Porphyromonas gingivalis als modelorganisme voor het beoordelen van Interactie van anaërobe bacteriën met gastheercellen

Abstract

Anaërobe bacteriën ver overtreffen aeroben in vele menselijke niches zoals de darm, mond en vagina. Bovendien, anaërobe infecties komen vaak voor en vaak van inheemse afkomst. Het vermogen van enkele anaerobe pathogenen humane cellen binnen te dringen geeft hen aanpassingsmaatregelen aangeboren immuniteit ontsnappen alsook gastheercel gedrag moduleren. Echter, zodat de anaërobe bacteriën staan ​​tijdens experimenteel onderzoek van de gebeurtenissen kan problemen opleveren. Porphyromonas gingivalis, een Gram-negatieve anaërobe, kan binnenvallen een verscheidenheid van eukaryote niet-fagocytische cellen. Dit artikel schetst hoe succesvol de cultuur en beoordelen van het vermogen van P. gingivalis aan humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC) binnendringen. Twee protocollen werden ontwikkeld: een voor bacteriën die met succes kunnen binnendringen en overleven in de gastheer, en andere bacteriën interactie met gastheercellen visualiseren meten. Deze technieken vereisen het gebruik van een AnaeRobic kamer leveren P. gingivalis met een anaërobe omgeving voor optimale groei.

Het eerste protocol is gebaseerd op het antibioticum bescherming assay, die grotendeels gebruikt om de invasie van gastheercellen door bacteriën te bestuderen. Echter, het antibioticum bescherming assay beperkt; alleen intracellulaire bacteriën die gekweekt zijn na behandeling met antibiotica en gastheer cellysis worden gemeten. Om alle bacteriën interactie met gastheercellen, zowel levende en dode beoordelen, ontwikkelden we een protocol dat fluorescentie microscopie gebruikt om gastheer-pathogeen interactie te onderzoeken. Bacteriën worden fluorescent gelabeld met 2 ', 7'-bis- (2-carboxyethyl) -5- (en-6) -carboxyfluorescein acetoxymethylester (BCECF-AM) en gebruikt om eukaryotische cellen te infecteren onder anaërobe omstandigheden. Na bevestiging met paraformaldehyde en permeabilisatie met 0,2% Triton X-100, worden gastheercellen gelabeld met TRITC phalloidin en DAPI naar de cel cytoskelet en de kern respectievelijk labelen. Meerdere images genomen op verschillende brandpunten (Z-stack) worden verkregen voor tijdelijke ruimtelijke visualisatie van bacteriën. Methoden in deze studie kan worden toegepast op elke landbouwgrond anaerobe en eukaryotische celtype.

Introduction

Anaërobe bacteriën koloniseren vrijwel alle oppervlakken van het menselijk lichaam. Hoewel overwegend in de flora van de darm en urogenitalis waar zuurstof concentraties laag bestaan ​​ze ook bij hoge niveaus op de huid, mond, neus en keel ^1. Anaërobe bacteriën zijn een veelvoorkomende oorzaak van endogene infecties en worden vaak geïsoleerd van zieke sites. Vanwege hun veeleisende aard, anaërobe moeilijk te isoleren en cultuur. Studies met anaërobe bacteriën moet gebeuren onder strikte voorwaarden. Moderne anaërobe kweektechnieken kunnen de onderzoekers om de anaërobe instellingen die nodig zijn om veel anaërobe laboratoriumstammen of klinische isolaten ^2,3 studeren na te bootsen.

Pathogene anaërobe bacteriën hebben een dynamische relatie en co-evolutie met de gastheer cellen waarin zij wonen ontwikkeld. De meeste anaëroben zijn gevoelig voor doding door de gastheer immuunreactie voordat infectilende niveaus. Echter, sommige pathogene bacteriën mechanismen ontsnappen of ontwrichting van de gastheer immuunreactie ontwikkeld. Zij doen dit doel via mechanismen zoals ontwijking van immuunherkenning, neutralisatie van immuunmediatoren, verandering van celgemedieerde immuniteit, invasie van gastheercellen en wijziging van immune signalering ^4. Porphyromonas gingivalis, een Gram-negatieve anaerobe betrokken bij zowel orale als extraorale ziekten, is een voorbeeld van een zeer geschikt bacterieel pathogeen kunnen veroorzaken pathogene veranderingen in de ontvangende ^5-7.

