Abstract
뇌졸중 임상 스트로크 프리젠 테이션의 최대 25 %를 백질 계정에 영향을주지는 5 ~ 10 배 더 클 수있다 속도에서 자동으로 발생하고 혈관성 치매의 발전에 크게 기여하고있다. 초점 백질 행정의 몇 가지 모델이 존재하고 적절한 모델이 부족 뇌졸중 이러한 유형의 후 부상 응답 및 수리에 관련된 neurobiologic 메커니즘의 이해를 방해하고있다. 다른 피질 뇌졸중 모델의 주요 제한은 국소 적 백질에 경색을 제한하지 않거나 주로 비 뮤린 종 검증되었다는 것이다. 이것은 백질 행정 신경 생물학을 연구 쥐 연구 도구의 다양한 적용 할 수있는 능력을 제한한다. 여기에서 우리는 돌이킬 수없는 eNOS의 억제제의 지방 주입을 사용하여 쥐의 흰색 문제에 초점 뇌졸중의 안정적인 생산을위한 방법론을 제시한다. 우리는 또한이 독특한 정위를 포함하는 일반적인 프로토콜에 몇 가지 변화를 제시변화, 크게이 기술의 응용 가능성을 확장 역행의 연결을 추적뿐만 아니라 신선한 조직 라벨 및 해부. 여러 방법이 뇌졸중이 일반적이고 파악 하였다 형태의 neurobiologic 효과를 분석하는 이러한 변화 할 수 있습니다.
Protocol
이 프로토콜에서 동물의 사용은 캘리포니아 로스 앤젤레스의 동물 보호 및 사용위원회의 대학 승인 절차에 따라 수행되었다.
참고 : 대상 쥐 인구를 식별하여 시작합니다. 이전 연구에서 유일한 수컷 야생형 C57 / BL6 마우스는 다양하지만 유전자 또는 녹아웃 마우스는 또한 사용될 수 있으며, 사용되어왔다. 정위 좌표가 C57 / BL6 해부학을 기반으로합니다. 각 사용자가 처음에 흰색 문제에 스트로크의 현지화를 확인하는 것이 좋습니다.
1. 흰색 물질 스트로크 유도 - 내측 각도 접근
- 선단 직경이 15 내지 25 ㎛의 (11) 사이가되도록 0.5 mm 모세관을 이용하여 뽑아 유리 피펫을 제조함으로써 시작한다.
- 멸균 0.9 % 생리 식염수에 27.4 ㎎ / ㎖ (130 μM)에서 - L-니오의 멸균 10 μL 나누어지는 ((1) -iminoethyl-L - 오르니 틴 염산 N (5))를 준비합니다.
- 인출 된 유리 피펫을 사전 작성유리 피펫을 부착하여 L-니오 (2-5 μL)의 작은 부피를 진공 라인에 접속 튜빙. 벤치 위에 피펫 평면을 배치하고, L-니오 용액에 끌어 끝을 삽입합니다.
- 피펫의 0.5 mm 부의 최소 2 mm가 채워질 때까지 진공을 적용한다. 진공을 끄고 피펫을 철회. 단계 1.12까지 따로 보관 해 둡니다.
- 유도 챔버에 마우스를 위치시키고 표준 32 % 이소 플루 란을 이용하여 마우스를 마취 유도 증발기를 통해 유동 (5 L / 분 5 L / 분으로 산소를 0.5 L / 분으로 흡입 N 2) 1 분 또는 깊이 anesthesized까지. 정위 현미경이 장착 된 정위 장치에 마우스를 전송합니다. 기화기를 통해 흘러 32 % 이소 플루 란을 사용하여 유지 보수 마취를 제공하고 코 콘 (2 L / 분 5 L / 분의 산소와 0.5 L / min의 N 2 흡입). 발가락 핀치와 마취의 깊이를 확인합니다.
- 36 °에 주입 팔을 조정합니다.
- AffiXA 낮은 볼륨 압력 분사 시스템의 말단에 유리 피펫 홀더를 뽑아 정위 설정의 분사 아암에 부착.
