Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.
Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.
Nanomaterials के तेजी से उद्योगों और अनुप्रयोगों की एक किस्म में इस्तेमाल कर रहे हैं, और अधिक तेजी से सस्ती है, और इस तरह के इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में पारंपरिक तौर तरीकों से भी सुविधाजनक हैं कि nanoscale इमेजिंग और लक्षण के तरीकों के लिए एक की जरूरत है। अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) माइक्रोस्कोपी 1 और इस तरह कुल आंतरिक प्रतिबिंब (TIR) या पास के रूप में क्षणभंगुर क्षेत्र-आधारित दृष्टिकोण, सहित कई ऑप्टिकल तकनीक नियोजित किया गया है कोशिकाओं, ऊतकों, और रहने वाले सिस्टम, साथ nanoparticle (एनपी) बातचीत कल्पना करने के लिए क्षेत्र स्कैनिंग ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी (NSOM) 2,3। हालांकि, इन सबसे गैर विशेषज्ञ प्रयोगशालाओं 4 की पहुंच से बाहर उच्च अंत विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण, कर रहे हैं। संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) सहित इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, यह भी कोशिकाओं 5,6,7,8 साथ एनपी बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। उच्च कोण कुंडलाकार darkfield (HAADF) स्कैनिंग संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी एनपीएस की बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैवायरस 9 के साथ। Confocal माइक्रोस्कोपी एनपी सेल बातचीत 10 अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया एक और लोकप्रिय तकनीक है।
हाल के वर्षों में, darkfield आधारित हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग (एचएसआई) तकनीक जैविक मेट्रिसेस 11 में एनपीएस के अध्ययन के लिए एक आशाजनक विश्लेषणात्मक उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है। एचएसआई सिस्टम एक hypercube या datacube 12 के रूप में जाना स्थानिक और वर्णक्रमीय डेटा की एक तीन आयामी प्रतिनिधित्व उत्पन्न करते हैं। वर्णक्रम भिन्नता के स्थानिक नक्शा सामग्री की पहचान के लिए प्रयोग किया जाता है। ज्ञात सामग्री की स्पेक्ट्रल प्रोफाइल उत्पन्न होता है और अज्ञात नमूनों की तुलना के लिए संदर्भ पुस्तकालयों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। एचएसआई सिस्टम के साथ प्रमुख लाभ में से एक है, जिससे जाना जाता है, इसी तरह की संरचना का एक और संदर्भ कण करने के लिए उन्हें जोड़ने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से या पूर्व vivo विवो में स्थान और अज्ञात एनपीएस के वितरण की स्थापना स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ इमेजिंग गठबंधन करने के लिए इसकी क्षमता है।
के कई फायदे हैंपारंपरिक इमेजिंग तकनीक पर एचएसआई सिस्टम का उपयोग: न्यूनतम नमूना तैयार करने की आवश्यकता है; नमूना तैयार प्रकृति में आम तौर पर गैर विनाशकारी है; छवि अधिग्रहण और विश्लेषण तेजी से होता है; तकनीक लागत प्रभावी 13 है; और मिश्रित रचना की और / या जटिल matrices में यौगिकों के स्थानिक वितरण और विश्लेषण और अधिक आसानी से 14 से पूरा किया है।
