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Immunology and Infection

मेजबान कोशिकाओं के साथ anaerobic बैक्टीरिया की बातचीत के मूल्यांकन के लिए एक मॉडल जीव के रूप Porphyromonas gingivalis

Published: December 17, 2015 doi: 10.3791/53408
Automatic Translation
1, 1,2,3
1Philips Institute for Oral Health Research, Virginia Commonwealth University, 2Department of Microbiology and Immunology, Virginia Commonwealth University, 3Department of Biochemistry, Virginia Commonwealth University

Abstract

अवायवीय जीवाणु तक इस तरह के पेट, मुंह, और योनि के रूप में कई मानव आलों में aerobes संख्या से बढ़ना। इसके अलावा, अवायवीय संक्रमण आम है और अक्सर स्वदेशी मूल के हैं। मानव कोशिकाओं पर आक्रमण करने के लिए कुछ अवायवीय रोगाणुओं की क्षमता उन्हें सहज उन्मुक्ति से बचने के लिए और साथ ही मेजबान सेल व्यवहार मिलाना के लिए अनुकूल उपायों देता है। हालांकि, anaerobic बैक्टीरिया चुनौतियां खड़ी हो सकती घटनाओं की प्रायोगिक जांच के दौरान रहते सुनिश्चित कर रहे हैं। Porphyromonas gingivalis, एक ग्राम नकारात्मक अवायुजीवीय, यूकेरियोटिक गैर phagocytic कोशिकाओं की एक किस्म पर हमला करने में सक्षम है। यह लेख सफलतापूर्वक संस्कृति और पी की क्षमता का आकलन करने के लिए रूपरेखा कैसे gingivalis मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVECs) पर आक्रमण करने के लिए। दो प्रोटोकॉल विकसित किए गए: एक सफलतापूर्वक आक्रमण और मेजबान के भीतर जीवित है, और अन्य मेजबान कोशिकाओं के साथ बातचीत बैक्टीरिया कल्पना करने के लिए कर सकते हैं कि बैक्टीरिया को मापने के लिए। इन तकनीकों में एक anae के उपयोग की जरूरतRobic पी की आपूर्ति करने के लिए कक्ष इष्टतम विकास के लिए एक anaerobic वातावरण के साथ gingivalis।

पहले प्रोटोकॉल काफी हद तक बैक्टीरिया द्वारा मेजबान कोशिकाओं के आक्रमण का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है जो एंटीबायोटिक संरक्षण परख, पर आधारित है। हालांकि, एंटीबायोटिक संरक्षण परख सीमित है; एंटीबायोटिक उपचार और मेजबान सेल निम्नलिखित कृषि योग्य हैं कि केवल इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया मापा जाता है। रहते हैं और मृत दोनों मेजबान कोशिकाओं, के साथ बातचीत के सभी बैक्टीरिया का आकलन करने के लिए, हम मेजबान रोगज़नक़ बातचीत की जांच करने के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करता है कि एक प्रोटोकॉल विकसित की है। जीवाणु fluorescently, 2 'के साथ 7'-Bis- (2 carboxyethyl) चिह्नित कर रहे हैं -5- (और -6) -carboxyfluorescein acetoxymethyl एस्टर (BCECF-एएम) और अवायवीय स्थितियों के तहत कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया। 0.2% ट्राइटन X-100 के साथ paraformaldehyde और permeabilization के साथ फिक्सिंग के बाद मेजबान कोशिकाओं को क्रमश: सेल cytoskeleton और नाभिक लेबल करने के लिए TRITC phalloidin और DAPI के साथ लेबल रहे हैं। एकाधिक आईएमएविभिन्न फोकल प्वाइंट (जेड ढेर) में ले लिया GES बैक्टीरिया के अस्थायी स्थानिक दृश्य के लिए प्राप्त कर रहे हैं। इस अध्ययन में इस्तेमाल के तरीके किसी भी कृषि योग्य अवायुजीवीय और किसी भी यूकेरियोटिक सेल प्रकार के लिए लागू किया जा सकता है।

Introduction

अवायवीय जीवाणु मानव शरीर के लगभग सभी सतहों उपनिवेश। ऑक्सीजन सांद्रता कम कर रहे हैं, जहां आंतों और genitourinary इलाकों की वनस्पतियों में प्रमुख हैं, वे भी त्वचा, मुंह, नाक और गले 1 पर उच्च स्तर पर मौजूद हैं। अवायवीय जीवाणु अंतर्जात में संक्रमण का एक आम कारण हैं और अक्सर रोगग्रस्त साइटों से अलग कर रहे हैं। हालांकि, क्योंकि उनके दुराराध्य प्रकृति के कारण, anaerobes अलग और संस्कृति के लिए मुश्किल हो सकता है। अवायवीय जीवाणु शामिल अध्ययन प्रतिबंधित शर्तों के तहत किया जाना चाहिए। आधुनिक अवायवीय-संस्कृति तकनीक शोधकर्ताओं ने कई अवायवीय प्रयोगशाला उपभेदों या यहां तक कि नैदानिक ​​वियोजन 2,3 अध्ययन करने के लिए आवश्यक अवायवीय सेटिंग्स की नकल करने की अनुमति देते हैं।

रोगजनक अवायवीय जीवाणु जिसमें वे रहते हैं मेजबान कोशिकाओं के साथ एक गतिशील संबंध और सह-विकास को विकसित किया है। अधिकांश anaerobes infecti तक पहुँचने से पहले मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया द्वारा हत्या करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैंous स्तरों। हालांकि, कुछ रोगजनक बैक्टीरिया से बचने के लिए या मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के नाश के लिए तंत्र विकसित किया है। वे इस तरह के प्रतिरक्षा मान्यता, प्रतिरक्षा मध्यस्थों के निराकरण, सेल की मध्यस्थता उन्मुक्ति का परिवर्तन, मेजबान कोशिकाओं के आक्रमण, और 4 संकेत प्रतिरक्षा के परिवर्तन की चोरी के रूप में तंत्र के माध्यम से इस लक्ष्य को पूरा। Porphyromonas gingivalis, दोनों मौखिक और में फंसा एक ग्राम नकारात्मक अवायुजीवीय extraoral रोगों, मेजबान 5-7 में रोगजनक परिवर्तन पैदा करने में सक्षम एक अत्यधिक अनुकूलित जीवाणु रोगज़नक़ का एक उदाहरण है।

Biofilm पट्टिका की जेबें वायुमंडलीय ऑक्सीजन 8 से संरक्षित कर रहे हैं कि अवायवीय जीवाणु कर सकते हैं बंदरगाह दांतों और मसूड़ों श्लैष्मिक ऊतक के बीच का गठन गहरी दरारों में अर्जित किए गए। ये periodontal जेब ऐसे पी के रूप में विभिन्न अवायवीय रोगाणुओं के लिए एक जगह के रूप में सेवा gingivalis 9 पी। gingivalis फिर से तैयार करने में सक्षम है कि एक कीस्टोन रोगज़नक़ हैperiodontal रोग 10 के विकास और प्रगति को बढ़ावा देने के तरीकों में है कि मौखिक माइक्रोबियल समुदाय हैैं। यह मेजबान प्रोटीन की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के खिलाफ सक्रिय हैं और मेजबान गढ़ 11 की चोरी के लिए तंत्र प्रदान करता है कि विषैलापन कारकों में से एक बड़ी संख्या में पैदा करता है। यह भी इन विट्रो 12-14 और इन विवो 15 में उपकला, एन्दोथेलिअल, fibroblastic, और periodontal बंधन कोशिकाओं पर हमला करने में सक्षम है। प्रभावी ढंग से, पी मेजबान कोशिकाओं हमलावर द्वारा gingivalis मेजबान उन्मुक्ति बच सकते हैं। मेजबान कोशिकाओं के प्रभावी आक्रमण न केवल जीवाणु मेजबान गढ़ से बचने के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी भविष्य फिर से संक्रमण के लिए एक जलाशय के रूप में कार्य करता है और साथ ही मेजबान सेल बदल। मेजबान कोशिकाओं द्वारा आसंजन और जीवाणु के internalization में शामिल आणविक तंत्र के अध्ययन की जरूरत है। कई प्रयोगशालाओं में अनुसंधान पी के internalization के साथ जुड़े आणविक घटनाओं को समझने पर ध्यान केंद्रित किया है मेजबान कोशिकाओं द्वारा gingivalisके रूप में अच्छी तरह से दबाने और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का अपहरण और शत्रुतापूर्ण मेजबान रक्षा तंत्र जीवित रहने के लिए इस्तेमाल किया तंत्र के रूप में।

