JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Tredimensionell avbildning och analys av mitokondrier inom mänskliga Intraepidermal nervfibrer

Published: September 29, 2017
doi:
10.3791/53369
, , ,
1University of Michigan Medical School, 2Department of Neurology,University of Michigan, 3Department of Internal Medicine,University of Michigan

Summary

Detta protokoll använder tredimensionella (3D) imaging och analystekniker för att visualisera och kvantifiera nerv-specifika mitokondrier. Teknikerna som är tillämpliga på andra situationer där en fluorescerande signalen används för att isolera en delmängd av data från en annan fluorescerande signal.

Abstract

Målet med detta protokoll är att studera mitokondrierna inom intraepidermal nervfibrer. Därför utvecklades 3D imaging och analystekniker för att isolera nerv-specifika mitokondrier och utvärdera sjukdom-inducerad förändringar av mitokondrier i den distala spetsen på sensoriska nerver. Protokollet kombinerar fluorescens immunohistokemi, konfokalmikroskopi och 3D-bild analystekniker för att visualisera och kvantifiera nerv-specifika mitokondrier. Detaljerade parametrar definieras i hela förfarandena för att ge ett konkret exempel på hur du använder dessa tekniker för att isolera nerv-specifika mitokondrier. Antikroppar användes att märka nerv och mitokondrie signaler inom vävnadssnitt hud punch biopsier, som följdes av indirekt immunofluorescens att visualisera nerver och mitokondrier med gröna och röda fluorescerande signal respektive. Z-serie bilder förvärvades med konfokalmikroskopi och 3D analysprogramvara användes för att bearbeta och analysera signalerna. Det är inte nödvändigt att följa de exakta parametrar beskrivs inom, men det är viktigt att vara konsekvent med de valt under färgningen, förvärv och analys steg. Styrkan i detta protokoll är att den är tillämplig på en mängd olika omständigheter där en fluorescerande signalen används för att isolera andra signaler som annars skulle vara omöjligt att studera ensam.

Introduction

Mitokondrier tjänar vitala cellulära funktioner som inkluderar producera cell energi, buffrande kalcium, och reglerar nekrotisk och apoptotiska cell death1,2,3. Nervsystemet har en hög ämnesomsättning jämfört med kroppen4 tyder på att nervceller genererar en hög grad av cellulär energi i form av adenosintrifosfat (ATP) genom mitokondriell respiration. En hel del bevis dokument att neuronala funktioner är beroende av ATP5, särskilt på de synapser6. Fördelningen av mitokondrier inom nervceller är därför viktigt.

Under de senaste 10 åren en hel del information har visat att människohandel och dockning av neuronala mitokondrier är hårt reglerad. Motorproteiner är involverade i Distribuera mitokondrier till specifika cellulära fack i hela neuron. Handel med mitokondrier är särskilt viktigt eftersom nervceller project axoner och dendriter långt borta från soma. Kinesin motorproteiner direkt främst anterograd (bort från soma) människohandel mitokondrier längs mikrotubuli medan dynein motorproteiner direkt retrograd (mot soma) motilitet7,8,9 , 10. finns det cellulära signaler sådan mitokondriella membranpotential och impuls överledning som påverkar närvaro och riktning av mitokondriell människohandel11,12,13.

Förutom transport av mitokondrier, finns det specialiserade proteiner att lokalisera mitokondrier till specifika cellulära fack som har hög energi krav, såsom noder av Ranvier och synapser8,14, 17. I själva verket flesta av mitokondrier inom axoner är icke-rörliga9,13,18. Specialiserade proteiner som syntaphilin ankare mitokondrier till mikrotubuli längs axoner medan andra proteiner förankra mitokondrier till aktin cytoskelettet19–21. Tillväxtfaktorer och joner såsom kalcium har rapporterats att stödja upphörandet av mitokondrier rörelse att lokalisera dem till regioner där de är nödvändiga21,22,23.

Sammantaget är den människohandel och för av mitokondrier avgörande för korrekt funktion av nervceller. Till stöd för detta, har störningar i mitokondriell människohandel förknippats med flera neurologiska sjukdomar inklusive ALS, Huntingtons sjukdom, Charcot-Marie-Tooth sjukdom, Alzheimers sjukdom, hereditär spastisk parapares och Optikusatrofi15,24,25,26,27. Nyligen genomförda studier har fokuserat på mitokondriell dysfunktion och patologi som potentiella mekanism för diabetisk neuropati, det sensoriskt bortfall som förknippas med diabetes28,29,30,31 ,32,33. Hypotesen är att diabetes förändrar fördelningen av mitokondrier inom sensoriska projektionerna av kutan nervänden. Därför utvecklades en teknik för att visualisera och kvantifiera mitokondrier inom intraepidermal nervfibrerna (IENFs), distala spetsarna av dorsalrotsganglier ganglion sensoriska afferenter. Tekniken kombinerar fluorescens immunohistokemi av specifika mitokondrie och nerv fiber etiketter med konfokalmikroskopi z-serie förvärv av signaler med kraftfulla 3D-bild analys programvara att mäta fördelningen av nerv-specifika mitokondrier från mänskliga kutan punch biopsier att uppnå detta mål.