कीमती नमूने शामिल nanomaterials के अनुसंधान के लिए, सबसे महत्वपूर्ण कारणों में से एक संभावित बार-बार एक या एक से अधिक तरीकों से नमूनों की जांच करने के लिए अनुमति देता है जो एक गैर विनाशकारी इमेजिंग विधि, की उपलब्धता है। बार-बार या एकाधिक विश्लेषण के लिए एक एकल विधि से उपलब्ध नहीं होगा कि व्यापक डेटासेट को विकसित करने के लिए वांछित जा सकता है। इस संबंध के लिए, अपनी ऑप्टिकल गुणों का अध्ययन नमूना विश्लेषण करने के लिए सबसे सुरक्षित तरीका है। एक बढ़ाया darkfield माइक्रोस्कोप (EDFM) और एचएसआई प्रणाली का उपयोग करके नमूने के ऑप्टिकल प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए – अर्थात् Reflectance, लेकिन यह भी absorbance और संप्रेषण – सुविधा पहचान और लक्षण वर्णन 15 किया जा सकता है। संभावित लक्षण वर्णन समापन के सापेक्ष आकार और एक नमूना भीतर नैनोकणों या agglomerates और नैनोकणों के वितरण के आकार के एक आकलन में शामिल हैं।
इस पत्र में, हम एक वर्णक्रम कोण मैपर (एसएएम) के रूप में संदर्भित एक पिक्सेल स्पेक्ट्रल मैच एल्गोरिथ्म पर आधारित एक एचएसआई प्रणाली का उपयोग कर पोस्टमार्टम के ऊतकों में धातु ऑक्साइड नैनोकणों के लिए विशेष रूप मानचित्रण विधियों का वर्णन। यह पशु मॉडल इंजीनियर nanomaterials के लिए जोखिम के स्वास्थ्य निहितार्थ का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं जिसमें विवो nanotoxicology अनुसंधान, में वर्तमान और भविष्य के पूरक करने की क्षमता है, क्योंकि हम इस विशेष आवेदन चुना है। इस विधि के आवेदन भी ऊतक या पशु मॉडलों का इस्तेमाल करता है कि nanoscale दवा वितरण अनुसंधान सूचित कर सकता है। ओ भर में विशेष रूप से, nanoparticle अवशोषण, वितरण, चयापचय, और उत्सर्जन मेंrgans और ऊतकों इस प्रणाली के साथ जांच की जा सकती है। अनुप्रयोगों का एक व्यापक विविधता जैव चिकित्सा अनुसंधान 11 में उपयोग के लिए जांच की जा रही है।
इस विधि मौलिक रचनाओं 16-19 की एक किस्म के नैनोकणों को उजागर किया गया है कि (जैसे विभिन्न ऊतकों प्रकार, ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना नमूने, और रक्त स्मीयर के रूप में) अलग अलग जैविक नमूने के आकलन के लिए उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, इस विधि विवो में और nanoscale दवा वितरण के अध्ययन के लिए 11 के लिए प्रासंगिक है, जो इन विट्रो, में nanoparticle biodistribution अध्ययन के लिए उपयोगी है। जैविक नमूने के अलावा, EDFM और एचएसआई ऐसे अपशिष्ट के रूप में 20 नमूने पर्यावरण में नैनोकणों मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह nanoparticle प्रवेश को रोकने में व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के बाद से व्यावसायिक जोखिम आकलन, साथ ही इस तकनीक के उपयोग से मदद की जा सकती है। इसके अलावा, अनुसंधान तेAM वर्तमान में व्यावसायिक जोखिम आकलन से एकत्र नैनोकणों के फिल्टर मीडिया के नमूने के मूल्यांकन के लिए एक समान EDFM और एचएसआई प्रोटोकॉल विकसित कर रहा है। EDFM और एचएसआई के लिए इन विभिन्न प्रकार नमूना की तैयारी अलग-अलग हो सकता है, यह है कि वे आसानी से ऑप्टिकल प्रणाली द्वारा कल्पना की जा सकती है कि इस तरह से तैयार किया जाता है कि महत्वपूर्ण है। यह पारंपरिक brightfield माइक्रोस्कोपी के माध्यम से देखे जा होता है जैसे कि आमतौर पर, नमूना तैयार किया जाना चाहिए। 11 व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कई हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग प्रणालियों रहे हैं।