की पहचान करने और मेजबान कोशिकाओं पर हमला करने में सक्षम हैं कि रोगजनकों निस्र्पक में सक्षम कई assays हैं। यह ऑक्सीजन के अभाव में भारी उपकरणों पर निर्भर है कि अध्ययन करने के लिए मुश्किल है क्योंकि हालांकि, अवायवीय रोगज़नक़ों के साथ इन विट्रो अध्ययन मुख्य रूप शोधकर्ता के लिए कई प्रयोगात्मक समस्या पैदा। यह कोशिकाओं के बढ़ने के लिए ऑक्सीजन की आवश्यकता होती है और इस तरह टिशू कल्चर इन्क्यूबेटरों में अलग से तैयार किया जाना चाहिए कि इस तथ्य से बढ़ रहा है। ऐसी बाधाओं से बचने के लिए एक ही रास्ता है वायुमंडलीय ऑक्सीजन के तहत अध्ययन करने के लिए किया जाएगा, लेकिन लगता है कि anaerobic बैक्टीरिया के विकास असंभव होगा। एक अन्य विधि को संक्रमित और मेजबान सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए गर्मी की मौत हो बैक्टीरिया का इस्तेमाल होगा। हालांकि, मतभेद मेजबान रोगज़नक़ interacti की प्रासंगिकता कम हो जाना है कि गर्मी की मौत हो गई और व्यवहार्य बैक्टीरिया के बीच मौजूद16 पर। यह मेजबान कोशिकाओं के साथ बातचीत के अनछुए अभिव्यक्ति के साथ व्यवहार्य बैक्टीरिया का अध्ययन करने के लिए केंद्रीय है; पी संवर्धन के लिए इसलिए, विधियों एक anaerobic सेटिंग में gingivalis दिया जाता है। इसके अलावा, दो सरल लागत प्रभावी प्रोटोकॉल पी की क्षमता का आकलन करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं gingivalis मानव नाल की शिरा endothelial कोशिकाओं (HUVECs) से भली भाँति किया जाना है। पहले प्रोटोकॉल लोकप्रिय एंटीबायोटिक संरक्षण परख पर आधारित है। परख सीधा है, अवायवीय सूक्ष्मजीवों का उपयोग करते समय विचार दिया जाता है। दूसरा प्रोटोकॉल बातचीत कल्पना करने के लिए एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन स्कैनिंग के उपयोग की आवश्यकता है और पी भाँति gingivalis। प्रत्येक परख की अपनी सीमाएं हैं और anaerobic बैक्टीरिया के invasiveness के अध्ययन के लिए शोधकर्ता एक रूपरेखा प्रदान करने के लिए विचार विमर्श किया जाएगा कि फायदे हैं। वर्तमान पांडुलिपि पी अध्ययन करता है यद्यपि gingivalis और HUVECs, इन प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से कई अन्य अवायवीय जीवाणु के लिए इस्तेमाल किया जा सकतामेजबान कोशिकाओं के अन्य प्रकारों के लिए के रूप में।

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Protocol

निम्नलिखित प्रोटोकॉल अवायवीय प्रजातियों, पी द्वारा आक्रमण संवर्धन और अध्ययन के लिए विधियों का वर्णन होगा gingivalis; हालांकि, इन प्रोटोकॉल अवायवीय रोगाणुओं की एक नंबर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। HUVECs उपयोग किया जाता है, इस प्रोटोकॉल प्रतिरक्षा और गैर प्रतिरक्षा दोनों अन्य कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

1. अवायवीय चैंबर उपयोग और रखरखाव

नोट: पी gingivalis परिवेशी वायु में सामना करना पड़ा ऑक्सीजन का स्तर सामान्य के प्रति संवेदनशील एक अवायुजीवीय है। एक नियंत्रित अवायवीय पर्यावरण पी की खेती के लिए महत्वपूर्ण है gingivalis।

  1. इधर, मिश्रित अवायवीय गैस (80% एन 2, 10% एच 2, 2 से 10% सीओ) एक vinyl अवायवीय कक्ष में (चित्रा 1 ए) के रूप में नामित एक कृत्रिम वातावरण बनाए रखें। अवायवीय चैम्बर के लिए प्रयोगशाला वातावरण से आइटम स्थानांतरित करने के लिए एक airlock (चित्रा 1 बी) का प्रयोग करें। airlock, मैन्युअल TW संचालितमिश्रित अवायवीय गैस शुरू करने से पहले एन 2 गैस के साथ बर्फ मिटाने।
  2. अवांछनीय हाइड्रोजन सल्फाइड के रखरखाव से मुक्त हटाने के लिए एक हाइड्रोजन सल्फाइड हटाने स्तंभ (चित्रा 1 सी) का प्रयोग करें। उत्प्रेरक द्वारा बनाई गई हे एच 2 को दूर करने और प्रदूषण के प्रसार की सुविधा है कि एयरोसौल्ज़ से बचने के लिए कक्ष के भीतर एक dehumidifier रखें।
    नोट: हाइड्रोजन सल्फाइड कई अवायवीय जीवाणु की एक प्राकृतिक चयापचय प्रतिफल है और उसके संचय बैक्टीरिया को विषैला होता है और इलेक्ट्रॉनिक्स को नुकसान में परिणाम और एक उत्प्रेरक का जीवनकाल कम कर सकते हैं।
  3. हाइड्रोजन की उपस्थिति (चित्रा -1) में ऑक्सीजन को हटा जो एक पैलेडियम उत्प्रेरक, के माध्यम से चैम्बर के वायुमंडल प्रसारित करने के लिए एक प्रशंसक बॉक्स का उपयोग करें।
    नोट: एक recirculating वायुमंडलीय (HEPA) फिल्टर 0.22 माइक्रोन या बड़े का एक आकार के साथ हवाई contaminants हटा।
  4. अवायवीय के अंदर स्थित है जो 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संस्कृति अवायवीय जीवाणुचैम्बर। अवायवीय कक्ष के अंदर काम कर रहे हैं जब मानक सड़न रोकनेवाला तकनीक का प्रयोग करें।

आकृति 1
चित्रा 1. अवायवीय विनाइल कक्ष और उसके घटकों। (ए) वायुमंडलीय ऑक्सीजन से पूरी तरह से सील एक विनाइल अवायवीय चैम्बर एक समय में (32 x 78 में) में दो व्यक्तियों के लिए कार्यक्षेत्र प्रदान करता है। यह (वापस मध्य) 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन सेट शामिल हैं। (बी) के एक airlock अवायवीय चैम्बर के लिए प्रयोगशाला वातावरण से वस्तुओं के हस्तांतरण के लिए प्रयोग किया जाता है। चित्र स्वचालित रूप से एक anaerobic वातावरण बनाने की जरूरत निर्वात और शुद्ध प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करने के लिए प्रोग्राम किया जा सकता है कि एक नियंत्रक के माध्यम से संचालित एक स्वचालित airlock है। (सी) एक हाइड्रोजन सल्फाइड हटाने कॉलम अवांछनीय हाइड्रोजन सल्फाइड के रखरखाव से मुक्त उच्च क्षमता हटाने प्रदान करता है। (डी) दो उत्प्रेरक प्रशंसक बक्से रहे हैंहाइड्रोजन की उपस्थिति में, ऑक्सीजन निकालता है जो पैलेडियम उत्प्रेरक, के माध्यम से चैम्बर के वायुमंडल में प्रसारित करने में मदद करने के लिए अवायवीय कक्ष में रखा। अवायवीय चैम्बर निर्माता के निर्देशों के अनुसार की स्थापना की है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Anaerobic बैक्टीरिया की 2. तैयारी