Zakken van biofilm plaque ontstaan ​​uit diepe spleten gevormd tussen de tanden en tandvlees mucosale weefsel anaërobe bacteriën die worden beschermd tegen zuurstof ⁸ haven. Deze periodontale pockets dienen als niche voor diverse anaerobe pathogenen, zoals P. gingivalis ^9. P. gingivalis is een hoeksteen pathogeen dat in staat verbouwening de mondelinge microbiële gemeenschap op manieren die de ontwikkeling en progressie van parodontale aandoeningen ¹⁰ te bevorderen. Het produceert een groot aantal virulentiefactoren die actief zijn tegen een breed spectrum van gastheer- en voorziet in mechanismen voor ontwijking van afweer ^11. Het kan ook invasie epitheel, endotheel, fibroblasten, en periodontale ligament cellen in vitro en in vivo ^{14/12 15.} Door het effectief invasie van gastheercellen, P. gingivalis kunnen gastheer immuniteit te ontsnappen. Effectieve invasie van gastheercellen mogelijk maakt niet alleen de bacterie afweer van de gastheer ontsnappen, maar ook dient als reservoir voor toekomstige herinfectie en verandert de gastheercel. Studies van de moleculaire mechanismen betrokken bij adhesie en internalisatie van de bacterie door gastheercellen nodig. Onderzoek in verschillende laboratoria is gericht op het begrijpen van de moleculaire geassocieerd met internalisatie P. gingivalis door de gastheercellenalsook de mechanismen te onderdrukken en kapen de immuunrespons en overleven de vijandige gastheer afweermechanismen.

Er zijn vele assays kan identificeren en karakteriseren van pathogenen die in staat binnendringende gastheercellen. In vitro studies met anaerobe pathogenen vormen vele experimentele problemen voor de onderzoeker vooral omdat het moeilijk studies die afhankelijk volumineuze instrumenten in afwezigheid van zuurstof uitgevoerd. Dit wordt verergerd door het feit dat eukaryote cellen zuurstof nodig om te groeien en moet dus apart worden bereid in weefselkweek incubator. Een manier om dergelijke obstakels te vermijden is om het onderzoek te verrichten onder atmosferische zuurstof, maar dat de groei van anaerobe bacteriën onmogelijk maken. Een andere methode zou zijn om hitte gedode bacteriën gebruiken om te infecteren en studie gastheer-cel interacties. Echter, verschillen bestaan ​​tussen de warmte gedood en levensvatbare bacteriën die de relevantie van de gastheer-pathogeen interacti verminderenon ^16. Het staat centraal in levende bacteriën met ongewijzigde expressie interactie met gastheercellen te bestuderen; derhalve werkwijzen voor het kweken van P. gingivalis in een anaërobe omgeving worden gegeven. Ook zijn twee eenvoudige rendabele protocollen aangetoond voor het beoordelen van het vermogen van P. gingivalis worden geïnternaliseerd door humane navelstreng endotheelcellen (HUVEC). Het eerste protocol is gebaseerd op het populaire antibioticum bescherming assay. Hoewel de test eenvoudig worden overwegingen bij het gebruik van anaerobe microorganismen gegeven. Het tweede protocol vereist het gebruik van een fluorescerende scanning microscoop te visualiseren interactie en geïnternaliseerd P. gingivalis. Elke test heeft zijn beperkingen en voordelen die zullen worden besproken zijn de onderzoeker een schets voor het bestuderen van het invasieve karakter van anaërobe bacteriën. Hoewel de huidige manuscript bestudeert P. gingivalis en HUVECs, kunnen deze protocollen worden gebruikt voor vele andere anaërobe bacteriën enzoals voor andere typen gastheercellen.

Protocol

De volgende protocollen werkwijzen voor het kweken en bestuderen van de invasie door anaërobe species, blz beschrijven gingivalis; evenwel deze protocollen worden gebruikt voor een aantal anaerobe pathogenen. Hoewel HUVECs gebruikt, kan dit protocol worden gebruikt voor andere eukaryote cellen zowel immune als niet-immune.

1. Anaërobe Chamber gebruik en onderhoud

Opmerking: P. gingivalis is een anaerobe gevoelig voor normale niveaus van zuurstof aangetroffen in omgevingslucht. Een gecontroleerde anaëroob milieu is essentieel voor de kweek van P. gingivalis.