पारंपरिक ऊतकीय धुंधला, धातु ऑक्साइड नैनोकणों की पहचान और विश्लेषण आया है कि ऊतकों के नमूनों EDFM, एचएसआई मानचित्रण, और छवि विश्लेषण तकनीक का एक संयोजन के माध्यम से हासिल किया जा सकता है। , यह नमूने इष्टतम दृश्य के लिए 5-10 माइक्रोन की मोटाई को sectioned हैं कि महत्वपूर्ण है, ऊतक विज्ञान या immunohistochemistry के लिए नमूना तैयार करने में लचीलापन (दाग के प्रकार के उदाहरण के लिए, निश्चित या जमे हुए ऊतकों का उपयोग) जबकि वहाँ। यहां इस्तेमाल नमूने hematoxylin और eosin के साथ दाग और coverslipped, कांच खुर्दबीन स्लाइड पर मुहिम शुरू की, formalin-तय की और आयल एम्बेडेड पहले 6 माइक्रोन मोटाई के लिए एक रोटरी microtome साथ सेक्शनिंग के लिए गए थे। एक पूर्व vivo त्वचीय पैठ विष विज्ञान सहयोग से सुअर त्वचा के ऊतकों इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया। ऊतकों जलीय निलंबन में धातु ऑक्साइड नैनोकणों (एल्युमिना, सिलिका, Ceria) से अवगत कराया गया। हित के क्षेत्र (एस) की जांच (उच्च विपरीत Elemeएनटीएस) EDFM के साथ बाद में एचएसआई मानचित्रण और विश्लेषण की सुविधा है कि एक महत्वपूर्ण पहला कदम है। सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के नमूने imaged और संदर्भ के लिए एक वर्णक्रमीय पुस्तकालय बनाने के क्रम में पहले विश्लेषण किया जाना चाहिए। सकारात्मक नियंत्रण से एकत्र स्पेक्ट्रा एक सकारात्मक नियंत्रण के वर्णक्रम पुस्तकालय के लिए निर्यात कर रहे हैं। फिर, नकारात्मक नियंत्रण छवियों से सभी स्पेक्ट्रा विशिष्टता को सुधारने के लिए सकारात्मक नियंत्रण के वर्णक्रम पुस्तकालय से घटाया जाता है (झूठी सकारात्मक कम)। जिसके परिणामस्वरूप फ़िल्टर किया वर्णक्रमीय पुस्तकालय ब्याज की सामग्री के विश्लेषण के लिए कार्य करता है कि आरएसएल माना जाता है। सभी ऊतकों के नमूनों ही इमेजिंग प्रक्रिया से गुजरना और आरएसएल के खिलाफ मैप कर रहे हैं। परिणामस्वरूप छवि एक काले रंग की पृष्ठभूमि पर ब्याज के तत्वों के साथ ही क्षेत्रों में शामिल होंगे। इस छवि को तो ImageJ देखने के क्षेत्र प्रति मैप किया कणों के क्षेत्र प्राप्त करने के लिए अपनी सीमा और कण विश्लेषण कार्यों का उपयोग कर के साथ विश्लेषण किया जा सकता है। ImageJ से प्राप्त संख्यात्मक डेटा निर्यात किया जा सकता हैआगे के विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट के लिए एड।
यह जैविक नमूने एक दूसरे से स्वाभाविक अलग कर रहे हैं, और धुंधला तरीकों EDFM और एचएसआई के माध्यम से दृश्य को प्रभावित कर सकता है, प्रदर्शन सेटिंग्स नमूने के एक विशिष्ट प्रकार के लिए सबसे अच्छा उच्च विपरीत छवि का उत्पादन करने के लिए क्या अनुसार निर्धारित किया जाना चाहिए कि विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है। झूठी सकारात्मक की कमी वर्णक्रमीय पुस्तकालयों की छानने के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, हालांकि इस संक्रमण के लिए इसी स्पेक्ट्रा संभावित सकारात्मक नियंत्रण के वर्णक्रम पुस्तकालय से फ़िल्टर किया जा सकता है, यह ब्याज के तत्व के साथ संदूषण से परहेज किया है कि विश्वसनीय नकारात्मक नियंत्रण प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है , झूठी नकारात्मक दर बढ़ रही है। सपा का उत्पादन है कि संचित कणों की एक उच्च संख्या के साथ क्षेत्रों: इसके अलावा, हाइपरस्पेक्ट्रल इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ detectable है कि स्पेक्ट्रम तीव्रता रेंज विशेष सॉफ्टवेयर की सीमा को पार नहीं कर सकते हैं (इस अध्ययन के लिए, कि 16,000 यूनिट है)तीव्रता सीमा से ऊपर ectral तीव्रता के कारण झूठी नकारात्मक की संख्या में वृद्धि के जोखिम के लिए, वर्णक्रमीय पुस्तकालय के बाहर छोड़ दिया जाता है।