नोट: पी gingivalis aerotolerant है और एरोबिक की स्थिति में संग्रहित किया जा सकता है लेकिन यह 6% 17,18 से उच्च स्तर पर ऑक्सीजन की उपस्थिति में विकास नहीं होगा। एक anaerobic चैम्बर पी के समुचित खेती के लिए आवश्यक है gingivalis और अन्य अवायवीय प्रजातियों (चित्रा 1)। अवायवीय चैम्बर उपयोग पर उचित प्रशिक्षण और शिक्षा microanaerobes 19 के साथ काम करने से पहले आवश्यक है।

  1. अवायवीय कोंडिट सभी तरल मीडिया और प्लेट संतुलित करनाकम से कम 12 घंटे के लिए पूर्व के प्रयोग करने के लिए आयनों अवशिष्ट ऑक्सीजन हटाने के लिए।
  2. पी स्थानांतरण अवायवीय कक्ष में -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से gingivalis, पिघलना करते हैं।
  3. स्ट्रीक पी (टीएसए द्वितीय 5% भेड़ रक्त के साथ) trypticase सोया रक्त अगर प्लेटों पर gingivalis। 4-7 दिनों के लिए एक anaerobic इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर parafilm और दुकान में प्लेटों लपेटें।
  4. पी टीका लगाना 3 मिलीग्राम मस्तिष्क दिल अर्क में gingivalis (भी) शोरबा बाँझ छोरों का उपयोग कर, Hemin और Menadione, अवायवीय और दुराराध्य सूक्ष्मजीवों के अलगाव और संस्कृति के लिए एक समृद्ध गैर चयनात्मक तरल मीडिया के साथ पूरक।
    नोट: लंबी अवधि के भंडारण के लिए, एक -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में ग्लिसरॉल या DMSO (10-20% अंतिम एकाग्रता) और जगह के साथ BHI में तैयार बैक्टीरियल संस्कृतियों का मिश्रण।
  5. पी के एक स्टार्टर संस्कृति तैयार 1:10 कमजोर पड़ने कर रही है और बैक्टीरिया मध्य लॉग चरण तक बढ़ने की अनुमति देकर gingivalis।

नोट: बीएसी की ऑप्टिकल घनत्वterial निलंबन चुना गया है और जांच की जा करने के लिए प्रत्येक तनाव के लिए जीवाणु एकाग्रता निकाला जाता है। पी के लिए gingivalis मध्य लॉग चरण और ~ 7 एक्स 10 8 कोशिकाओं / एमएल 0.7 से मेल खाती के आयुध डिपो 660 पर एक निलंबन। प्रोटोकॉल में वर्णित विकास की स्थिति से ऊपर पी के लिए विशिष्ट हैं gingivalis और अन्य जीवाणु उपभेदों के लिए अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है।

3. Endothelial सेल संस्कृति

नोट: खरीद निर्माता के निर्देशों के अनुसार 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर संवहनी endothelial वृद्धि कारक (वीईजीएफ़) युक्त बेसल मध्यम में प्राथमिक HUVECs और संस्कृति जमा।

  1. 15 मिलीलीटर वीईजीएफ़ मीडिया में 2.5 x 10 5 कोशिकाओं / कुप्पी में टी 75 बोतल में बीज HUVECs।
    नोट: 4.0% trypan नीले रंग के साथ एक कमजोर पड़ने के एक 1: के माध्यम से व्यवहार्यता की जाँच करें। एक दूरबीन प्रकाश माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जब trypan नीले बनाए रखने होगा एक समझौता झिल्ली के साथ कोशिकाओं को बरकरार झिल्ली के साथ स्वस्थ कोशिकाओं को सफेद दिखाई देंगे। देशकोशिकाओं के 80% से अधिक 20 व्यवहार्य हैं कि यह सुनिश्चित करने, 100 कोशिकाओं टी।
  2. कोशिकाओं ~ 80% confluency तक पहुंचने तक पूर्व गर्म ताजा वीईजीएफ़ मीडिया के साथ मीडिया के हर 2 दिन बदलें।
  3. पूर्व गर्म पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें। 2 मिलीलीटर trypsin निष्क्रिय समाधान द्वारा पीछा 5 मिनट के लिए 2 मिलीलीटर trypsin EDTA (0.25%) के साथ incubating द्वारा T75 कुप्पी से कोशिकाओं को आजाद कराने।
  4. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में निलंबित कर दिया HUVECs लीजिए। पीबीएस के साथ टी 75 बोतल से किसी भी अतिरिक्त कोशिकाओं को बाहर से धो लें और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों के लिए स्थानांतरण।
  5. 10 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं।
  6. सतह पर तैरनेवाला निकालें 10 मिलीलीटर पूर्व गर्म वीईजीएफ़ मीडिया में सेल गोली निलंबित।
  7. एक hemocytometer या इसी तरह के सेल गिनती डिवाइस का उपयोग सेल एकाग्रता का निर्धारण।
  8. (50,000 / अच्छी तरह से) coverslips के साथ 6 अच्छी तरह से थाली (400,000 / अच्छी तरह से) या 12 अच्छी तरह से थाली या तो में जोड़ने के लिए सेल निलंबन की राशि की गणना। HUVECs अगले दिन प्रयोग के लिए तैयार हो जाएगा।

4. जीवन रक्षा परख आक्रमण / इंटरेक्शन(चढ़ाना)

नोट: इस परख प्रदर्शन करते हैं, अच्छी तरह / 400,000 कोशिकाओं पर वरीयता प्राप्त endothelial कोशिकाओं के दो 6 अच्छी तरह प्लेटें तैयार करते हैं। एक प्लेट बैक्टीरिया से जुड़ी है और मेजबान कोशिकाओं से भली भाँति आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। अन्य प्लेट इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया के लिए खाते में जाएगा। दो नमूने के triplicates एक प्रयोग में प्रदर्शन किया जा करने के लिए 6 अच्छी तरह से थाली की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल की एक रूपरेखा अस्तित्व परख फ़्लोचार्ट (चित्रा 2) का उल्लेख करने के लिए कृपया।