1. Hier, onderhouden van een aangeduid als anaërobe gemengd gas (80% _N2, 10% _H2, 10% CO ₂₎ in een vinyl anaërobe kamer (figuur 1A) kunstmatige atmosfeer. Gebruik een luchtsluis (Figuur 1B) voor het overbrengen van items uit het laboratorium omgeving naar de anaërobe kamer. De luchtsluis werkt handmatig, twijs zuivering met N ₂ gas vóór de invoering van de gemengde anaerobe gas.
2. Gebruik een waterstofsulfide verwijderingskolom (figuur 1C) voor onderhoudsvrije verwijdering van de ongewenste waterstofsulfide. Plaats een ontvochtiger binnen de kamer H ₂ O door de katalysator te verwijderen en aërosolen dat de verspreiding van verontreiniging tegengegaan.
   Opmerking: Waterstofsulfide is een natuurlijk bijproduct van vele anaërobe bacteriën en ophoping is giftig voor bacteriën en kunnen leiden tot beschadiging van de elektronica en de levensduur van de katalysator te verminderen.
3. Gebruik een ventilatorkast atmosfeer van de ruimte te circuleren door een palladiumkatalysator, die zuurstof in aanwezigheid van waterstof (figuur 1D) verwijdert.
   Opmerking: Een recirculerende atmosfeer (HEPA) verwijdert zwevende verontreinigingen met een grootte van 0,22 pm of groter.
4. Cultuur anaërobe bacteriën in een 37 ° C incubator die zich binnen de anaërobekamer. Gebruik standaard aseptische technieken bij het werken in de anaërobe kamer.

Figuur 1. Anaerobe vinyl kamer en zijn componenten. (A) A vinyl anaerobe kamer volledig afgesloten van zuurstof voorziet werkruimte twee personen tegelijk (32 in x 78 in). Het bevat een incubator ingesteld op 37 ° C (opnieuw midden). (B) een luchtsluis wordt gebruikt voor de overdracht van voorwerpen uit de laboratoriummilieu de anaërobe kamer. Afgebeeld is een automatische luchtsluis bediend door een controller die kan worden geprogrammeerd om de vacuüm- en ontluchtingsprocedures nodig om een ​​anaerobe omgeving te creëren automatisch uit te voeren. (C) A waterstofsulfide verwijderingskolom biedt onderhoudsvrije hoge capaciteit verwijdering van ongewenst waterstofsulfide. (D) Twee katalysator fan dozengeplaatst in de anaerobe kamer om circuleren atmosfeer van de kamer door middel palladiumkatalysator, die in aanwezigheid van waterstof, zuurstof verwijdert. De anaërobe kamer is opgezet volgens de instructies van de fabrikant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Voorbereiding van anaërobe bacteriën

Opmerking: P. gingivalis is aerotolerant en kunnen worden opgeslagen in aërobe omstandigheden, maar het zal niet groeien in aanwezigheid van zuurstof op een hoger niveau dan 6% ^17,18. Een anaerobe kamer is noodzakelijk voor een goede kweek van P. gingivalis en andere anaërobe soorten (Figuur 1). Goede opleiding en onderwijs op anaerobe kamer gebruik is vereist voordat het werken met microanaerobes ^19.

1. Equilibreer alle vloeibare media en borden met de anaërobe Conditionen ten minste 12 uur vóór het experiment om resterende zuurstof te verwijderen.
2. Transfer P. gingivalis van -80 ° C vriezer anaërobe kamer, laat ontdooien.
3. Streak P. gingivalis op trypticasesoja bloed agar platen (TSA II met 5% schapen bloed). Wikkel platen in parafilm en opslag bij 37 ° C onder anaërobe incubator gedurende 4-7 dagen.
4. Te enten P. gingivalis in 3 ml brain hart infusie (BHI) bouillon aangevuld met hemine en menadion, een verrijkt niet-selectieve vloeibare media voor het kweken van anaerobe en veeleisende micro-organismen, met steriele loops.
   Opmerking: Voor de lange termijn opslag, meng bacterieculturen opgesteld BHI met glycerol of DMSO (10-20% uiteindelijke concentratie) en plaats in een -80 ° C vriezer.
5. Bereid een voorgerecht cultuur van P. gingivalis door een 1:10 verdunning en waardoor bacteriën groeien tot mid-log-fase.