- 코트 두 눈을 통해 석유 젤리와 장소 인공 눈물 연고와 마취 된 동물의 수염. 머리 위에 5~10cm 개방과 동물의 머리 위에 멸균 드레이프를 배치하여 무균 수술 부위를 준비합니다. 두개골을 덮는 털을 면도하여 aspetic 수술 표면을 준비합니다. 교대 betadine 70 % 알코올 면봉으로 두피를 청소합니다.
- 두개골 표면을 노출 멸균 미세 가위로 1.5 cm 중간 선 두피 절개를합니다. 멸균 면봉으로 두개골을 건조하고 1-3X 확대에 정위 현미경을 사용하여, 멸균 마이크로 포인트 도구를 사용하여 상부 골막 조직을 제거합니다.
- 미세한 포인트 마커를 이용하여 기준점으로 브레 그마 표시.
- 멸균 미세 STIP 외과 드릴 비트를 사용하여 2mm ellipitical 개두술을 드릴0; 브레 그마에서 후방 시작하여 전방 단지 중간 선 왼쪽으로 연장. 뼈 조각을 제거하고 대뇌 피질을 가시화 할 수 있도록 부드러운 조직 위에 놓인.
- 간헐적으로 멸균 식염수 방울을 적용하여 수술 필드와 촉촉한 대뇌 피질의 표면을 유지합니다.
- 정위 장치의 인젝터 팔에 뽑아 유리 피펫을 붙입니다. 브레 그마와 피펫의 선단을 맞추고 정위 좌표를 제로.
- 첫 번째 전방 / 후방 (A / P)에 피펫을 발전 / 표 1에서 제공하는 좌표 (M / L) 측면을 내측.
- 대뇌 피질의 표면에 피펫을 발전 지느러미 / 복부 (D / V) 측정을 제로.
- 천천히 최초의 D / V 표 1에 좌표에 도달 할 때까지 뇌에 피펫을 전달합니다.
- 뇌에 L-니오 100 NL 주입 환류 방지 5 분을 기다린 20 msec의 펄스를 20 psi에서 설정된 낮은 압력 볼륨 주입 시스템을 사용하여피펫 트랙입니다.
- 정위 현미경의 접안 렌즈와 3 배의 배율에서 교정 레티클을 사용합니다.
- 따라서, 좌표들의 각각의 세트에 대한 뽑아 유리 피펫으로부터 (100 NL에 대응하는 0.5 mm 직경 피펫 0.5 mm 길이) 0.100 mm (3)의 총 변위. 십자선을 사용하여 측정하고 각각의 사용 확대 및 규모에 따라 달라집니다 설정 때문에 표준화.
- 공기 유체 메 니스 커스가 시상을 갖도록 각 분사시 정확한 량 측정을 위해, 측으로부터 현미경으로 각진 피펫 접근. 메 니스 커스는 피펫의 내부 및 외부 벽 모두 같은 초점면에 표시됩니다.
- 천천히 피펫을 철회하고 단계를 반복 1.13-1.16.3 표 1에서 제공하는 좌표의 두 번째와 세 번째 세트에서.
- 최종 주입 후, 피펫을 제거하고 개두술 사이트를 채우기에 충분한 뼈 왁스를 배치합니다. 에이두피 상처의 가장자리 pproximate 및 피부 접착제로 결합한다.
- 두피 절개와 연관된 로컬 통증을 방지하는 방지 멸균 30 G 바늘을 이용하여 상처 마진으로 0.5 %에 마르케 0.1㎖를 주입한다.
- 5 일간 마시는 물에 주택 공급 수술 후 항생제 동물 (0.48 ㎎ / ㎖ 트리 메소 프림 - 설파, 0.5 ㎎ / ㎖ 레보플록사신)를 돌려줍니다.
2. 흰색 물질 스트로크 유도 - 후방 각도 접근
- 전치부 배향 45 도로 설정 정위의 분사 암을 조정 제외한 중간 각도 접근 프로토콜과 1.1-1.12 단계를 수행한다.
- 첫 번째 A / P에 피펫을 사전 및 M / L 표 2에 제공 좌표.
- 전체 나머지 단계 측면 각도 접근 프로토콜과 같은 1.14-1.20.
3. 역행의 연결 라벨
- 10 멸균 준비0.9 % 생리 식염수에 54.8 ㎎ / ㎖에서 L-니오의 μL 나누어지는.
- 0.9 % 생리 식염수에 20 % Fluororuby (20 % 바이오틴 덱스 트란 아민 또는 2 % Fluorogold)의 멸균 나누어지는을 준비합니다.