Protocol

hud punch biopsier erhölls från ämnen som rekryterades från ett stort community-baserade primärvården nätverk vid University of Utah Diabetes Center (Salt Lake City, UT). Denna studie godkändes av University of Michigan institutionella granskning styrelsen och följt grundsatserna i Helsingforsdeklarationen. Skriftligt informerat samtycke erhölls från varje ämne före provning. 1. fluorescens immunohistokemi förbereda punch biopsier för intraepidermal nerv fibe…

Representative Results

Visualisering och kvantifiering av mitokondrier inom mänskliga IENFs Fluorescens immunohistokemi möjliggör samtidiga märkning av flera signaler inom mänsklig hud biopsier att visualisera nerver, mitokondrier och kärnor. En plattan med 96 brunnar är ett bekvämt sätt att organisera stegen i förfarandet för immunohistokemi. Figur 1 visar att denna konfiguration står för up…

Discussion

Detta protokoll är utformad för att isolera, kvantifiera och analysera storleken och fördelningen av nerv-specifika mitokondrier inom IENFs i 3D från mänsklig hud biopsier. Det finns flera kritiska steg i protokollet. Fritt flytande fluorescens immunohistokemi är utformade för att fläcken flera signaler i varje prov, som ger en mer mångsidig metod för explorativ forskning44,45. Detta förfarande möjliggör penetrering av antikroppar i vävnaden för at…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöds av nationella institut för hälsa bidrag K08 NS061039-01A2, programmet för neurologi forskning & upptäckt, och A. Alfred Taubman Medical Research Institute vid University of Michigan. Detta arbete använde morfologi och bild analys Core för Michigan Diabetes Research Center, finansieras av nationella institut för hälsa Grant 5P 90 DK-20572 från nationella institutet för Diabetes och mag- och njursjukdomar. Författarna vill tacka J. Robinson Singleton och A. Gordon Smith (University of Utah) för deras generösa donation av mänsklig hud prover.