  1. वे मध्य लॉग विकास (आयुध डिपो 660 0.5-0.7) तक पहुंचने तक (खंड 1 देखें) जैसा कि ऊपर वर्णित अवायवीय जीवाणु तैयार करें।
  2. अपकेंद्रित्र बैक्टीरिया 10 मिनट के लिए 5000 XG पर।
    , सेंट्रीफ्यूज के बाहर अवायवीय कक्ष है, तो एक कसकर मोहरबंद 15 मिलीलीटर ट्यूब में बैक्टीरिया के नमूने ले ऑक्सीजन रिसाव को रोकने के लिए parafilm के साथ टोपी लपेट: ध्यान दें।
  3. Pelleted पी की जगह gingivalis वापस चैम्बर में, सतह पर तैरनेवाला त्यागें। वीईजीएफ़ मुझ में resuspending से पहले फिर से, पीबीएस के साथ गोली बैक्टीरिया धोदीया। सभी जीवाणु उपभेदों मध्य लॉग चरण (~ 7 एक्स 10 8 कोशिकाओं / एमएल) से मेल खाती है, जो 0.7 के आयुध डिपो 660 पर परीक्षण किया जा करने के लिए निलंबन तैयार करें। बैक्टीरिया अब संक्रमण के लिए तैयार हैं।
  4. अवायवीय कक्ष में टिशू कल्चर इनक्यूबेटर से HUVECs युक्त स्थानांतरण 6 अच्छी तरह प्लेटें। मीडिया निकालें और अवायवीय पीबीएस के साथ तीन बार धोएं। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए अवायवीय वीईजीएफ़ मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें और संक्रमण के लिए तापमान संतुलित करने के लिए 20 मिनट के लिए अवायवीय इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटों जगह है।
    नोट: संक्रमण के लिए इस्तेमाल लोगों सुनिश्चित करने के लिए रक्त अगर प्लेटों पर प्लेट बैक्टीरिया समरूप और संक्रमण पर दूषित नहीं हैं।
  5. 100: संक्रमण की बहुलता पर बैक्टीरिया के साथ मेजबान कोशिकाओं (मेजबान MOI बैक्टीरिया): संक्रमित 1।
    नोट: HUVEC सेल नंबर संक्रमण से पहले एक भी अच्छी तरह पर एक trypan बहिष्कार परीक्षण प्रदर्शन से निर्धारित होता है। बैक्टीरिया कोशिका संख्या (0.5 = 5 एक्स 10 8 कोशिकाओं / एमएल के आयुध डिपो, उदाहरण के लिए) ऑप्टिकल घनत्व के माध्यम से निर्धारित किया जाता है। बीacterial एकाग्रता HUVECs एकाग्रता 21 के आधार पर उचित MOI के लिए निकाला जाता है।
  6. अवायवीय इनक्यूबेटर में संक्रमित HUVECs साथ 6 अच्छी तरह प्लेटें प्लेस और बैक्टीरिया 30 मिनट के लिए मेजबान कोशिकाओं के साथ बातचीत करने के लिए अनुमति देते हैं।
  7. BHI में सैपोनिन अवायवीय कक्ष के अंदर और एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से फिल्टर (w / v 1.0%) तैयार करें।
  8. दोनों जुड़ी है और भली भाँति बैक्टीरिया की जीवन रक्षा।
    1. इनक्यूबेटर, महाप्राण मीडिया से प्लेटें निकालें अवायवीय पीबीएस के साथ तीन बार धोने और 2 मिलीलीटर (कदम 4.8 में वर्णित के रूप में तैयार) 1.0% सैपोनिन फ़िल्टर्ड जोड़ें। मेजबान सेल अनुमति देने के लिए 15 मिनट के लिए सेते हैं।
    2. सेल खुरचनी के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक के नीचे परिमार्जन। प्रत्येक अच्छी तरह से सेल मिश्रण लीजिए और एक एक कर: BHI में एक कमजोर पड़ने।
    3. नमूने के धारावाहिक dilutions बनाने के लिए आगे बढ़ें। बैक्टीरियल प्रजातियों और एकाग्रता पर निर्भर करता है, धारावाहिक dilutions समायोजित। 1 के साथ शुरू: 100 या 1: 1,000 dilutions।
    4. रक्त अगर प्लेटों पर वांछित कमजोर पड़ने के 200 μl प्लेट। लपेटें टी37 डिग्री सेल्सियस पर अवायवीय इनक्यूबेटर में parafilm और जगह में वह प्लेटें।
    5. 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के सात दिनों के बाद, प्लेटों को दूर करने और मैन्युअल कालोनियों की गिनती के लिए एक प्रकाश बॉक्स का उपयोग कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFUs) गिनती।
      नोट: CFUs गिनाए हैं। CFUs की बड़ी मात्रा के लिए, छवियों लिया जा सकता है और कंप्यूटर सॉफ्टवेयर CFUs की गणना की सुविधा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  9. भाँति बैक्टीरिया की जीवन रक्षा।
    1. इनक्यूबेटर से प्लेटें निकालें। अवायवीय पीबीएस के साथ तीन बार धोएं और पूरक एंटीबायोटिक (जेंटामाइसिन के 300 माइक्रोग्राम / एमएल और metronidazole के 400 माइक्रोग्राम / एमएल) के साथ 2 मिलीलीटर वीईजीएफ़ मीडिया जोड़ें।
    2. 1 घंटे के लिए सेते हैं। वे वांछित बैक्टीरियल तनाव की हत्या पर 100% प्रभावी हैं इसलिए एंटीबायोटिक दवाओं का परीक्षण और वे मेजबान कोशिकाओं 22,23 घुसना नहीं है कि यह सुनिश्चित करना सुनिश्चित करें।
    3. महाप्राण मीडिया, फ़िल्टर 1.0% सैपोनिन के 2 मिलीलीटर जोड़ें। मेजबान सेल अनुमति देने के लिए 15 मिनट के लिए सेते हैं।
    4. प्रत्येक wel के नीचे परिमार्जनसेल खुरचनी के साथ एल। प्रत्येक अच्छी तरह से सेल मिश्रण लीजिए और 1 बनाना: BHI में एक कमजोर पड़ने।
    5. नमूना (: 100: 1, 1000 1) के धारावाहिक dilutions तैयार करें।
    6. रक्त अगर प्लेटों पर वांछित कमजोर पड़ने के 200 μl प्लेट। अवायवीय इनक्यूबेटर में parafilm और जगह में प्लेटों लपेटें।
    7. 37 डिग्री पर ऊष्मायन के सात दिनों के बाद प्लेटों को हटाने और CFUs गिनती सी।

चित्र 2
चित्रा 2. कोशिकाओं के साथ anaerobic बैक्टीरिया के अस्तित्व के लिए इस्तेमाल एक प्रोटोकॉल की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। एक कुल बैक्टीरियल अस्तित्व और भली भाँति बैक्टीरिया के अस्तित्व के लिए दोनों assays एक ही समय में किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

होस्ट प्रमाणित में बैक्टीरिया की 5. InternalizationLLS (फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी)

नोट: पी gingivalis, 2 'के साथ 7'-Bis- लेबल है (2 carboxyethyl) -5- (और -6) -Carboxyfluorescein, Acetoxymethyl एस्टर (BCECF-AM)। BCECF-AM एक गैर फ्लोरोसेंट झिल्ली पारगम्य डाई है; इंट्रासेल्युलर esterases की कार्रवाई के माध्यम से fluorescein BCECF को अपने रूपांतरण सेल व्यवहार्यता का संकेत कर सकते। पी gingivalis BCECF-AM डाई के साथ लेबल और फिर कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। संक्रमण के बाद, कोशिकाओं तय कर रहे हैं और DAPI और TRITC-phalloidin के साथ लेबल। यूकेरियोटिक सेल नाभिक दाग इस्तेमाल किया DAPI दाग भी है कि नहीं पाचन फोड़ना BCECF-AM कर सकते हैं अलाभकारी बैक्टीरिया की पहचान करने के लिए एक काउंटर उपाय प्रदान करता है, जो बैक्टीरिया कोशिका नाभिक, लेबल होगा। मेजबान कोशिकाओं TRITC-phalloidin, एक लाल actin डाई के साथ डाला जाता है।

  1. आटोक्लेव coverslips। Aseptically / अच्छी तरह से 5 एक्स 10 4 कोशिकाओं पर endothelial कोशिकाओं बोने से पहले 12 अच्छी तरह से प्लेटों के लिए coverslips जोड़ें। (प्रयोग से पहले तैयार दिन)
  2. धारा 1 में वर्णित के रूप में मध्य लॉग चरण के लिए हो गया अवायवीय जीवाणु (= 0.5-0.7 आयुध डिपो 660) तैयार करें।
  3. धो बैक्टीरिया 5000 XG पर centrifuging और 5-7 एक्स 10 8 कोशिकाओं / एमएल पीबीएस में गोली निलंबित द्वारा अवायवीय पीबीएस के साथ 2x।
  4. 2 माइक्रोन की BCECF-AM के अंतिम एकाग्रता के लिए जीवाणु निलंबन (5-7 एक्स 10 8 कोशिकाओं / एमएल) के 2 मिलीलीटर के लिए 0.2 मिमी BCECF-पूर्वाह्न के 20 μl जोड़ें।
  5. अंधेरे में 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  6. अवायवीय कक्ष में टिशू कल्चर इनक्यूबेटर से 18 मिमी (# 1.5 मोटाई) परिपत्र coverslips पर वरीयता प्राप्त endothelial कोशिकाओं के साथ स्थानांतरण प्लेटें। पीबीएस और अवायवीय वीईजीएफ़ मीडिया के साथ आदान-प्रदान से धो लें।
    नोट: HUVECs एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत स्वस्थ हैं की जाँच करें। HUVECs 80% मिला हुआ, आकृति विज्ञान निर्माताओं के लिए बराबर होना चाहिए ~ होना चाहिए।
  7. पर अपकेंद्रित्र लेबल बैक्टीरिया10 मिनट के लिए 5000 XG अवशिष्ट BCECF-AM डाई हटाने के लिए। 2 मिलीलीटर अवायवीय वीईजीएफ़ मीडिया में निलंबित।
  8. 1 (बैक्टीरिया: मेजबान) 100 के MOI में लेबल बैक्टीरिया के साथ मेजबान कोशिकाओं को संक्रमित।
  9. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर अवायवीय कक्ष में सेते हैं।
  10. और पीबीएस तीन बार के साथ संक्रमण धोने कोशिकाओं के बाद 10 मिनट के लिए हौसले से तैयार 4.0% paraformaldehyde में तय कर लो।
    नोट: कोशिकाओं फिक्सिंग के बाद, प्रयोग अवायवीय कक्ष के बाहर आयोजित किया जा सकता है।
  11. धो पीबीएस तीन बार के साथ coverslips।
  12. 10 मिनट के लिए 0.2% ट्राइटन X-100 के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
  13. धो पीबीएस तीन बार के साथ coverslips।
  14. 45 मिनट के लिए coverslips के लिए TRITC phalloidin (50 माइक्रोग्राम / एमएल) के 50 μl जोड़ें।
  15. धो DAPI युक्त मुलायम सेट बढ़ते मध्यम के साथ एक स्लाइड पर 12 अच्छी तरह से थाली और जगह से निकालें, तीन बार coverslips। नेल पॉलिश के साथ पक्षों सील।
    नोट: स्लाइड्स अंधेरे में एक दो महीने के लिए भंडारित किया जा सकता है। तस्वीर विरंजन रोकने के लिए प्रकाश जोखिम से बचें।
  16. देखें स्लाइडएक confocal खुर्दबीन का उपयोग।
    1. इधर, (उल्टे) एक AxioObserver चारों ओर विन्यस्त एक 34 चैनल वर्णक्रम प्रणाली (32-चैनल सरणी डिटेक्टर और दो पक्ष पीएमटी डिटेक्टरों, प्लस एक प्रेषित प्रकाश डिटेक्टर) एक मोटर चालित XY मंच के साथ खड़े का उपयोग करें। नीले डायोड (405 एनएम), बहु-लाइन आर्गन (458, 488, 514 एनएम), हरी डायोड (561 एनएम), लाल HeNe (633 एनएम) और एक 440 एनएम स्पंदित लेजर: सिस्टम पाँच लेज़रों है। (झल्लाहट flim के लिए) 2 संकर GaAsP डिटेक्टरों के साथ एक प्रतिदीप्ति आजीवन इमेजिंग प्रणाली से लैस।
    2. 340-380 एनएम और 540-560 एनएम, और क्रमश: 435-485 एनएम और 570-590 एनएम के एक उत्सर्जन फिल्टर की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ एक दोहरे बैंड फिल्टर का उपयोग कर एक चैनल में DAPI और TRITC से प्रतिदीप्ति का पता लगाने। 440-500 एनएम के तरंग दैर्ध्य उत्तेजना और 510-590 एनएम के एक उत्सर्जन फिल्टर के साथ एक फिल्टर का उपयोग BCECF-बजे से प्रतिदीप्ति का पता लगाने।
      नोट: हर बैक्टीरियल तनाव पर किया जाना चाहिए BCECF-AM के लिए नियंत्रण व्यवहार्य बैक्टीरिया की उचित लेबलिंग सुनिश्चित करने के लिए अध्ययन किया जा रहा है। सबसे पहले कि nonviab मान्यLe बैक्टीरिया DAPI पॉजिटिव और BCECF नकारात्मक हैं। दूसरा, जीवित बैक्टीरिया fluorescein BCECF में BCECF-AM metabolize कर सकते हैं कि यह सुनिश्चित करें। बैक्टीरिया या BCECF-AM डाई के चर सांद्रता इष्टतम लेबलिंग के लिए परीक्षण किया जाना पड़ सकता है।

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Representative Results

ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल पी के बीच मेजबान रोगज़नक़ बातचीत के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया gingivalis और endothelial कोशिकाओं पी। gingivalis W83 और एक पी PG0228 का विलोपन ले जाने gingivalis V3150 अध्ययन में इस्तेमाल किया गया। PG0228 अंततः पी की बातचीत को प्रभावित कर सकता है, जो शाही सेना और प्रोटीन के स्तर को बदल सकता है कि एक प्रोटीन, सांकेतिक शब्दों की भविष्यवाणी की है मेजबान कोशिकाओं के साथ gingivalis। पी पर PG0228 के प्रभाव की जांच करने के लिए gingivalis के मेजबान कोशिकाओं के साथ बातचीत करने की क्षमता, HUVECs के साथ बातचीत करने के लिए माता पिता और उत्परिवर्ती उपभेदों की क्षमता की तुलना में था। अस्तित्व प्रोटोकॉल (चित्रा 2) इस अध्ययन के लिए लागू किया गया था। दोनों उपभेदों इस प्रकार समान विकास घटता है और संक्रमण के लिए पूर्व सामना करना पड़ा था सेल नंबर को सामान्य बनाने के साथ कोई महत्वपूर्ण समस्या नहीं थी चरण 2 में उल्लिखित के रूप में इस प्रकार, दोनों उपभेदों लघुगणक चरण के लिए बड़े हो रहे थे। ऊष्मायन के सात दिनों के बाद, CFUs रक्त एक पर मनाया गयागर प्लेट (चित्रा 3)। कई dilutions 01:10 (चित्रा 3), 1: 100 (चित्रा 3 सी) और 1: 1000 (चित्रा 3 बी) रक्त अगर प्लेटों पर चढ़ाया गया। चित्रा 3 में देखा कालोनियों की संख्या का आकलन करने के लिए बहुत अधिक थे; कालोनियों [TMTC] "गिनती करने के लिए भी कई 'के रूप में एक दूसरे को और नामित से अप्रत्यक्ष थे। चित्रा 3 बी में कमजोर पड़ने के भी कुछ कालोनियों प्राप्त कर रहे हैं के रूप में बहुत कम था। 1 के dilutions: कालोनियों प्रत्यक्ष कर रहे हैं और कालोनियों की संख्या गिनने के लिए प्रबंधनीय थे के रूप में 100 के रूप में चित्रा -3 सी में दिखाया गया है, वांछनीय था। इसी तरह के परिणाम उत्परिवर्ती तनाव V3150 (चित्रा 3 डी) के लिए पाए गए। इस प्रकार CFUs 1 के कमजोर पड़ने कारक के साथ प्लेटों से प्रगणित गया: 100।

