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Neuroscience

तीन आयामी इमेजिंग और मानव Intraepidermal तंत्रिका तंतुओं के भीतर Mitochondria का विश्लेषण

Published: September 29, 2017
doi:
10.3791/53369
, , ,
1University of Michigan Medical School, 2Department of Neurology,University of Michigan, 3Department of Internal Medicine,University of Michigan

Summary

यह प्रोटोकॉल त्रि-आयामी (3d) इमेजिंग और विश्लेषण तकनीकों का उपयोग करता है जो कि तंत्रिका-विशिष्ट mitochondria को विज़ुअलाइज़ और बढ़ाता है । तकनीक अन्य स्थितियों जहां एक फ्लोरोसेंट संकेत एक और फ्लोरोसेंट संकेत से डेटा का एक सबसेट को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है के लिए लागू कर रहे हैं ।

Abstract

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य intraepidermal तंत्रिका तंतुओं के भीतर mitochondria अध्ययन करने के लिए है । इसलिए, 3d इमेजिंग और विश्लेषण तकनीकों तंत्रिका-विशिष्ट mitochondria को अलग करने और संवेदी नसों के बाहर की नोक में mitochondria के रोग प्रेरित परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए विकसित किया गया था । प्रोटोकॉल प्रतिदीप्ति immunohistochemistry, फोकल माइक्रोस्कोपी और 3 डी छवि विश्लेषण तकनीक को जोड़ती है और कल्पना को तंत्रिका-विशिष्ट mitochondria यों तो । विस्तृत मापदंडों प्रक्रियाओं भर में परिभाषित कर रहे हैं क्रम में कैसे इन तकनीकों का उपयोग करने के लिए तंत्रिका-विशिष्ट mitochondria को अलग करने का एक ठोस उदाहरण प्रदान करने के लिए. एंटीबॉडी को लेबल तंत्रिका और त्वचा पंच बायोप्सी, जो अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस के बाद किया गया था के ऊतक वर्गों के भीतर mitochondrial संकेतों को क्रमशः एक हरे और लाल फ्लोरोसेंट संकेत के साथ नसों और mitochondria कल्पना किया गया । Z-श्रृंखला छवियों को फोकल माइक्रोस्कोपी और 3 डी विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ अधिग्रहीत किया गया था प्रक्रिया और संकेतों का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल । यह आवश्यक नहीं है सटीक मापदंडों का पालन करने के भीतर वर्णित है, लेकिन यह धुंधला, अधिग्रहण और विश्लेषण कदम भर में चुना लोगों के साथ संगत होना जरूरी है । इस प्रोटोकॉल की ताकत यह है कि यह परिस्थितियों की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू है, जहां एक फ्लोरोसेंट संकेत अंय संकेतों है कि अंयथा अकेले अध्ययन असंभव होगा अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है ।

Introduction

Mitochondria महत्वपूर्ण सेलुलर कार्य करता है कि सेल ऊर्जा का उत्पादन शामिल है, कैल्शियम बफर, और गल और अपोप्तोटिक कोशिका मृत्यु1,2,3विनियमन । तंत्रिका तंत्र शरीर की तुलना में एक उच्च चयापचय दर है4 सुझाव है कि न्यूरॉन्स mitochondrial श्वसन के माध्यम से adenosine ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) के रूप में सेलुलर ऊर्जा के एक उच्च डिग्री उत्पन्न. सबूत के दस्तावेजों का एक बहुत है कि ंयूरॉंस कार्य5, विशेष रूप से synapses6पर पर निर्भर हैं । इसलिए, न्यूरॉन्स के भीतर mitochondria का वितरण महत्वपूर्ण है.

पिछले 10 वर्षों में बहुत सी जानकारियों से पता चला है कि न्यूरॉन mitochondria की तस्करी और डॉकिंग अत्यधिक विनियमित है । मोटर प्रोटीन ंयूरॉन भर में विशिष्ट सेलुलर डिब्बों को mitochondria वितरण में शामिल हैं । mitochondria के नलए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है क्योंकि न्यूरॉन्स परियोजना axons और dendrites सोमा से दूर है । Kinesin मोटर प्रोटीन मुख्यतः प्रत्यक्ष anterograde (सोमा से दूर) के नलए mitochondria के साथ microtubules जबकि dynein मोटर प्रोटीन प्रत्यक्ष प्रतिगामी (सोमा की ओर) गतिशीलता7,8,9 , 10. वहां सेलुलर संकेत कर रहे है ऐसी mitochondrial झिल्ली क्षमता और आवेग आचरण कि उपस्थिति और mitochondrial के नलए11,12,13की दिशा को प्रभावित करते हैं ।