- 27.4 ㎎ / ㎖ L-니오 10 % Fluororuby의 최종 농도 1 : 함께 1 희석.
- 단계 1.3-1.23에 위와 같이 스트로크 프로토콜을 수행합니다.
- 이전 8 설명한대로 관류 고정, 냉동 절편 및 현미경으로 조직 섹션에서 기본적으로 형광 추적을 시각화합니다.
면역 형광 4. 조직 처리
- 3 시간에서 스트로크 후 14 일까지 적절한 사후 행정 간격으로, 이소 플루 란 과다 복용 또는 로컬 IACUC를 통해 마우스 절차를 승인 안락사.
- 각도 가위를 사용하여 흉강을 열고 좌심실로 23 G 나비 바늘을 삽입합니다.
- 관류 액에 대한 유출을 추적 할 수 있도록 미세 가위를 사용하여 우심방에있는 작은 상처를 놓습니다.
- 로 transcardially RT에서 10 ㎖ / 분의 속도로 차가운 4 % 파라 포름 알데히드의 30 내지 40 ml로 이어 차가운 인산 완충 식염수 용액으로 관류 30-40.
- 마우스를 목을 벨과 후방 두개골을 열 멸균 가위를 사용하여 두뇌를 제거하고 부드럽게 24 시간 동안 차가운 4 % PFA로 뇌를 주걱으로 위에있는 두개골을 제거 배치하고 48 시간 동안 PBS의 30 % 자당로 전송 .
- 그라 이오 스탯을 사용하여 마흔 미크론 부동 섹션을 준비하고 이전에 6-8 바와 같이 항체 처리를 수행합니다. 이 연구에서, 아래의 항체를 사용하여 토끼 항 - 신경 미세 섬유 (200) (1 : 500 희석); 토끼 항 멘틴 (1 : 500); 염소 항 GFAP (1 : 500); 토끼 항 년 Iba-1 (1 : 1000).
단백질이나 RNA 분석 5. 조직 처리
- 3 시간에서 스트로크 후 14 일까지 적절한 사후 행정 간격으로, 이소 플루 란 과다 복용을 통해 안락사 또는 로컬 IACUC는 절차를 승인했다.
- 목을 베다마우스 뒤쪽 두개골을 열 멸균 가위를 사용하여 뇌를 제거하고 부드럽게 주걱으로 위에있는 두개골을 제거합니다.
- 후각 망울과 시신경을 절단하는 뇌의 전면에 멸균 4mm 주걱을 삽입합니다. 조심스럽게 두 개관에서 뇌를 들어 올려 (1 배 행크의 균형 소금 솔루션, 25 mM의 HEPES-KOH, pH를 7.4, 35 mM의 포도당, 4 mM의 중탄산 나트륨, 0.01 ㎎ / ㎖ 시클로 헥시 미드) 얼음처럼 차가운 해부 버퍼에 배치합니다.
- 뇌 블록과 멸균 새 면도날을 사용하여 차가운 해부 버퍼 스트로크와 장소를 포함 2-3mm 석판을 준비합니다.
- 해부 현미경에서 주입 된 반구의 백질 기본 운동 피질을 식별합니다. 이상 졸중 간격으로 상기 영역은 시각적 초점 괴사 미엘린 창백 의해 식별 될 수있다.
(이전 후 뇌졸중 간격, 10 %의 1 μL와 혼합 L-니오의 주입에 빠른 그린은 뇌졸중의 시각적 식별을 허용 할 수 있습니다 참고 :- 해부 현미경의지도와 신선한 메스를 사용에서 신중하게 빠른 그린 라벨 또는 조직 손실 중 하나에 의해 식별 스트로크를 포함하는 흰색 물질의 영역을 해부하다. 원하는대로 상부 피질 및 기본 줄무늬를 제거합니다.