एचएसआई प्रणाली पारंपरिक तरीकों पर कई फायदे प्रदान करते हैं, पर विचार करने के लिए कुछ कमियां और सीमाएं हैं। एक है पर्याप्त कंप्यूटिंग शक्ति की आवश्यकता हो सकती एकत्र ऑप्टिकल डेटा की एक बड़ी राशि है। एक अन्य संदर्भ वर्णक्रमीय पुस्तकालयों बनाया जा रहा है जब एचएसआई विशेष रूप से शुरुआत चरणों में, समय लेने वाला हो सकता है। इसके अलावा, इमेजिंग समय सरल darkfield इमेजिंग की तुलना में यह धीमी है, जिससे छवि पर कब्जा प्रति कई मिनट की आवश्यकता हो सकती है; हालांकि, यह अभी भी इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा नमूना तैयार करने और दृश्य प्रदर्शन करने से भी तेज है। इसके अतिरिक्त, जटिल प्रणालियों अति विशिष्ट नियंत्रण के विकास की आवश्यकता होती है और 26 मुश्किल मानकीकृत, सार्वभौमिक संदर्भ पुस्तकालयों की स्थापना करना है, जो कई विशेषता स्पेक्ट्रा, में हो सकता है। अंत में, तकनीकअलग-अलग परमाणुओं को हल कर सकते हैं, जो इस तरह के परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी या संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के रूप में probe- या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी तकनीक, की तुलना में कम संकल्प में nique का परिणाम है। इस तकनीक के संकल्प की वजह से नैनोमीटर स्तर पर या ठीक एक उप माइक्रोन स्तर पर सामग्री का पता लगाने के लिए कण आकार को मापने के लिए एक उच्च परिशुद्धता उपकरण होने से रोकता है, जो अपने फोटोनिक प्रकृति, तक सीमित है। तकनीक निश्चित ऊतक डिब्बों या सेलुलर अंगों के भीतर कणों पहचानने में सक्षम हो सकता है (जैसे सेल नाभिक के रूप में) से अधिक 1 माइक्रोन, छोटे अंगों या सुविधाओं को इस विधि के साथ सही ढंग से कल्पना करने के लिए चुनौती दे रहे हैं। इसके अलावा अपनी स्थानिक संकल्प दिया ध्यान दें, की, इस विधि एकल नैनोकणों और agglomerates 11 के बीच अंतर नहीं कर सकते हैं।
अन्य कारणों में शामिल हैं: (जैसे महान धातु के रूप में) कुछ सामग्री उन्हें आसानी से ANALY करने के लिए कर सकता है, जो बहुत अधिक परावर्तन और विशिष्ट वर्णक्रम प्रोफाइल हैज़ी और इस उपकरण के साथ प्रेतसंबंधी नक्शा। ऐसे अर्द्ध धातु इस अध्ययन में जांच की आक्साइड और कार्बन आधारित nanomaterials के 24, 27, के रूप में दूसरों की वजह से उनके मौलिक रचना, आकार के लिए अधिक चुनौतीपूर्ण हो सकता है, और मैट्रिक्स के आधार पर हो सकता है। द्वारा मर्सर एट अल। दो murine साँस लेना अध्ययन में, इस अध्ययन में कार्यरत एक के लिए एक समान प्रणाली फेफड़ों में और आसपास के ऊतकों के साथ उनकी उल्लेखनीय उच्च विपरीत के आधार पर माध्यमिक अंगों में कार्बन नैनोट्यूब का पता लगाने के क्रम में इस्तेमाल किया गया था। कार्बन फाइबर की अद्वितीय आकार की पहचान के लिए एक पर्याप्त विशेषता थी क्योंकि हालांकि, हाइपरस्पेक्ट्रल मानचित्रण, या तो अध्ययन में संभावना का प्रदर्शन नहीं किया गया था। सामान्य biophysical प्रक्रियाओं के माध्यम से विशिष्ट अंगों के लिए ब्याज की नैनोकणों जमा (और अक्सर खुद को अध्ययन का विषय) अप्रत्याशित है, के बाद से एक भी लागू सकारात्मक नियंत्रण के निर्धारण के लिए मुश्किल हो सकता है और नियंत्रण मीटर की कैसे पीढ़ी के विचार की आवश्यकता: एक और विचार ऊतकों को विशेष रूप से संबंधितब्याज की एक माल की स्थिति को प्रभावित ight। एक वर्णक्रमीय पुस्तकालय ब्याज की प्राचीन नैनोकणों से बनाया जाता है, तो उदाहरण के लिए, यह कारण में परिवर्तन के कारण जैसे कण (के परिवर्तन से उत्पन्न स्पेक्ट्रा में परिवर्तन, ऊतकों या कोशिकाओं में वे एक ही नैनोकणों के लिए पुस्तकालय नक्शा करने के लिए मुश्किल हो सकता है पीएच, विघटन, ढेर, प्रोटीन बाध्यकारी) और समग्र microenvironment या मैट्रिक्स। अंत में, तकनीक इसकी अर्द्ध मात्रात्मक प्रकृति में सीमित है: यह केवल यह आसानी से एक ऐसी सामग्री की कुल अंग बोझ निस्र्पक के रूप में कार्य करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है जिसका अर्थ समान संकल्प के अन्य दो आयामी माइक्रोस्कोपी तकनीक के रूप में के रूप में मात्रात्मक हो सकता है।