Opmerking: De optische dichtheid van de bacriaal suspensie wordt bepaald en de bacteriële concentratie voor elke stam te onderzoeken ingesteld. Voor P. gingivalis een suspensie bij OD ₆₆₀ van 0,7 komt overeen met mid-log fase en ~ 7 x 10 ⁸ cellen / ml. Groeiomstandigheden in het protocol hierboven beschreven zijn specifiek voor P. gingivalis en moeten worden aangepast voor andere bacteriële stammen.

3. endotheelcellen Culture

Opmerking: Purchase samengevoegd primaire HUVEC plekken in basaal medium met vasculaire endotheliale groeifactoren (VEGF) bij 37 ° C in 5% CO ₂ volgens de instructies van de fabrikant.

1. Zaad HUVECs in T-75 flessen van 2,5 x 10 ⁵ cellen / fles in 15 ml VEGF media.
   Opmerking: Controleer levensvatbaarheid via een 1: 1 verdunning met 4,0% trypan blauw. Cellen met een gecompromitteerd membraan trypaanblauw behouden, zullen gezonde cellen met intacte membranen wit verschijnen wanneer bekeken onder een binoculair lichtmicroscoop. Count 100 cellen zorgen dat meer dan 80% van de cellen levensvatbaar ^20.
2. Vervang de media om de 2 dagen met voorverwarmde verse VEGF media tot cellen te bereiken ~ 80% confluentie.
3. Was de cellen eenmaal met PBS voorverwarmd. Bevrijden cellen van de T75 kolf door incubatie met 2 ml trypsine-EDTA (0,25%) gedurende 5 min gevolgd door 2 ml trypsine neutraliserende oplossing.
4. Verzamel gesuspendeerd HUVEC's in een 50 ml conische buis. Spoel eventuele extra cellen van T-75 kolven met PBS en overbrengen naar 50 ml conische buizen.
5. Centrifugeer cellen bij 200 xg gedurende 10 min.
6. Verwijder supernatant, schorten cel pellet in 10 ml voorverwarmde VEGF media.
7. Bepaal celconcentratie behulp van een hemocytometer en dergelijke cel telinrichting.
8. Bereken hoeveelheid celsuspensie ofwel 6-well plaat (400,000 / putje) of 12-putjesplaat toevoegen dekglaasjes (50.000 / putje). HUVECs zal klaar zijn voor experimenten de volgende dag.

4. Survival Assay Invasion / Interaction(Plating)

Opmerking: Bij het uitvoeren van deze test bereiden twee 6-well platen van endotheelcellen gezaaid met 400.000 cellen / putje. Eén plaat wordt gebruikt om bacteriën bevestigd aan en geïnternaliseerd door gastheercellen te beoordelen. De andere plaat zal goed zijn voor intracellulaire bacteriën. De 6-well plaat maakt drievoud van twee monsters per experiment worden uitgevoerd. Voor een overzicht van dit protocol wordt verwezen naar de overleving assay stroomdiagram (figuur 2).