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Representative Results
제시된 모델을 사용하여, 백질 기본 앞다리 감각 피질 확실 타겟팅 될 수있다. 일반적으로 인간의 열공 경색에서 알 수 있듯이이 화학적으로 유도 된 뇌졸중 모델은 초점 축삭과 수초 손실, astrocytosis 및 microgliosis (그림 1)을 생성한다. 세 주사를 이용하여 임상 적으로 유용한 모델 앞다리 모터 태스크 7에 이른 장애 및 뇌 조직 경험 작지만 상당한 부분 확립 면역 조직 화학, 면역 형광 및 생화학 기술이 양적 레벨에서 가능하고 신뢰할 수 있다는 허혈. 뇌졸중 유도 후 이른 시점 (HR)에서 축삭 분자 조직 변경 (도 2)을 검출 할 수있다. 칠일에서, 스트로크는 축삭 손실 (그림 1a)의 외접 영역의 성숙을 완료합니다. 우리의 손,이 방법은 초점 백질 병변 approxima을 생산tely 800 μm의 수평 직경과 뇌량의 전후방 축 방향으로 약 1mm 연장. 칠일으로 평균 전체 경색 크기가 약 0.200 mm (3)이고, 타원형 형상을 가질 것이다. 우리는 동물 사이 섹션, 타원의 부분이 발생하는 위치에 따라 사이에 두 스트로크의 크기는 약 10 %의 변화를 관찰했다. 경색의 크기 또한 증가는 거의 칠일 이상 보이지 않는다.
축삭 행정의 영역을 돌출 (그림 3)이 층 5 층 (6) 신경 세포 기관에 상당한 신경 라벨에 덱스 트란 아민 결과의 동시 주입의 추가. 절차 (미세 바늘의 통로)의 가짜 측면에 의해 손상되지 상부 대뇌 피질의 신경 세포는 말초 축삭 손상을 받아야하고, L-니오 준비와 추적의 포함으로 식별 할 수 있습니다. 이 방법은 사용했다 D는 스트로크 (8) 후 축삭 초기 세그먼트의 역동적 인 변화를 설명한다.
스트로크 영향 조직 영역의 작은 크기는 2,3,5- 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC) 염색과 같은 다른 일반적인 기술의 사용을 제한하는 반면, 백질 스트로크 영역 신선한 조직에서 발견 될 수있다. 이러한 빠른 그린 등의 일반적인 염료의 첨가는 해부 현미경 해부 될 수있는 조직의 식별 영역 (도 4)을 생성한다. 해부하는이 조직은 웨스턴 블롯 또는 면역, 또는 RNA 분리 및 분석 (그림 4C) 용으로 단백질 분석에 사용할 수 있습니다되면. 다양한 유전자 도입 마우스 라인의 사용을 통해, 혁신적인 접근법의 다양한 세포의 운명 맵핑 연구 레이저 캡처 미세 절제 (도 4C)을 포함 초점 백질 뇌졸중 후 신경 생물학을 연구 할 수있다.
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그림 1 :. 내측 및 후방 각도 접근 방법 모두를 사용하여 초점 백질 스트로크 neurofilaments에 대한 면역 형광 라벨 (A, 적색) 내측 접근법을 사용하여 칠일 뇌졸중 후 축삭 손실의 정도를 보여줍니다. 후방 경사 방식을 사용하여, 백질 스트로크 병변 단지 뇌실 (B, C) 상기 타겟 강렬한 소교 (B)과의 반응성 성상 세포 (C)를 도시한다. 두 성상 세포 중간 필라멘트 마커, 멘틴 (빨간색)와 아교 섬유 성 산성 단백질 (녹색 GFAP는) 두 뇌졸중 (C) 후 백질 (섬유) 성상 세포의 형태 변화를 알 수있다. 스케일 바 = 500 μm의. 버전 큰 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 시온.
그림 2 :. 흰색 물질 스트로크 변경합니다 축삭 마이크로 도메인 조직 contactin 관련 단백질에 의해 표시 베타-IV의 스펙 트린 (빨간색)와 paranode에 의해 표시된 노드에서 백질 스트로크 유도, 축삭 마이크로 도메인 조직, 3 시간 (caspr 내에서, 녹색), 중단된다 (화살표, B). 동측 흰색 물질이 손실 axoglial 접점 (B와 D)와 축삭의 전형적인 노드와 paranodal 신장을 나타내고있다 반대측 백질 축삭 일반 노드, paranodal 및 juxtaparanodal 조직 (A 및 C)를 보여줍니다. 스케일 바 = 5 μm의.
그림 3 : 역행 신경 Labelin흰색 물질 스트로크와 g는 축삭 손상과 개별 뉴런을 식별합니다. 스트로크 유도시 형광 덱스 트란 아민 (적색)의 공동 주입 뇌졸중 부상으로 축삭 개별 뉴런의 식별을 할 수 있습니다. 라벨의 대부분은 5 층에서 축삭과 스트로크를 덮는 기본 감각 피질에서 6 뉴런에서 발생합니다. 이미지는 뇌졸중 후 7 일을 나타냅니다. 스케일 바 = 500 μm의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 스트로크 유도시의 빠른 그린의 생화학 및 전사 분석 실험 공동 주입에있는 사용을위한 흰색 물질 스트로크 병변의 이외에 Microdissection은 24 시간 (A, 상단 패널)에서 부상당한 지역의 조기 발견 할 수 있습니다. Immunoblotti특정 축삭 단백질 NG 단독 스트로크 (A, 하부 패널)의 영역에서의 감소를 보여주기 위해 수행 될 수있다. 이상 시점에서, 백질 스트로크 (왼쪽 패널)의 영역을 국소 적 고유 라벨 (B)없이 절개 될 수있다. 오른쪽 하단 패널은 스트로크 (B)를 포함하는 흰색 물질의 해부 영역을 표시하는 동안 오른쪽 상단 패널 해부 영역의 제거 후 백질의 영역을 보여줍니다. 흰색 물질 (C)에서 해부 지역에서 분리 된 RNA를 사용하여 희소 돌기 아교 세포 특이 유전자에 대한 PCR. IL은 동측를 =; CL = 반대측; C = 제어; S = 스트로크.
| 주입 | 전방 / 후방 | 중간 / 측면 | 지느러미 / 복부 |
| 0.22 | 0.22 | -2.10 | |
| 이 | 0.70 | 0.15 | -2.16 |
| 삼 | 1.21 | 0.15 | -2.18 |
표 1 : (mm 단위) 측면 각도 접근에 대한 정위 좌표.
| 주입 | 전방 / 후방 | 중간 / 측면 | 지느러미 / 복부 |
| -0.75 | -0.96 | -2.10 | |
| 이 | -1.00 | -0.96 | -2.05 |
| 삼 | -1.25 | -0.96 | -2.00 |
표 2 : (mm)에 후방 각도 접근에 대한 정위 좌표.
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Discussion
피질 행정 이전 모델 번호 12-14 래트 및 마우스에서 내부 -6,15- 캡슐에 엔도 텔린 -1의 국소 주입, 피질 및 선조체 백질 포함 설명되었다. 작은 초점 스트로크의 최근 모델은 콜레스테롤 microemboli의 경동맥 (16)에 주입 한 번의 침투 세동맥 (17)의 photothrombotic 폐쇄를 활용하고있다. 이러한 모델은 각각 장단점 5를 모두 갖는다. 현재 기술 모델은 축삭 이상 손실, 수초 저하, 초점 괴사 코어와 최소이며, 7 세에 따라 상당히 빠른 회복을 보여 임상 적자를 포함하여 인간의 열공 경색을 모방 특성을 가지고 있습니다 병변을 생산하고 있습니다. 쥐의 흰색 물질을 표적으로하는 것은 기계적인 연구를 지원할 수있는 유전자 조작의 다양한 있습니다.
임계프로토콜의 단계에서는 정확한 정위 좌표를 이용 포함한다. 쥐의 흰색 물질의 크기가 작고 변형에 변형까지 다양하기 때문에, 정위 좌표의 개정은 사용 마우스의 연령과 변형에 따라 필요할 수 있습니다. 이 직접 경색의 크기를 상관 관계로 주입 볼륨의 제어는 중요하다. 큰 주사는 상부 피질과 기본 선조체에 잠식 큰 스트로크를 생성합니다.
