्साइड नैनोकणों की पहचान
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Roth, G. A., Sosa Peña, M. d. P., Neu-Baker, N. M., Tahiliani, S., Brenner, S. A. Identification of Metal Oxide Nanoparticles in Histological Samples by Enhanced Darkfield Microscopy and Hyperspectral Mapping. J. Vis. Exp. (106), e53317, doi:10.3791/53317 (2015).More

Roth, G. A., Sosa Peña, M. d. P., Neu-Baker, N. M., Tahiliani, S., Brenner, S. A. Identification of Metal Oxide Nanoparticles in Histological Samples by Enhanced Darkfield Microscopy and Hyperspectral Mapping. J. Vis. Exp. (106), e53317, doi:10.3791/53317 (2015).

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