Materials

2% Zamboni's Fixative Newcomer Supply, Middleton, WI  1459A 2% paraformaldehyde, 0.2% saturated picric acid in phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4
10X Phosphate Buffered Saline (PBS)  Fisher Scientific, Pittsburgh, PA BP399-4 To make up 1X PBS
Image-iT FX Signal Enhancer ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts I36933 enhances Alexa Fluor dye signals by reducing nonspecific binding
Anti-Protein Gene Product 9.5 Antibody (Rabbit Polyclonal) Proteintech Group Inc. Rosemont, IL 14730-1-AP abbreviated as PGP9.5, replaces discontinued AbD Serotec (Cat. No. 7863-0504) antibody
Anti-Pyruvate Dehydrogenase E2/E3bp Antibody (Mouse Monoclonal) abcam, Cambridge, MA ab110333 abbreviated as PDH
Goat anti-mouse Secondary antibody Alexa Fluor 594 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11034 red-fluorescent conjugated secondaryantibody
Goat anti-rabbit Secondary antibody Alexa Fluor 488 conjugate ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts A-11032 green-fluorescent conjugated secondaryantibody
Albumin, from Bovine Serum Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A7906-100 abbreviated as BSA
Triton X- 100 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T9284 abbreviated as TX-100
0.22 µm Filter EMD Millipore, Billerica
MA		 MILLEX GP SLGP 033NS 0.22 µm Millipore filter
Parafilm M Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 13-374-10 Curwood Wisconsin LLC Parafilm M (PM-996)
Non-calibrated Loop Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 22-032092 inoculating Loop by Decon LeLoop (MP 199-25)
96-well Assay Plate Corning Incorporated, Corning, NY 3603 96-well flat bottom plate
Prolong Gold antifade reagent with DAPI ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts P-36931 DAPI staining of nuclei
Microscope Cover Glass 50 x 24 mm Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-544E Coverslips
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific, Pittsburgh, PA 12-550-15 Microscope Slides
Leica SP5 Laser Scanning Confocal Microscope Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL SP5 Confocal Microscope
Volocity x64 Software  Perkin Elmer, Waltham , MA version 4.4.0 Volocity software is used for Steps 3.1 and 3.2 in the protocol for image processing
Imaris x64 3 Dimensional Analysis Software Bitplane, Concord, MA version 7.7.1 Imaris software is used for Steps 3.3 through 3.5 in the protocol for image analysis
Excel Microsoft, Redmond, WA version Office 2013 Excel spreadsheet software is used for Step 3.6 in the protocol to summarize morphometric features
Optimum Cutting Temperature Compound Sakura Finetek USA, Inc., Torrance, CA 4583 abbreviated as OCT
Leica Cryostat Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL CM1850 Cryostat for cutting 50 µm sections
CellLight Mitochondria-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts C10600 Used as a postive control to label mitochondria with a green fluorescent signal
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nicholls, D. G., Budd, S. L. Mitochondria and neuronal survival. Physiol Rev. 80 (1), 315-360 (2000).
  2. Chan, D. C. Mitochondrial fusion and fission in mammals. Ann Rev Cell Dev Biol. 22, 79-99 (2006).
  3. Ni, H. M., Williams, J. A., Ding, W. X. Mitochondrial dynamics and mitochondrial quality control. Redox Biol. 4 (C), 6-13 (2015).
  4. Mink, J. W., Blumenschine, R. J., Adams, D. B. Ratio of central nervous system to body metabolism in vertebrates: its constancy and functional basis. Am J Physiol. 241 (3), R203-R212 (1981).
  5. Ames, A. CNS energy metabolism as related to function. Brain Res Brain Res Rev. 34 (1-2), 42-68 (2000).
  6. Harris, J. J., Jolivet, R., Attwell, D. Synaptic energy use and supply. Neuron. 75 (5), 762-777 (2012).
  7. Hollenbeck, P. J. The pattern and mechanism of mitochondrial transport in axons. Front Biosci. 1, d91-d102 (1996).
  8. Cai, Q., Sheng, Z. H. Mitochondrial transport and docking in axons. Exp Neurol. 218 (2), 257-267 (2009).
  9. Schwarz, T. L. Mitochondrial trafficking in neurons. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (6), (2013).
  10. Saxton, W. M., Hollenbeck, P. J. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 125 (Pt 9), 2095-2104 (2012).
  11. Sajic, M., et al. Impulse conduction increases mitochondrial transport in adult mammalian peripheral nerves in vivo. PLoS Biol. 11 (12), e1001754 (2013).
  12. Ohno, N., et al. Myelination and axonal electrical activity modulate the distribution and motility of mitochondria at CNS nodes of ranvier. J Neurosci. 31 (20), 7249-7258 (2011).
  13. Miller, K. E., Sheetz, M. P. Axonal mitochondrial transport and potential are correlated. J Cell Sci. 117, 2791-2804 (2004).
  14. Macaskill, A. F., et al. Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses. Neuron. 61 (4), 541-555 (2009).
  15. Sheng, Z. H., Cai, Q. Mitochondrial transport in neurons: impact on synaptic homeostasis and neurodegeneration. Nat Rev Neurosci. 13 (2), 77-93 (2012).
  16. Berthold, C. H., Fabricius, C., Rydmark, M., Andersen, B. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. I. Occurrence and distribution in large myelinated spinal root axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 925-940 (1993).
  17. Fabricius, C., Berthold, C. H., Rydmark, M. Axoplasmic organelles at nodes of Ranvier. II. Occurrence and distribution in large myelinated spinal cord axons of the adult cat. J Neurocytol. 22 (11), 941-954 (1993).
  18. Hollenbeck, P. J., Saxton, W. M. The axonal transport of mitochondria. J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5411-5419 (2005).