mitochondria परिवहन के अलावा, वहां विशेष प्रोटीन Ranvier और synapses8,14के नोड्स के रूप में उच्च ऊर्जा मांग है कि विशिष्ट सेलुलर डिब्बों के लिए mitochondria स्थानीयकृत कर रहे हैं, 17. वास्तव में, axons के भीतर mitochondria के बहुमत गैर-gram9,13,18हैं । syntaphilin लंगर mitochondria की तरह विशेष प्रोटीन axons साथ microtubules के लिए जबकि अंय प्रोटीन लंगर mitochondria actin के लिए cytoskeleton19–21। विकास कारकों और कैल्शियम जैसे आयनों mitochondria आंदोलन की समाप्ति का समर्थन करने के लिए उन्हें क्षेत्रों जहां वे21,22,23की जरूरत है स्थानीयकृत करने के लिए सूचित किया गया है ।

एक साथ ले लिया, तस्करी और mitochondria के डॉकिंग ंयूरॉंस के समुचित कार्य के लिए महत्वपूर्ण हैं । इस के समर्थन में, mitochondrial तस्करी में व्यवधान अल्जाइमर रोग, पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस, Charcot-Marie-टूथ रोग, हटिंगटन रोग, वंशानुगत स्पास्टिक सहित कई स्नायविक स्थितियों के साथ जुड़ा हुआ है paraparesis, और ऑप्टिक शोष15,24,25,26,27। हाल के अध्ययनों से मधुमेही न्यूरोपैथी के लिए एक संभावित तंत्र के रूप में mitochondrial शिथिलता और विकृति पर ध्यान केंद्रित किया है, संवेदी हानि मधुमेह के साथ जुड़े28,29,30,31 ,३२,३३. परिकल्पना यह है कि मधुमेह चमड़े के नीचे तंत्रिका के संवेदी अनुमानों के भीतर mitochondria के वितरण में परिवर्तन समाप्त । इसलिए, एक तकनीक कल्पना और intraepidermal तंत्रिका तंतुओं (IENFs), पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रंथि संवेदी afferents के बाहर युक्तियों के भीतर mitochondria यों तो विकसित किया गया था । तकनीक विशेष mitochondrial और फोकल माइक्रोस्कोपी जेड के साथ तंत्रिका फाइबर लेबल के प्रतिदीप्ति immunohistochemistry को जोड़ती है-शक्तिशाली 3 डी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ संकेतों की श्रृंखला अधिग्रहण तंत्रिका-विशिष्ट के वितरण को मापने के लिए इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए मानव चर्म पंच बायोप्सी से mitochondria ।

Protocol

त्वचा पंच बायोप्सी विषयों है कि एक बड़े समुदाय से भर्ती किया गया था से प्राप्त किया गया प्राथमिक देखभाल नेटवर्क आधारित यूटा के विश्वविद्यालय में मधुमेह केंद्र (साल्ट लेक सिटी, केंद्र शासित प्रदेशों…

Representative Results

मानव IENFs के भीतर mitochondria का विज़ुअलाइज़ेशन और ठहराव प्रतिदीप्ति immunohistochemistry मानव त्वचा बायोप्सी के भीतर कई संकेतों के एक साथ लेबलिंग के लिए नसों, mitochondria, और नाभिक कल्पना…

Discussion

इस प्रोटोकॉल को अलग करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, मात्रा और मानव त्वचा बायोप्सी से 3 डी में IENFs के भीतर तंत्रिका-विशिष्ट mitochondria के आकार और वितरण का विश्लेषण । प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरण हैं । मुक्त-फ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

यह काम राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान K08 NS061039-01A2, न्यूरोलॉजी अनुसंधान के लिए कार्यक्रम & #38; डिस्कवरी, और मिशिगन विश्वविद्यालय में अल्फ्रेड Taubman चिकित्सा अनुसंधान संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था । इस काम में मिशिगन मधुमेह अनुसंधान केंद्र के आकृति विज्ञान और छवि विश्लेषण कोर का इस्तेमाल किया, मधुमेह और पाचन और गुर्दे की बीमारियों के राष्ट्रीय संस्थान से स्वास्थ्य अनुदान 5P90 DK-२०५७२ के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा वित्त पोषित. लेखक जे रॉबिंसन सिंगलटन और ए गॉर्डन स्मिथ (यूटा के विश्वविद्यालय) का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा मानव त्वचा के नमूनों की उनकी उदार दान के लिए ।

Materials

2% Zamboni's Fixative Newcomer Supply, Middleton, WI  1459A 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP399-4 To make up 1X PBS
Image-iT FX Signal Enhancer ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts I36933 enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) Proteintech Group Inc. Rosemont, IL 14730-1-AP abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) abcam, Cambridge, MA ab110333 abbreviated as PDH
Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11034 red-fluorescent conjugated secondaryantibody
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11032 green-fluorescent conjugated secondaryantibody
Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A7906-100 abbreviated as BSA
Triton X- 100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T9284 abbreviated as TX-100
0.22 µm Filter EMD Millipore, Billerica
MA		 MILLEX GP SLGP 033NS 0.22 µm Millipore filter
Parafilm M Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 13-374-10 Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Non-calibrated Loop Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-032092 inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)
96-well Assay Plate Corning Incorporated, Corning, NY 3603 96-well flat bottom plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts P-36931 DAPI staining of nuclei
Microscope Cover Glass 50 x 24 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-544E Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-550-15 Microscope Slides
Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL SP5 Confocal Microscope
Volocity x64 Software  Perkin Elmer, Waltham , MA version 4.4.0 Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing
Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software Bitplane, Concord, MA version 7.7.1 Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis
Excel Microsoft, Redmond, WA version Office 2013 Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features
Optimum Cutting Temperature Compound Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA 4583 abbreviated as OCT
Leica Cryostat Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL CM1850 Cryostat for cutting 50 µm sections
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts C10600 Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal
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References

  1. Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
  2. Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
  3. Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X. Mitochondrial dynamics and mitochondrial quality control. Redox Biol. 4 (C), 6-13 (2015).
  4. Mink, J. W., Blumenschine, R. J., Adams, D. B. Ratio of central nervous system to body metabolism in vertebrates: its constancy and functional basis. Am J Physiol. 241 (3), R203-R212 (1981).
  5. Ames, A. CNS energy metabolism as related to function. Brain Res Brain Res Rev. 34 (1-2), 42-68 (2000).
  6. Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75 (5), 762-777 (2012).
  7. Hollenbeck, P. J. The pattern and mechanism of mitochondrial transport in axons. Front Biosci. 1, d91-d102 (1996).
  8. Cai, Q., Sheng, Z. H. Mitochondrial transport and docking in axons. Exp Neurol. 218 (2), 257-267 (2009).
  9. Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (6), (2013).
  10. Saxton, W. M., Hollenbeck, P. J. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 125 (Pt 9), 2095-2104 (2012).
  11. Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biol. 11 (12), e1001754 (2013).
  12. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of ranvier. J Neurosci. 31 (20), 7249-7258 (2011).
  13. Miller, K. E., Sheetz, M. P. Axonal mitochondrial transport and potential are correlated. J Cell Sci. 117, 2791-2804 (2004).
  14. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61 (4), 541-555 (2009).
  15. Sheng, Z. H., Cai, Q. Mitochondrial transport in neurons: impact on synaptic homeostasis and neurodegeneration. Nat Rev Neurosci. 13 (2), 77-93 (2012).
  16. Berthold, C. H., Fabricius, C., Rydmark, M., Andersen, B. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. I. Occurrence and distribution in large myelinated spinal root axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 925-940 (1993).
  17. Fabricius, C., Berthold, C. H., Rydmark, M. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. II. Occurrence and distribution in large myelinated spinal cord axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 941-954 (1993).
  18. Hollenbeck, P. J., Saxton, W. M. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5411-5419 (2005).
  19. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (27), 9953-9958 (2014).
  20. Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
  21. Chada, S. R., Hollenbeck, P. J. Nerve growth factor signaling regulates motility and docking of axonal mitochondria. Curr Biol. 14, 1272-1276 (2004).
  22. Yi, M., Weaver, D., Hajnoczky, G. Control of mitochondrial motility and distribution by the calcium signal: a homeostatic circuit. J Cell Biol. 167 (4), 661-672 (2004).
  23. Saotome, M., et al. Bidirectional Ca2+-dependent control of mitochondrial dynamics by the Miro GTPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20728-20733 (2008).
  24. Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
  25. Petrozzi, L., Ricci, G., Giglioli, N. J., Siciliano, G., Mancuso, M. Mitochondria and neurodegeneration. Biosci Rep. 27 (1-3), 87-104 (2007).
  26. Maresca, A., la Morgia, C., Caporali, L., Valentino, M. L., Carelli, V. The optic nerve: a "mito-window" on mitochondrial neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 55, 62-76 (2013).
  27. Su, B., et al. Abnormal mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 135-142 (2010).
  28. Vincent, A. M., et al. Mitochondrial biogenesis and fission in axons in cell culture and animal models of diabetic neuropathy. Acta Neuropathol. 120 (4), 477-489 (2010).
  29. Leinninger, G. M., et al. Mitochondria in DRG neurons undergo hyperglycemic mediated injury through Bim, Bax and the fission protein Drp1. Neurobiol Dis. 23, 11-22 (2006).
  30. Leinninger, G. M., Edwards, J. L., Lipshaw, M. J., Feldman, E. L. Mechanisms of disease: mitochondria as new therapeutic targets in diabetic neuropathy. Nat Clin Pract Neurol. 2, 620-628 (2006).
  31. Edwards, J. L., et al. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
  32. Fernyhough, P., Roy Chowdhury, S. K., Schmidt, R. E. Mitochondrial stress and the pathogenesis of diabetic neuropathy. Expert Rev Endocrinol Metab. 5 (1), 39-49 (2010).
  33. Schmidt, R. E., Green, K. G., Snipes, L. L., Feng, D. Neuritic dystrophy and neuronopathy in Akita (Ins2(Akita)) diabetic mouse sympathetic ganglia. Exp Neurol. 216 (1), 207-218 (2009).
  34. Penna, G., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
  35. Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
  36. Glas, U., Bahr, G. F. Quantitative study of mitochondria in rat liver. Dry mass, wet mass, volume, and concentration of solids. J Cell Biol. 29 (3), 507-523 (1966).
  37. Bertoni-Freddari, C., et al. Morphological plasticity of synaptic mitochondria during aging. Brain Research. 628 (1-2), 193-200 (1993).
  38. Kaasik, A., Safiulina, D., Zharkovsky, A., Veksler, V. Regulation of mitochondrial matrix volume. Am J Physiol. 292 (1), C157-C163 (2007).
  39. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Meth. 4 (7), 559-561 (2007).
  40. Park, J. Y., et al. Mitochondrial swelling and microtubule depolymerization are associated with energy depletion in axon degeneration. Neuroscience. 238, 258-269 (2013).
  41. Court, F. A., Coleman, M. P. Mitochondria as a central sensor for axonal degenerative stimuli. Trends Neurosci. 35 (6), 364-372 (2012).
  42. Baloh, R. H. Mitochondrial dynamics and peripheral neuropathy. Neuroscientist. 14 (1), 12-18 (2008).
  43. Chowdhury, S. K., Smith, D. R., Fernyhough, P. The role of aberrant mitochondrial bioenergetics in diabetic neuropathy. Neurobiol Dis. 51, 56-65 (2013).
  44. Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
  45. Lauria, G., et al. EFNS guidelines on the use of skin biopsy in the diagnosis of peripheral neuropathy. Eur J Neurol. 12 (10), 747-758 (2005).
  46. Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. Eur J Neurol. 17 (7), e944-e909 (2010).
  47. Umapathi, T., Tan, W. L., Tan, N. C. K., Chan, Y. H. Determinants of epidermal nerve fiber density in normal individuals. Muscle Nerve. 33 (6), 742-746 (2006).
  48. Lauria, G., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J Neurol Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
  49. Lauria, G., et al. Intraepidermal nerve fiber density at the distal leg: a worldwide normative reference study. J Peripher Nerv Syst. 15 (3), 202-207 (2010).
  50. Hamid, H. S., et al. Hyperglycemia- and neuropathy-induced changes in mitochondria within sensory nerves. Ann Clin Transl Neurol. 1 (10), 799-812 (2014).

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Hamid, H. S., Hayes, J. M., Feldman, E. L., Lentz, S. I. Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers. J. Vis. Exp. (127), e53369, doi:10.3791/53369 (2017).
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