CFUs की संख्या और कमजोर पड़ने कारक का उपयोग करना, प्रत्येक तनाव के लिए बरामद व्यवहार्य बैक्टीरिया की अनुमानित संख्या की गणना की गई। Viabl की संख्या डिवाइडिंगआक्रमण दक्षता के रूप में परिभाषित अनुपात में बैक्टीरिया परिणामों की प्रारंभिक संख्या से बरामद ई बैक्टीरिया। दोनों प्रकारों के आक्रमण क्षमता की तुलना में, जंगली प्रकार W83 PG0228 कमी उपभेदों, whilst (चित्रा 4) अस्तित्व में एक महत्वपूर्ण कमी देखी गई, उच्च दक्षता के साथ HUVECs भीतर बच गई।

आगे दोष अस्तित्व के बजाय बैक्टीरिया की कम internalization की वजह से था कि यह पुष्टि करने के लिए, माइक्रोस्कोपी विश्लेषण किया गया था। HUVECs पी से संक्रमित gingivalis एक माइक्रोस्कोप (चित्रा 5) के तहत देखा गया। इस उदाहरण में, एक HUVEC प्रस्तुत किया है। भाँति बैक्टीरिया की संख्या निर्धारित करने के लिए कई छवियों भाँति पी के स्थानिक अस्थायी पहचान के लिए अनुमति देता है एक Z ढेर प्राप्त करने के लिए विभिन्न फोकल दूरी पर ले जाया गया gingivalis। इसके अलावा, कम से कम 40 कोशिकाओं / प्रयोग (प्रत्येक जैविक को दोहराने के लिए) का विश्लेषण किया और प्रत्येक अनुसूचित जनजाति के लिए प्रगणित भाँति जीवाणुओं की संख्या जाना चाहिएबारिश। एक खुर्दबीन के नीचे देखा जब भाँति जीवाणुओं की संख्या प्रत्येक तनाव के लिए एक ही है तो दोनों उपभेदों समान रूप से HUVECs आक्रमण; हालांकि, उत्परिवर्ती V3150 एंटीबायोटिक संरक्षण परख के रूप में देखा मेजबान कोशिका के भीतर, जबकि जीवित रहने की क्षमता कम हो गया है।

चित्र तीन
एक जीवाणु अस्तित्व परख से 3. परिणाम चित्रा। प्रोटोकॉल इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया के अस्तित्व के लिए जंगली प्रकार पी की क्षमता का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था gingivalis W83 और PG0228 में एक उत्परिवर्ती V3150 कमी आक्रमण और HUVECs भीतर जीवित रहने के लिए। भाँति व्यवहार्य बैक्टीरिया HUVECs- पी के ऊष्मायन के बाद CFUs के दृश्य के द्वारा निर्धारित कर रहे हैं अवायवीय स्थितियों के तहत सात दिनों के लिए रक्त अगर प्लेटों पर gingivalis मिश्रण। रक्त प्लेटों विपरीत बढ़ जाती है और CFUs की आसान गिनती के लिए अनुमति देता है कि प्रकाश बॉक्स पर रखा जाता है। विभिन्न dilutions पूर्व थेamined। HUVECs पी से संक्रमित gingivalis W83 कमजोर पड़ने 1:10 (ए), कमजोर पड़ने 1: 1000 (बी), और कमजोर पड़ने 1: 100 (सी)। HUVECs पी से संक्रमित gingivalis V3150 कमजोर पड़ने 1:। 100 (डी) यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
माता पिता का और उत्परिवर्ती जीवाणु उपभेदों के बीच। HUVECs एक जीवित रहने की दरों की चित्रा 4. तुलना जंगली प्रकार पी से संक्रमित थे gingivalis W83 और PG0228 में कमी एक उत्परिवर्ती V3150। चित्रा 2 में उल्लिखित के रूप में अस्तित्व के लिए प्रोटोकॉल का पालन किया गया था। प्रयोग triplicates में तीन बार प्रदर्शन किया गया था और मानक विचलन ± मतलब प्रस्तुत कर रहे हैं। आक्रमण दक्षता / प्रारंभिक बैक्टीरिया बच का प्रतिनिधित्व करता है।जंगली प्रकार W83 तनाव (पी <0.05) की तुलना में जब * उत्परिवर्ती तनाव अस्तित्व सांख्यिकीय महत्वपूर्ण कमी आई है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
पी के एक सूक्ष्म विश्लेषण की चित्रा 5. उदाहरण HUVECs। HUVECs से भली भाँति gingivalis BCECF-AM से संक्रमित थे पी लेबल 1 (पी gingivalis: HUVEC) 100 के MOI पर 30 मिनट के लिए gingivalis। प्रकोष्ठों paraformaldehyde के साथ तय की और TRITC-phalloidin और DAPI साथ लेबल रहे थे। छवि के नाभिक (ए) और क्रमशः, नीले और लाल दाग एफ actin (बी) के साथ एक एकल HUVEC से पता चलता है। तीर पी इंगित करता है gingivalis हरे (सी) लेबल। किसी मर्ज किए गए भारतीय सैन्य अकादमीजीई पी को दिखाने के लिए उत्पादन किया जाता है HUVECs (डी) में gingivalis आक्रमण। छवियाँ confocal खुर्दबीन स्कैनिंग का उपयोग कर उत्पादन किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

उपर्युक्त सभी तरीकों कोशिकाओं के साथ anaerobic बैक्टीरिया की बातचीत का आकलन करने के लिए विशिष्ट assays के डिजाइन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, सफलतापूर्वक प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए कई विचार कर रहे हैं। सबसे पहले एक अध्ययन में इस्तेमाल किया जा माइक्रोबियल उपभेदों हैं।

यह वे इसी तरह के विकास के चरण में हैं और आक्रमण दक्षता 13 प्रभावित कर सकते हैं ऊपर में कोई मतभेद के रूप में इसी तरह के सेल सांद्रता पाने कि अस्तित्व परख दोनों के साथ दो नस्लों की तुलना में के रूप में अच्छी तरह से माइक्रोस्कोपी विश्लेषण से महत्वपूर्ण है। विकास घटता दो जीवाणु उपभेदों के बीच मतभेद है, जब समायोजन अंततः लगातार सांद्रता 21 बांटने के समान विकास पैटर्न को प्राप्त करने के प्रयास किए जाने चाहिए। इसके अलावा, बैक्टीरिया कोशिका एकत्रीकरण से बचने के लिए समान रूप से फैलाया जाना चाहिए। इसके अलावा, यह प्रभावी रूप से बाह्य बैक्टीरिया को खत्म करने कि एंटीबायोटिक दवाओं का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है। चुना एंटीबायोटिक तो मेजबान कोशिकाओं, पर हानिकारक प्रभाव पड़ता है तोएक विकल्प एंटीबायोटिक या अपघट्य एंजाइमों 24,25 इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, तनाव विविधता पर विचार किया जाना चाहिए; एक प्रजाति मेजबान कोशिकाओं पर आक्रमण करने के लिए पहचाना जा सकता है, हालांकि, वहाँ एक और 26 के लिए एक तनाव से pathogenicity में प्रमुख अंतर हो सकता है और इस तरह एक पायलट अध्ययन प्रत्येक तनाव की जांच की जा करने के लिए किया जाना चाहिए।

एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम प्रोटोकॉल जब डिजाइनिंग (मेजबान कोशिका को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल बैक्टीरिया की संख्या है, जो संक्रमण की बहुलता [MOI]) एक इष्टतम ऊष्मायन समय और बैक्टीरियल inoculum स्थापित करना है। कम ऊष्मायन अवधि के लंबे समय के अंक बैक्टीरियल अस्तित्व के साथ ही इंट्रासेल्युलर प्रतिकृति 27 निर्धारित करने की जरूरत हो सकती है, जबकि बैक्टीरिया की क्षमता मेजबान कोशिकाओं से भली भाँति किया जाना है का आकलन करेंगे। बैक्टीरिया के intracellular अस्तित्व MOI से प्रभावित हो सकता है इस्तेमाल किया जा रहा है, यह सेल को कोई नुकसान कोशिका मृत्यु या permeabiliz के लिए नेतृत्व करेंगे कि वजह से था कि यह सुनिश्चित करने के लिए कई MOIs परीक्षण करने के लिए सबसे अच्छा हैएड इंट्रासेल्युलर जीवाणुओं की एंटीबायोटिक हत्या के उपयोग के साथ झिल्ली। कहा जा रहा विशिष्ट सवाल का जवाब देने की जरूरत MOI और ऊष्मायन बार स्थापित करने के बाद, प्रयोग प्रोटोकॉल के अनुसार चलाया जाता है; हालांकि, यूकेरियोटिक सेल बैक्टीरिया सेल मिश्रण के कई धारावाहिक dilutions बनाया जाना चाहिए। इष्टतम कमजोर पड़ने कारक मनाया CFUs के आधार पर निर्धारित किया जाएगा। 50-200 CFUs साथ प्लेटों में परिणाम है कि कमजोर पड़ने कारकों अस्तित्व दक्षता का आकलन करने के लिए उपयोगी हैं। CFU गिनती बहुत अधिक है, कालोनियों एक दूसरे से अप्रत्यक्ष कर रहे हैं और यह स्वयं एक कॉलोनी गिनती करना मुश्किल हो जाता है। CFU गिनती बहुत कम है, तो छोटे विचलन प्रकारों के बीच गुना परिवर्तन की जांच की जा रही अतिरंजना के साथ ही प्रतिकृति के बीच बड़े मानक विचलन का उत्पादन।

एक तीसरा महत्वपूर्ण बिंदु को स्वस्थ और बैक्टीरिया के साथ बातचीत करने के लिए तैयार कर रहे हैं कि मेजबान कोशिकाओं को तैयार है। ऊपर प्रोटोकॉल में मेजबान कोशिकाओं को अलग-अलग मानक सड़न रोकनेवाला टीईसी का उपयोग कर सुसंस्कृत हैंhniques। ऊतक संवर्धन में एंटीबायोटिक दवाओं और एंटीफंगल का उपयोग विशेष रूप से शुरुआत सेल संस्कृति जीव के लिए उचित हो सकता है। हालांकि, अस्तित्व परख प्रदर्शन से पहले, मेजबान कोशिकाओं अवायवीय कक्ष में कोशिकाओं को स्थानांतरित करने से पहले कम से कम 12 घंटे के लिए एंटीबायोटिक मुक्त मीडिया में संवर्धित किया जाना चाहिए। संक्रमण के दौरान अवायवीय जीवाणु पर टकराना नहीं के रूप में एक बार कक्ष के अंदर, मीडिया अवायवीय एंटीबायोटिक मुक्त मीडिया के साथ विमर्श किया जाना चाहिए। समस्याओं प्लास्टिक टिशू कल्चर प्लेटों के लिए मेजबान कोशिकाओं के लगाव के साथ मौजूद हैं या coverslips तो यह इस तरह पाली एल लाइसिन या जिलेटिन के रूप में एक चिपकने वाली कोटिंग लागू करने के लिए उचित हो सकता है। इसके अलावा, एक स्वाभाविक रूप से उत्पादन तहखाने झिल्ली की तरह बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) के साथ कोटिंग टिशू कल्चर व्यंजन के लिए तकनीक की स्थिति 28,29 तरह विवो में अधिक के साथ अन्वेषक प्रदान कर सकता है। मेजबान कोशिकाओं lysing बैक्टीरियल व्यवहार्यता फेरबदल के बिना खोलने मेजबान कोशिकाओं में सक्षम एक संतुलित डिटर्जेंट की आवश्यकता है। सैपोनिन कश्मीर नहीं होगाबीमार बैक्टीरिया, यह कुछ प्रजातियों के विकास को बाधित कर सकता है। पी पर सैपोनिन के हमारे अध्ययन से पहले प्रभाव gingivalis उनके विकास / अस्तित्व पर कोई प्रभाव नहीं है सत्यापित किया गया था मेजबान रोगज़नक़ विश्लेषण के लिए प्रयोग की जाने वाली उपभेदों। बैक्टीरिया सैपोनिन सहित डिटर्जेंट, के लिए अत्यधिक संवेदनशील होते हैं, तो दोहराया फ्रीज पिघलना चक्र या आसुत जल बैक्टीरिया को थोड़ा नुकसान के साथ मेजबान कोशिकाओं lyse करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

चौथा महत्वपूर्ण बिंदु माइक्रोस्कोपी प्रयोगों प्रदर्शन जब विचार लिया जाना भी शामिल है। सबसे पहले माइक्रोस्कोपी प्रोटोकॉल के लिए प्रयोग की जाने वाली बैक्टीरिया लेबल करने के लिए एक फ्लोरोसेंट डाई का इस्तेमाल होता है। बैक्टीरिया के लिए कई मौजूदा लेबलिंग तरीकों एक प्राथमिक एंटीबॉडी या इस तरह के जहरीले प्रभाव है और इस प्रकार उच्च पृष्ठभूमि देने के परिवेश में डाई की लीचिंग के रूप में महत्वपूर्ण सीमाओं के साथ प्रथागत बैक्टीरियल रंगों की आवश्यकता होती है। BCECF-AM सामान्यतः prokaryote और यूकेरियोट्स 30-32 दोनों में intracellular पीएच की एक फ्लोरोसेंट सूचक के रूप में इस्तेमाल एक झिल्ली पारगम्य डाई है। यह पिछले अध्ययनों 33-35 में अवायवीय जीवाणु की एक श्रृंखला की लेबलिंग में प्रभावी होना पाया गया। BCECF-AM केवल एस्टरीफिकेशन में सक्षम व्यवहार्य बैक्टीरिया लेबल होगा। रूपांतरण अपने माता पिता के परिसर की तुलना में कहीं अधिक धीरे कोशिकाओं के बाहर लीक कि एक फ्लोरोसेंट रूप में intracellular esterases परिणामों से BCECF करने के लिए। कई फ्लोरोसेंट रंगों और 36 में इस्तेमाल किया जा सकता है कि धुंधला तकनीक के होते हैं; हालांकि, इस प्रोटोकॉल लगभग किसी भी सूक्ष्मजीव साथ इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक साधारण फिक्सिंग / धुंधला तकनीक की रूपरेखा। इसके अलावा, अन्य रंगों (TRITC-phalloidin, और DAPI) और अधिक स्पष्ट रूप से मेजबान कोशिकाओं के साथ बातचीत कि केवल बैक्टीरिया के लिए कोशिकाओं और खाते की सीमाओं को अलग करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।

फ्लोरोसेंट रंगों तस्वीर विरंजन के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं और फ्लोरोसेंट संकेत 37 के कमजोर रोक सकता है कि कई उपलब्ध वाणिज्यिक antifades और बढ़ते माध्यमों देखते हैं। मीडिया एक बढ़ते कड़ी मेहनत से सेट के बीच चुनाव भी कर रहे हैंएन डी लोगों मुलायम निर्धारित किया है। कड़ी मेहनत से सेट लोगों महत्वपूर्ण आग रोक सूचकांक में परिवर्तन के साथ ही सिकुड़न और ऊतकों को नुकसान 38 में हो सकता है, जबकि मुलायम की स्थापना मीडिया coverslip सुरक्षित करने के लिए, इस तरह की नेल पॉलिश के रूप सीलंट की आवश्यकता होती है। तो संक्रमित कोशिकाओं के बीच मनाया विविधताओं के कारण; अलग-अलग हो सकता है कोशिकाओं और इस प्रकार कई कोशिकाओं के बीच भाँति जीवाणुओं की संख्या विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। हमारे अध्ययन में, कम से कम चालीस कोशिकाओं प्रयोग 33,34 प्रति प्रगणित बैक्टीरिया का आकलन किया और भली भाँति रहे हैं। अंत में, स्पष्ट रूप से एकल कक्षों कल्पना करने के लिए, संक्रमण के लिए इस्तेमाल कोशिकाओं संगम की वृद्धि हुई नहीं किया जाना चाहिए। उपकला कोशिकाओं के साथ Prevotella इंटरमीडिया संक्रमण की सूक्ष्म परीक्षाओं मेजबान कोशिका झिल्ली के विशिष्ट क्षेत्रों के लिए वरीयता दिखाया है, और बैक्टीरिया उपकला कोशिकाओं को एक दूसरे के साथ संपर्क में थे और कोई lamellipodia 39 था, जहां साइटों का पालन नहीं होता।

एलमाइक्रोस्कोपी के नकली इसकी कम throughput हो सकता है। इस प्रकार, बैक्टीरिया की आक्रामक संपत्ति एक फ्लो पर बड़े पैमाने पर मात्रात्मक डेटा के लिए भी 40 से इस्तेमाल किया जा सकता है। इस विधि fluorescently लेबल बैक्टीरिया का उपयोग करें (माइक्रोस्कोपी के लिए इस्तेमाल किया जा जीवाणु के लिए के रूप में वर्णित है कि पूरा किया जा सकता है) शामिल है और कुछ शोधकर्ताओं के लिए आकर्षक हो सकता है कि एक समय में कई नमूनों के अध्ययन के लिए अनुमति देता है।

दो प्रोटोकॉल में संशोधन से बैक्टीरिया के मेजबान सेल तेज में शामिल रास्ते की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। सफल जीवाणु आक्रमण पांच चरणों में होती है: (1) लगाव (2) प्रवेश / internalization (3) की तस्करी (4) दृढ़ता और (5) से बाहर निकलें 41। इस प्रकार प्रविष्टि / internalization के दौरान, जीवाणु मेजबान पर खुद को रेखांकित और संकेत पारगमन को संशोधित करने के माध्यम से internalization के लिए मेजबान सेल usurps। चयनात्मक चयापचय अवरोधकों सफल आक्रमण करने के लिए अग्रणी संकेत में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए कोशिकाओं की मेजबानी करने के लिए जोड़ा जा सकता है। के लिएactin polymerization रोकता है जो उदाहरण latrunculin, पी के internalization कैसे प्रभावित करता है cytoskeleton पुनर्व्यवस्था अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता gingivalis। सेल विशिष्ट रिसेप्टर्स या कुछ जीन नीचे दस्तक करने में सक्षम siRNA लक्ष्य है कि एंटीबॉडी भी बैक्टीरियल internalization में शामिल की घटनाओं का संकेत मेजबान सेल का एक बेहतर समझ के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। सभी चयापचय अवरोधकों एक को छोड़कर मेजबान कोशिकाओं पर न्यूनतम समग्र प्रभाव होना चाहिए, जांच की जा रही है, यह बैक्टीरिया पर एक जहरीले प्रभाव नहीं है अवरोध करनेवाला उपचार सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है।

भविष्य के अध्ययन संभवतः, इन तकनीकों में से कुछ सही हालत तरह विवो में एक और अधिक प्राप्त करने के लिए लग रही होगी। वर्तमान लेख में, या तो बैक्टीरिया या मेजबान कोशिकाओं कठोर वातावरण के संपर्क में हैं। प्रयोग के जीव, सेल लाइन, और लक्ष्य के आधार पर कुछ जांचकर्ताओं सीओ 2 इनक्यूबेटर में ऊपर प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए पसंद कर सकते हैं। हालांकि, periodontal घावबैक्टीरिया मेजबान के साथ बातचीत में जो एक anaerobic microenvironment दर्शाते हैं। सेलुलर प्रतिक्रिया में बदलाव अवायवीय स्थितियों बनाम एरोबिक तहत मौखिक बैक्टीरिया के साथ चुनौती देने के लिए जांच की है कि एक अध्ययन की रिपोर्ट है कि जैसे कम ऑक्सीजन तनाव (2% ऑक्सीजन) बैक्टीरिया, Tannerella फोरसाइथिया, पी के तहत gingivalis, और पी इंटरमीडिया एरोबिक शर्तों 42 की तुलना में आईएल -8 और TNFα के उच्च स्तर हासिल। अवायवीय स्थितियों में जीवित रहने के लिए कोशिकाओं की क्षमता भी मानव mesenchymal स्टेम सेल, मानव दंत कूप स्टेम सेल, मानव मसूड़ों फ़ाइब्रोब्लास्ट, मसूड़ों कार्सिनोमा कोशिकाओं, और मानव मौखिक उपकला कोशिकाओं 43,44,45 की क्षमता की जांच की है कि अध्ययन से इसकी पुष्टि की गई थी। WST -1 सेल प्रसार परख का उपयोग हमारे अध्ययन HUVECs ऑक्सीजन में कमी की शर्तों के तहत अप करने के लिए 48 घंटे के लिए जीवित रह सकते हैं कि पता चला है। निर्णय पी क्योंकि अवायवीय कक्ष में कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए बनाया गया था gingivalis पर के प्रति संवेदनशील हैmospheric ऑक्सीजन का स्तर, HUVECs अवायवीय स्थितियों के तहत समय की विस्तारित अवधि तक जीवित रह सकते हैं। भविष्य के अनुसंधान अन्य 46 पर एक (एक धमनी की तरह) monolayer और अवायवीय स्थितियों में से एक सतह के लिए ऑक्सीजन प्रदान करते हैं कि सूक्ष्म fluidic सेल संस्कृति उपकरणों के कार्यान्वयन की जांच करेंगे। इस तरह की स्थिति बैक्टीरिया या संक्रमण पर मेजबान या तो के लिए बलिदान नहीं किया जाएगा। सारांश में, अवायवीय जीवाणु के लिए मेजबान रोगज़नक़ बातचीत की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि कुछ सरल प्रोटोकॉल वर्णित हैं। इन प्रोटोकॉल भी जीवाणु आक्रमण 40, साथ ही बैक्टीरिया 47 पर आक्रामक संपत्ति प्रदान करने के लिए एक प्रोटीन व्यक्त किराए की गैर-आक्रामक बैक्टीरिया को बढ़ावा देने के जीवाणु internalins, प्रोटीन के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vinyl Anaerobic Chamber-Type B Coy Laboratory Products Model 2000 incubator 
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood BBL 221261
Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool LifeLine Technology FC-0044
VascuLife VEGF Medium Complete Kit LifeLine Technology LL-0003
TrypKit LifeLine LL-0013
Saponin Riedel-de Haen 16109
Gentamicin Sulfate Salt Sigma-Aldrich G-1264
Metronidazole Sigma-Aldrich M-3761
BCECF-AM LifeTechnologies B1150
TRITC Phalloidin  Sigma-Aldrich P1951
18 mm Circular Coverslips Electron Microscopy Sciences 72222-01
VectaShield Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200

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References

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संक्रमण अंक 106 anaerobic बैक्टीरिया, आक्रमण अस्तित्व मेजबान रोगज़नक़ बातचीत इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया लगाव
मेजबान कोशिकाओं के साथ anaerobic बैक्टीरिया की बातचीत के मूल्यांकन के लिए एक मॉडल जीव के रूप <em>Porphyromonas gingivalis</em>
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Wunsch, C. M., Lewis, J. P.… More

Wunsch, C. M., Lewis, J. P. Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells. J. Vis. Exp. (106), e53408, doi:10.3791/53408 (2015).

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