1. Bereid anaërobe bacteriën zoals hierboven beschreven (zie punt 1) totdat ze mid-log groei (OD ₆₆₀ 0,5-0,7) te bereiken.
2. Centrifugeer bij 5000 xg bacteriën gedurende 10 min.
   Opmerking: Als centrifuge buiten anaërobe kamer, dragen bacteriële monsters in een goed afgesloten buis van 15 ml, wikkel de dop met parafilm om zuurstof lekkage te voorkomen.
3. Plaats afgedraaid P. gingivalis terug in de kamer, gooi supernatant. Was opnieuw met PBS, pellet bacteriën voordat resuspenderen in VEGF media. Suspensies bereid alle bacteriestammen worden getest bij OD ₆₆₀ van 0,7 die overeenkomt met mid-log fase (~ 7 x 10 ⁸ cellen / ml). De bacteriën zijn nu klaar voor infectie.
4. Transfer 6-well platen met HUVECs uit weefselkweek incubator in anaërobe kamer. Verwijder de media en was driemaal met anaërobe PBS. Voeg 2 ml VEGF anaerobe medium aan elk putje en plaats de platen bij 37 ° C in anaërobe incubator gedurende 20 minuten de temperatuur op infectie evenwicht.
   Opmerking: Plaat bacteriën op bloed agar platen die gebruikt worden voor de infectie zorgen homogeen zijn en niet verontreinigd na infectie.
5. Infect gastheercellen met bacteriën bij een multipliciteit van infectie (MOI bacteriën: host) van 100: 1.
   Opmerking: HUVEC cel aantal wordt bepaald door het uitvoeren van een trypan uitsluiting testen op een enkele ruim voor infectie. Bacteriële aantal cellen wordt bepaald via optische dichtheid (bijvoorbeeld OD van 0,5 = 5 x 10 ⁸ cellen / ml). Bacterial concentratie wordt ingesteld op juiste MOI basis van HUVEC concentratie ^21.
6. Plaats 6-well platen met besmette HUVEC in anaërobe incubator de bacteriën te interageren met gastheercellen gedurende 30 min.
7. Bereid saponine in BHI (1,0% w / v) in de anaërobe kamer en filtreer door een 0,2 urn filter.
8. Overleving van zowel aangesloten en geïnternaliseerde bacteriën.
   1. Verwijder platen uit de incubator, aspireren media, wast driemaal met PBS anaërobe en voeg 2 ml gefiltreerd 1,0% saponine (bereid zoals beschreven in stap 4,8). Incubeer gedurende 15 min tot lysis gastheercel mogelijk maken.
   2. Schrapen onderkant van elk putje met celschraper. Verzamel de celmengsel uit elk putje en een 1: 1 verdunning in BHI.
   3. Overgaan tot seriële verdunningen van het monster te maken. Afhankelijk van bacteriesoorten en concentratie, stel seriële verdunningen. Begin met 1: 100 of 1: 1000 verdunningen.
   4. Plaat 200 ul van gewenste verdunning op bloed agarplaten. Wrap tHij platen parafilm en plaats in de anaërobe incubator bij 37 ° C.
   5. Na zeven dagen incubatie bij 37 ° C, verwijder de platen en tel kolonievormende eenheden (CFU's) met behulp van een lichtbak handmatig kolonies te tellen.
      Opmerking: CFU opgesomd. Voor grotere hoeveelheden CFU's kunnen beelden worden gemaakt en software kan worden gebruikt voor de telling van CFU vergemakkelijken.
9. Overleving van geïnternaliseerde bacteriën.
   1. Verwijder platen uit de incubator. Was driemaal met PBS anaërobe en voeg 2 ml VEGF medium aangevuld met antibiotica (300 pg / ml gentamicine en 400 ug / ml metronidazol).
   2. Incubeer gedurende 1 uur. Zorg ervoor dat de antibiotica te testen, zodat ze 100% effectief is bij het ​​doden van de gewenste bacteriële stam en zorg ervoor dat ze niet gastheercellen ^22,23 dringen.
   3. Zuig media, voeg 2 ml van gefilterde 1,0% saponine. Incubeer gedurende 15 min tot lysis gastheercel mogelijk maken.
   4. Schrapen onderkant van elke well met celschraper. Verzamel de cel mengsel uit elk putje en maak 1: 1 verdunning in BHI.
   5. Maak seriële verdunningen van het monster (1: 100, 1: 1000).
   6. Plaat 200 ul van gewenste verdunning op bloed agarplaten. Wikkel platen in parafilm en plaats in anaërobe incubator.
   7. Na zeven dagen incubatie bij 37 ° C platen verwijderd en tellen CFU.

Figuur 2. Schematische weergave van een protocol dat wordt gebruikt voor de overleving van anaërobe bacteriën met eukaryotische cellen. Beide assays voor een totaal bacteriële overleving en de overleving van geïnternaliseerde bacteriën kunnen tegelijkertijd worden uitgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. internalisering van bacteriën in Host CeLLS (Fluorescent Microscopy)

Opmerking: P. gingivalis wordt gelabeld met 2 ', 7'-bis- (2-carboxyethyl) -5- (en-6) -Carboxyfluorescein, acetoxymethylester (BCECF-AM). BCECF-AM is een niet-fluorescente membraan-permeabel kleurstof; de omzetting fluoresceïne BCECF via de werking van intracellulaire esterasen kan cellevensvatbaarheid aangeven. P. gingivalis is gelabeld met BCECF-AM kleurstof en vervolgens gebruikt om eukaryotische cellen te infecteren. Na infectie worden de cellen gefixeerd en gemerkt met DAPI en TRITC-falloïdine. De DAPI kleuring gebruikt om eukaryotische celkern vlek ook etiketteren bacteriële cel nucleus, waarbij een tegenmaatregel voor niet-levensvatbare bacteriën die niet metabolisch splitsen BCECF-AM identificatie levert. Gastheercellen worden gemarkeerd met TRITC-phalloidin, een rode kleurstof actine.