여기에 설명 된 방법을 사용 ET-1의 초점 주입이보고되었지만 엔도 텔린-1은 뇌졸중 후 백질 생물학의 연구를 교란 희소 돌기 아교 세포의 분화 및 성숙 10,18에 직접 분비 효과가 나타났다. 반대로, L-니오 접근 타겟 내피 세포는 단독으로 동일한 병변 제조 부상 응답에 포함 된 셀의 모든 교란 분비 효과를 없앤다. L-니오 직접 세포 독성 및 SELEC 아니다테드 도즈는 도즈 예비 이관 실험에 의해 측정 하였다 (데이터는 보이지 않음). 후방 각도 접근 방식은보다 정확하게 일차 운동 피질에서 언더컷 축삭은 백질 손상에 기인 할 수있는 최대한의 행동 적자를 생산하기 위해 개발되었다. 또한 중간 각도 접근 방식은 손해 운동 피질의 축삭을하지만 더 옆으로 확장 및 기본 감각 피질의 기초가 축삭을 포함한다.
스트로크 병변는 제 24 시간에 걸쳐 비교적 빠르게 확장한다. 칠일으로, 경색의 크기가 최대이고 우리는이 시간을 초과하면 상당한 병변 성장이 관찰되지 않았다. 추가적인 이벤트 및 세포 축삭 퇴행이 초기 단계 이상 발생하지만 괴사 코어에 의해 측정 된 경색 크기가 개입의 부재 크게 변하지 않을 것이다.
스트로크시의 신경 해부학 추적자의 공동 주입은 허혈성 축삭 손상을 발생하는 신경 세포를 식별합니다. 사용 중 하나 의대IAL 또는 후방 각도의 접근 방식은, 손상된 축삭 돌기 신경 세포 기관은 무사히 남아있다. 이것은 중추 신경계의 신경 세포에 허혈 axotomy의 효과를 연구하는 데 유용한 모델을 만듭니다. 우리는 모두 뇌졸중 손상 축삭 우수 흡수를 보여 덱스 트란 아민, fluorogold을 포함하여 주로 역행 추적기를 사용했다. 유전자 변형 및 녹아웃 마우스 라인의 다양한 사용함으로써,이 프로토콜의 사용자는 백질 스트로크 부상 응답 및 수리에 관여하는 신경 세포의 유전자의 특정 역할을 조사 할 수 있습니다.
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Disclosures
없음
Acknowledgments
SN 및 MDD는 NIH K08 NS083740과 신경의 UCLA 부서의 지원을 받았다. AJG는 박사 미리 암과 셀던 아델슨 G. 의학 연구 재단과 래리 L. Hillblom 재단의 지원을 인정합니다. KLN은 기꺼이 미국 심장 협회 14BFSC17760005 ASA-Bugher 뇌졸중 센터에서 지원을 인정합니다. ILL, EGS와 STC는 NIH R01 NS071481에 의해 지원되었다. JDH는 NIH K08 NS083740의 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-N5-(1-Iminoethyl)ornithine, Dihydrochloride | Calbiochem | 400600-20MG | |
| Isoflurane | Phoenix Pharmaceutical, Inc. | NDC 57319-559-06 | |
| Capillary tubes | World Precision Instruments | 50-821-807 | |
| Picospritzer | Parker Instrumentation | Picospritzer II | |
| Stereotactic setup | Kent Scientific | KSC51725 | |
| Pipette puller | KOPF | Model 720 | |
| Stereomicroscope SZ51 | Olympus | 88-124 | |
| Fine scissors | Fine Scientific Tools | 14084-08 | |
| Forceps | Harvard Apparatus | PY2 72-8547 | |
| Curved Forceps | Harvard Apparatus | PY2 72-8598 | |
| Blunt dissection tool | Fine Scientific Tools | 10066-15 | |
| Drill | Dremel | 8220-1/28 | |
| Drill bits | Fine Scientific Tools | 19007-05 | |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Marcaine | HOSPIRA | NDC 0409-1610-50 | |
| Trimethoprim-Sulfamethaxole | STI Pharmacy | NDC 54879-007-16 | |
| Fluororuby | Fluorochrome Inc | 30 mg | |
| Paraformaldehyde | Fisher | O4042-500 | |
| Sucrose | Fisher | BP220-10 | |
| Cryostat | Leica CM3050 S | 14047033518 | |
| Glass slides | Fisher | 12-544-7 | |
| Fast Green | Sigma | F7252-5G | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ1500 | |
| 23 G butterfly needle | Fisher | 14-840-35 | |
| 10x Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14065056 | |
| 1 M HEPES-KOH, pH 7.4 | Affymetrix | 16924 | |
| D-Glucose | Sigma | G8270 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Cyclohexamide | Sigma | 01810 |
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