कुल मिलाकर, EDFM और एचएसआई ऐसे मंदिर, HAADF और डीआईसी के रूप में पारंपरिक nanomaterial इमेजिंग और तकनीकों के लक्षण वर्णन, पर कई लाभ प्रदान करते हैं। EDFM / एचएसआई अधिक गहन conven की तुलना में समय और लागत की बचत होती है, जो तेजी से छवि अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए अनुमति देता हैराष्ट्रीय तकनीक। इसके अतिरिक्त, EDFM / एचएसआई के लिए नमूना तैयार करने के लिए समय की बचत होती है और यह तो अन्य तकनीकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के बाद भी किसी नमूने के और अधिक लचीला विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, जो आम तौर पर कम से कम और गैर विनाशकारी दोनों है। इसके अलावा, एचएसआई कई रचनाओं का nanoscale सामग्री के विश्लेषण के लिए और matrices की एक किस्म में अनुमति देता है, बहुमुखी है। अनुसंधान दल प्रौद्योगिकी की विशिष्टता के बारे में गहराई से मूल्यांकन सहित अन्य सामग्री और नमूना प्रकार के लिए यहाँ वर्णित विधि को निखारने के लिए काम कर रहा है। अनुसंधान दल द्वारा जांच के तहत एक महत्वपूर्ण अगले कदम के पारंपरिक सोने मानकों के खिलाफ इन तकनीकों की मान्यता है (उदाहरण के लिए, रमन, मंदिर, SEM) सामग्री और ब्याज के प्रकार के ऊतकों के लिए।
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Günter Oberdörster, DVM, PhD and Alison Elder, PhD (University of Rochester) and Mary Frame, PhD (Stony Brook University) for animal research collaborations resulting in tissue samples for analysis. Additionally, the authors thank: Christina Rotondi (Albany Medical College Histology Core); Rani Sellers, DVM, PhD and Barbara Cannella, PhD (Albert Einstein College of Medicine Histology and Comparative Pathology Facility); Leonardo Bezerra and Ahlam Abuawad (Brenner research team members); and Leslie Krauss, Byron Cheatham and Elyse Johnson (CytoViva). This work was supported in part by CDC-NIOSH grant OH-009990-01A1 and the NanoHealth and Safety Center, New York State, awarded to S.B.
CytoViva 150 Unit (condenser) | CytoViva (Auburn, AL) | mounted to Olympus BX43 microscope | |
Olympus BX43 Microscope – Analyzer Slot – HSI with 10x and 40x air objectives and 100x oil immersion objective | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | for use with CytoViva 150 Unit condenser | |
Dagexcel-M Digital Firewire Camera – Cooled; includes Exponent 7 software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | enhanced darkfield camera and software | |
CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | hyperspectral camera and software | |
cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides) | Schott NEXTERION | 1025087 | reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging |
cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22mm x 22mm x 1.45mm) | Schott NEXTERION | custom | reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging |
type A microscopy immersion oil | Fisher Scientific | 12368B | multiple suppliers |
70% isopropanol in water | multiple suppliers | ||
ImageJ software | National Institutes of Health (NIH) | free open-source software online download | |
metal oxide nanoparticles | supplied to the research team by industrial partners | alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed. |