1. Autoclaaf dekglaasjes. Aseptisch dekglaasjes naar 12-well plates voor het zaaien van endotheelcellen 5 x 10 ⁴ cellen / putje. (Opgesteld dag voor experiment)
2. Bereid anaërobe bacteriën gekweekt tot mid-log fase (OD ₆₆₀ = 0,5-0,7), zoals beschreven in paragraaf 1.
3. Was met anaërobe bacteriën 2x PBS met centrifugeren bij 5000 x g en de pellet suspenderen in PBS bij 5-7 x 10 ⁸ cellen / ml.
4. Voeg 20 ul van 0,2 mM BCECF-AM tot 2 ml bacteriesuspensie (5-7 x 10 ⁸ cellen / ml) tot een eindconcentratie van BCECF-AM van 2 uM.
5. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 min in het donker.
6. Transfer platen met endotheelcellen gezaaid op 18 mm (# 1,5 dikte) ronde dekglaasjes van weefselkweek incubator in de anaërobe kamer. Wassen met PBS en uitwisseling met anaërobe VEGF media.
   Let op: Controleer of HUVECs gezond zijn onder een lichtmicroscoop. HUVECs moet ~ 80% confluent dient morfologie vergelijkbaar met de fabrikanten.
7. Centrifuge gelabelde bacteriën op5000 xg gedurende 10 min om resterende BCECF-AM kleurstof te verwijderen. Schorten in 2 ml anaërobe VEGF media.
8. Infect gastheercellen met gemerkte bacteriën bij MOI van 100: 1 (bacteriën: host).
9. Incubeer in anaërobe kamer bij 37 ° C gedurende 30 min.
10. Na infectie wassen cellen met PBS driemaal en fixeer vers bereide 4,0% paraformaldehyde gedurende 10 min.
    Opmerking: Na de vaststelling van de cellen, kan experiment buiten de anaerobe kamer worden uitgevoerd.
11. Coverslips wassen met PBS driemaal.
12. Voeg 1 ml 0,2% Triton X-100 gedurende 10 min.
13. Coverslips wassen met PBS driemaal.
14. Voeg 50 ul van TRITC phalloidin (50 ug / ml) dekglaasjes tot 45 min.
15. Was coverslips drie keer, te verwijderen uit de 12-well plaat en plaats op een dia met soft-set montage medium met DAPI. Verzegeling van de zijkanten met nagellak.
    Opmerking: Dia's kunnen worden opgeslagen voor een paar maanden in het donker. Vermijd blootstelling aan licht van de foto's bleken te voorkomen.
16. Bekijk slidesmet behulp van een confocale microscoop.
    1. Hier, gebruik een 34 kanaals spectraal-systeem (32-kanaals array detector en twee side PMT detectoren, plus een verzonden licht detector) geconfigureerd rond een AxioObserver (omgekeerde) staan ​​met een gemotoriseerde XY podium. Het systeem heeft vijf lasers: blauw diode (405 nm), multi-line Argon (458, 488, 514 nm), groene diode (561 nm), rood HeNe (633 nm) en een 440 nm gepulste laser. Voorzie een Fluorescence Lifetime Imaging-systeem met 2 hybride GaAsP detectoren (voor FRET-FLIM).
    2. Detecteren fluorescentie van DAPI en TRITC in een kanaal met behulp van een dual-band filter met golflengten van 340-380 nm en 540-560 nm en een emissie filter van 435-485 nm en 570-590 nm respectievelijk. Detecteren fluorescentie van BCECF-AM gebruik van een filter met excitatie golflengte van 440-500 nm en een emissie filter van 510-590 nm.
       Opmerking: Controles voor BCECF-AM moet worden gedaan op elke bacteriestam worden bestudeerd om de juiste etikettering van levende bacteriën te garanderen. Valideren eerste dat nonviable bacteriën zijn DAPI-positieve en BCECF-negatief. