Enhanced darkfield microscopy and hyperspectral imaging with spectral mapping enable screening, localization, and identification of nanoscale materials in histological samples with improved speed and accuracy over traditional methods. The goal of this paper is to provide methods for darkfield imaging and hyperspectral mapping of metal oxide nanoparticles in histological samples.
Nanomaterials are increasingly prevalent throughout industry, manufacturing, and biomedical research. The need for tools and techniques that aid in the identification, localization, and characterization of nanoscale materials in biological samples is on the rise. Currently available methods, such as electron microscopy, tend to be resource-intensive, making their use prohibitive for much of the research community. Enhanced darkfield microscopy complemented with a hyperspectral imaging system may provide a solution to this bottleneck by enabling rapid and less expensive characterization of nanoparticles in histological samples. This method allows for high-contrast nanoscale imaging as well as nanomaterial identification. For this technique, histological tissue samples are prepared as they would be for light-based microscopy. First, positive control samples are analyzed to generate the reference spectra that will enable the detection of a material of interest in the sample. Negative controls without the material of interest are also analyzed in order to improve specificity (reduce false positives). Samples can then be imaged and analyzed using methods and software for hyperspectral microscopy or matched against these reference spectra in order to provide maps of the location of materials of interest in a sample. The technique is particularly well-suited for materials with highly unique reflectance spectra, such as noble metals, but is also applicable to other materials, such as semi-metallic oxides. This technique provides information that is difficult to acquire from histological samples without the use of electron microscopy techniques, which may provide higher sensitivity and resolution, but are vastly more resource-intensive and time-consuming than light microscopy.
Eftersom nanomaterial används alltmer i en mängd olika branscher och applikationer, det finns ett behov av nanoskala imaging och karakteriseringsmetoder som är snabbare, billigare, och bekvämare än traditionella metoder, såsom elektronmikroskopi. Att visualisera nanopartiklar (NP) interaktioner med celler, vävnader och levande system, många optiska tekniker har använts, inklusive differential interferens kontrast (DIC) mikroskopi 1 och försvinnande fältbaserade metoder, såsom total inre reflektion (TIR) eller nära- fält scanning optisk mikroskopi (NSOM) 2,3. Men dessa är high-end analytiska metoder, utom räckhåll för de flesta icke-specialiserade laboratorier 4. Elektronmikroskopi, inklusive transmissionselektronmikroskop (TEM), har också använts för att studera NP interaktion med celler 5,6,7,8. Hög vinkel ringformig mörkfält (HAADF) svep transmissionselektronmikroskopi har använts för att studera interaktionen av NPSmed virus 9. Konfokalmikroskopi är en annan populär teknik som används för att studera NP-cell-interaktioner 10.
Under de senaste åren, har mörkfältsbaserade hyperspektral avbildning (HSI) tekniker använts som ett lovande analytiskt verktyg för att studera NP i biologiska matriser 11. HSI system genererar en tredimensionell representation av rumsliga och spektraldata, känd som en hyperkub eller datacube 12. Den rumsliga karta över spektral variation används för materialidentifiering. Kan genereras spektrala profiler för kända material och används som referensbibliotek för jämförelse med okända prover. En av de stora fördelarna med HSI-system är dess förmåga att kombinera avbildning med spektroskopi, varigenom läget och distribution av okända NP in vivo eller ex vivo samt koppla dem till en annan referens partikel av kända, liknande sammansättning.
Det finns flera fördelar medanvänder HSI-system jämfört med konventionella avbildningstekniker: minimal provberedning krävs, provberedning är typiskt icke-förstörande i naturen; bild förvärv och analys är snabbare, tekniken är kostnadseffektiv 13; och den geografiska fördelningen och analys av föreningar med blandad sammansättning och / eller i komplexa matriser lättare uppnås 14.
För nanomaterial forskning som innefattar värdefulla prover, en av de viktigaste faktorerna är att det finns en icke-förstörande avbildningsmetod, som gör det möjligt för den potentiella upprepade gånger undersöka prover från en eller flera metoder. Upprepad eller flera analyser kan vara önskvärt att utveckla omfattande datamängder som inte skulle vara tillgängliga från en enda metod. I detta avseende, studera dess optiska egenskaper är det säkraste sättet att analysera provet. Genom att använda en förbättrad mörkfält mikroskop (EDFM) och HSI system för att studera det optiska svaret hos provet – nämligen Reflectance, men också Absorbans och transmittans – funktion identifiering och karakterisering kan utföras 15. Potentiella karakterisering endpoints innehålla en bedömning av relativ storlek och form av nanopartiklar eller agglomerat och distribution av nanopartiklar inom ett prov.
I detta dokument beskriver vi kartläggningsmetoder speciellt för metalloxid nanopartiklar i obduktionsvävnad med hjälp av en HSI system baserat på en pixel-spektral match algoritm kallas en spektral vinkel mapper (SAM). Vi valde detta särskilt ansökan eftersom den har potential att komplettera nuvarande och framtida in vivo nanotoxikologi forskning, där djurmodeller används för att utvärdera konsekvenserna för hälsan av exponering för konstruerade nanomaterial. Tillämpning av denna metod kan också informera nanoskala läkemedelsavgivning forskning som utnyttjar vävnads- eller djurmodeller. I synnerhet nanopartikel absorption, distribution, metabolism och utsöndring under hela organs och vävnader kunde undersökas med detta system. Ett stort antal olika tillämpningar undersöks för användning inom biomedicinsk forskning 11.
Denna metod skulle kunna användas för bedömning av olika biologiska prover (såsom olika vävnader typer, bronkoalveolär sköljprover och blodutstryk) som har exponerats för nanopartiklar av en mängd olika elementära kompositioner 16-19. Dessutom är denna metod användbar för att studera nanopartikel biofördelning in vivo och in vitro, vilket är relevant för nanoskala läkemedelsadministreringsstudier 11. Bortom biologiska prover, kan EDFM och HSI användas för att utvärdera nanopartiklar i miljöprover, till exempel avloppsvatten 20. Yrkes- exponeringsbedömning kan underlättas genom användning av denna teknik också, eftersom det kan användas för att utvärdera effekten av personlig skyddsutrustning för att förhindra nanopartiklar penetration. Vidare forskning team utvecklar för närvarande ett liknande EDFM och HSI protokoll för utvärdering av filtermedia prover av nanopartiklar som samlats in från bedömningar hygieniska. Även om framställningen av dessa olika provtyper för EDFM och HSI kan variera, är det viktigt att de är beredda på ett sådant sätt att de lätt kan visualiseras genom det optiska systemet. Normalt bör provet framställas som om det skulle visualiseras via traditionell bright mikroskopi. Det finns flera hyperspektral bildsystem kommersiellt tillgängliga 11.
För vävnadsprover som har genomgått konventionell histologisk färgning, identifiering och analys av metalloxid nanopartiklar kan uppnås genom en kombination av EDFM, HSI kartläggning och bildanalysteknik. Medan det finns flexibilitet i provberedning för histologi eller immunohistokemi (t.ex., med användning av fasta eller frysta vävnader; typ av fläck), är det viktigt att proven sektione till en tjocklek av 5-10 | im för optimal visualisering. Prov som användes här var formalinfixerade och paraffininbäddade före snitt med en roterande mikrotom till 6 ^ m tjocklek, monterade på glasmikroskopobjektglas, färgades med hematoxylin och eosin och med täckglas. Grishud vävnader från en ex vivo kutana penetrationen toxikologi samarbete användes för denna studie. Vävnaderna exponerades för metalloxidnanopartiklar (aluminiumoxid, kiseldioxid, ceriumdioxid) i vattenhaltiga suspensioner. Detektering av regionen (er) av intresse (hög kontrast elemenätter) med EDFM är ett kritiskt första steg som underlättar efterföljande HSI kartläggning och analys. Positiva och negativa kontrollprover måste avbildas och analyseras först för att skapa en spektral bibliotek för referens. Den uppsamlade spektra från den positiva kontrollen exporteras till en positiv kontroll spektral bibliotek. Därefter är alla spektra från de negativa kontroll bilder subtraheras från den positiva kontrollen spektrala bibliotek i syfte att förbättra specificiteten (minska falska positiva). Den resulterande filtrerade spektral bibliotek anses RSL som tjänar för analys av material av intresse. Alla vävnadsprover genomgå samma avbildningsprocessen och mappas mot RSL. Den resulterande bilden kommer att innehålla endast områden med inslag av intresse över en svart bakgrund. Den här bilden kan sedan analyseras med ImageJ med hjälp av dess tröskel- och partikelanalysfunktioner för att få området mappade partiklar per synfält. Numeriska data som erhållits från ImageJ kan vara exported till ett kalkylblad för vidare analys.
Det är viktigt att tänka på att så biologiska prover är till sin natur skiljer sig från varandra, och färgningsmetoder kan påverka visualisering genom EDFM och HSI bör exponeringsinställningarna fastställas i enlighet med vad som ger den bästa bild med hög kontrast för en viss typ av prov. Även om minskning av falska positiva kan uppnås genom filtrering av spektrala bibliotek, är det viktigt att få fram tillförlitliga negativa kontroller som har undvikit kontaminering med inslag av intresse, eftersom spektra som motsvarar denna förorening skulle kunna filtreras från den positiva kontrollen spektrala bibliotek ökar falskt negativa resultat. Även spektrumet intensitetsområde som kan detekteras med den hyper bildprogram kan inte överträffa gränsen för det särskilda program (för denna studie är att 16.000 enheter): områden med ett stort antal av ackumulerade partiklar som producerar spectral intensiteter över intensitetsgränsen lämnas ut från den spektrala bibliotek, på grund av risken för att öka antalet falskt negativa.
Medan HSI-systemet ger många fördelar jämfört med traditionella metoder, finns det vissa nackdelar och begränsningar att överväga. En är att den stora mängden av optiska data som samlas in kan kräva betydande datorkraft. En annan är att HSI kan vara tidskrävande, särskilt i början stadier när referensspektrala bibliotek skapas. Dessutom kan imaging tid kräva flera minuter per bildfångst, vilket gör det långsammare än enkel mörkfält bildbehandling; emellertid är det fortfarande snabbare än att utföra framställning och visualisering sampling genom elektronmikroskopi. Dessutom kan komplexa system resultera i flera karakteristiska spektra, som kräver utveckling av högt specialiserade kontroller och göra inrättandet av standardiserade, universella referensbibliotek svåra 26. Slutligen, technique resulterar i lägre upplösning än probe- eller elektronmikroskopiska tekniker, såsom atomkraftsmikroskopi eller transmissionselektronmikroskopi, vilket kan lösa enskilda atomer. Denna teknik resolution är begränsad på grund av sin fotoniska natur, som hindrar den från att vara en hög precision verktyg för att mäta partikelstorlekar på nanometernivå eller exakt lokalisera material i en sub-micron nivå. Medan tekniken kan ha möjlighet att peka ut partiklar inom vissa teoretiska vävnader eller cellulära organeller som är större än 1 | im (såsom cellkärnor), är mindre organeller eller funktioner utmanande att visualisera exakt med denna metod. Lägg också märke till, med tanke på dess rymdupplösning, kan denna metod inte särskilja mellan enskilda nanopartiklar och agglomerat 11.
Andra överväganden inkluderar: vissa material (t.ex. ädelmetaller) har mycket högre reflektans och tydliga spektrala profiler, vilket kan göra dem lättare att Analyze och karta spektralt med detta verktyg. Andra, såsom halvmetalloxider som undersökts i denna studie och kolbaserade nanomaterial 24, 27, kan vara svårare på grund av deras elementära sammansättning, form, och beroende på matrisen. I två murina inhalationsstudier av Mercer et al., Har ett liknande system till ett som användes i denna studie används för att lokalisera kolnanorör i lungan och i sekundära organ kring deras anmärkningsvärt hög kontrast med omgivande vävnader. Emellertid var hyperspektral kartläggning inte visat i någon av studierna, sannolikt eftersom den unika formen av kolfibrer var en tillräcklig drag för identifiering. En annan faktor gäller specifikt till vävnader: sedan deponera nanopartiklar av intresse för specifika organ genom normala biofysiska processer är oförutsägbar (och ofta själv föremål för studien), kan fastställandet av en tillämplig positiv kontroll vara svårt och kräver en undersökning av hur generering av styr might påverka tillståndet hos ett material av intresse. Till exempel, om en spektral bibliotek skapas från orörda nanopartiklar av intresse, kan det vara svårt att kartlägga bibliotek till samma nanopartiklar i vävnader eller celler på grund av förändringar i de spektra som framställs förändring av partikeln (t.ex., på grund av förändringar i pH, upplösning, agglomerering, proteinbindning) och den totala mikro eller matris. Slutligen är tekniken begränsad i sin semi-kvantitativ natur: det kan bara vara så kvantitativ som andra tvådimensionell mikroskopitekniker av liknande resolution, vilket betyder att det kan inte vara lätt att användas för att utföra uppgifter som kännetecknar den totala organbördan av ett material.
Sammantaget EDFM och HSI ger flera fördelar jämfört med konventionella nanomaterial avbildnings och karakteriseringstekniker, såsom TEM, HAADF och DIC. EDFM / HSI möjliggör snabbare bildtagning och analys, vilket sparar tid och kostnader i jämförelse med mer intensiv konventionnella tekniker. Dessutom är provberedning för EDFM / HSI typiskt både minimal och icke-förstörande, vilket sparar tid och även möjliggör en mer flexibel analys av ett givet prov eftersom det då kan användas för andra tekniker. Vidare är HSI mångsidig, vilket möjliggör analys av nanoskala material av många kompositioner och i en mängd olika matriser. Forskargruppen arbetar med att förfina den här beskrivna metoden för andra material och provtyper, inklusive en fördjupad utvärdering av specificiteten av tekniken. En kritisk nästa steg under utredning av forskargruppen är validering av dessa tekniker mot traditionella guld standarder (t ex, Raman, TEM, SEM) för material och vävnadstyper av intresse.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Günter Oberdörster, DVM, PhD and Alison Elder, PhD (University of Rochester) and Mary Frame, PhD (Stony Brook University) for animal research collaborations resulting in tissue samples for analysis. Additionally, the authors thank: Christina Rotondi (Albany Medical College Histology Core); Rani Sellers, DVM, PhD and Barbara Cannella, PhD (Albert Einstein College of Medicine Histology and Comparative Pathology Facility); Leonardo Bezerra and Ahlam Abuawad (Brenner research team members); and Leslie Krauss, Byron Cheatham and Elyse Johnson (CytoViva). This work was supported in part by CDC-NIOSH grant OH-009990-01A1 and the NanoHealth and Safety Center, New York State, awarded to S.B.
CytoViva 150 Unit (condenser) | CytoViva (Auburn, AL) | mounted to Olympus BX43 microscope | |
Olympus BX43 Microscope – Analyzer Slot – HSI with 10x and 40x air objectives and 100x oil immersion objective | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | for use with CytoViva 150 Unit condenser | |
Dagexcel-M Digital Firewire Camera – Cooled; includes Exponent 7 software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | enhanced darkfield camera and software | |
CytoViva Hyperspectral Imaging System 1.4; includes Pixelfly hyperspectral camera, XY stage controller, ENVI hyperspectral imaging software | obtained through CytoViva (Auburn, AL) | hyperspectral camera and software | |
cleanroom cleaned glass microscope slides (glass B slides) | Schott NEXTERION | 1025087 | reduced debris and artifacts compared to conventional glass microscope slides for optimal imaging |
cleanroom cleaned glass microscope coverslips (#1.0; 22mm x 22mm x 1.45mm) | Schott NEXTERION | custom | reduced debris and artifacts compared to conventional glass coverslips for optimal imaging |
type A microscopy immersion oil | Fisher Scientific | 12368B | multiple suppliers |
70% isopropanol in water | multiple suppliers | ||
ImageJ software | National Institutes of Health (NIH) | free open-source software online download | |
metal oxide nanoparticles | supplied to the research team by industrial partners | alumina, silica, and ceria nanoparticles in aqueous suspensions. Due to a Non-Disclosure Agreement between the authors and industry partners, further product information cannot be disclosed. |