  19. Ohno, N., et al. Mitochondrial immobilization mediated by syntaphilin facilitates survival of demyelinated axons. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (27), 9953-9958 (2014).
  20. Kang, J. S., et al. Docking of axonal mitochondria by syntaphilin controls their mobility and affects short-term facilitation. Cell. 132 (1), 137-148 (2008).
  21. Chada, S. R., Hollenbeck, P. J. Nerve growth factor signaling regulates motility and docking of axonal mitochondria. Curr Biol. 14, 1272-1276 (2004).
  22. Yi, M., Weaver, D., Hajnoczky, G. Control of mitochondrial motility and distribution by the calcium signal: a homeostatic circuit. J Cell Biol. 167 (4), 661-672 (2004).
  23. Saotome, M., et al. Bidirectional Ca2+-dependent control of mitochondrial dynamics by the Miro GTPase. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (52), 20728-20733 (2008).
  24. Schon, E. A., Przedborski, S. Mitochondria: the next (neurode)generation. Neuron. 70 (6), 1033-1053 (2011).
  25. Petrozzi, L., Ricci, G., Giglioli, N. J., Siciliano, G., Mancuso, M. Mitochondria and neurodegeneration. Biosci Rep. 27 (1-3), 87-104 (2007).
  26. Maresca, A., la Morgia, C., Caporali, L., Valentino, M. L., Carelli, V. The optic nerve: a "mito-window" on mitochondrial neurodegeneration. Mol Cell Neurosci. 55, 62-76 (2013).
  27. Su, B., et al. Abnormal mitochondrial dynamics and neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 135-142 (2010).
  28. Vincent, A. M., et al. Mitochondrial biogenesis and fission in axons in cell culture and animal models of diabetic neuropathy. Acta Neuropathol. 120 (4), 477-489 (2010).
  29. Leinninger, G. M., et al. Mitochondria in DRG neurons undergo hyperglycemic mediated injury through Bim, Bax and the fission protein Drp1. Neurobiol Dis. 23, 11-22 (2006).
  30. Leinninger, G. M., Edwards, J. L., Lipshaw, M. J., Feldman, E. L. Mechanisms of disease: mitochondria as new therapeutic targets in diabetic neuropathy. Nat Clin Pract Neurol. 2, 620-628 (2006).
  31. Edwards, J. L., et al. Diabetes regulates mitochondrial biogenesis and fission in mouse neurons. Diabetologia. 53 (1), 160-169 (2010).
  32. Fernyhough, P., Roy Chowdhury, S. K., Schmidt, R. E. Mitochondrial stress and the pathogenesis of diabetic neuropathy. Expert Rev Endocrinol Metab. 5 (1), 39-49 (2010).
  33. Schmidt, R. E., Green, K. G., Snipes, L. L., Feng, D. Neuritic dystrophy and neuronopathy in Akita (Ins2(Akita)) diabetic mouse sympathetic ganglia. Exp Neurol. 216 (1), 207-218 (2009).
  34. Penna, G., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
  35. Lentz, S. I., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J Histochem Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
  36. Glas, U., Bahr, G. F. Quantitative study of mitochondria in rat liver. Dry mass, wet mass, volume, and concentration of solids. J Cell Biol. 29 (3), 507-523 (1966).
  37. Bertoni-Freddari, C., et al. Morphological plasticity of synaptic mitochondria during aging. Brain Research. 628 (1-2), 193-200 (1993).
  38. Kaasik, A., Safiulina, D., Zharkovsky, A., Veksler, V. Regulation of mitochondrial matrix volume. Am J Physiol. 292 (1), C157-C163 (2007).
  39. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nat Meth. 4 (7), 559-561 (2007).
  40. Park, J. Y., et al. Mitochondrial swelling and microtubule depolymerization are associated with energy depletion in axon degeneration. Neuroscience. 238, 258-269 (2013).
  41. Court, F. A., Coleman, M. P. Mitochondria as a central sensor for axonal degenerative stimuli. Trends Neurosci. 35 (6), 364-372 (2012).
  42. Baloh, R. H. Mitochondrial dynamics and peripheral neuropathy. Neuroscientist. 14 (1), 12-18 (2008).
  43. Chowdhury, S. K., Smith, D. R., Fernyhough, P. The role of aberrant mitochondrial bioenergetics in diabetic neuropathy. Neurobiol Dis. 51, 56-65 (2013).
  44. Kennedy, W. R., Wendelschafer-Crabb, G., Johnson, T. Quantitation of epidermal nerves in diabetic neuropathy. Neurology. 47, 1042-1048 (1996).
  45. Lauria, G., et al. EFNS guidelines on the use of skin biopsy in the diagnosis of peripheral neuropathy. Eur J Neurol. 12 (10), 747-758 (2005).
  46. Lauria, G., et al. European Federation of Neurological Societies/Peripheral Nerve Society Guideline on the use of skin biopsy in the diagnosis of small fiber neuropathy. Report of a joint task force of the European Federation of Neurological Societies and the Peripheral Nerve Society. Eur J Neurol. 17 (7), e944-e909 (2010).
  47. Umapathi, T., Tan, W. L., Tan, N. C. K., Chan, Y. H. Determinants of epidermal nerve fiber density in normal individuals. Muscle Nerve. 33 (6), 742-746 (2006).
  48. Lauria, G., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J Neurol Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
  49. Lauria, G., et al. Intraepidermal nerve fiber density at the distal leg: a worldwide normative reference study. J Peripher Nerv Syst. 15 (3), 202-207 (2010).
  50. Hamid, H. S., et al. Hyperglycemia- and neuropathy-induced changes in mitochondria within sensory nerves. Ann Clin Transl Neurol. 1 (10), 799-812 (2014).

Tags

3D ImagingMitochondriaIntraepidermal Nerve FibersFluorescence ImmunohistochemistryPGP9.5PDHSecondary AntibodiesSignal EnhancementEpidermal Nerve FibersNeurological Complications

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hamid, H. S., Hayes, J. M., Feldman, E. L., Lentz, S. I. Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers. J. Vis. Exp. (127), e53369, doi:10.3791/53369 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image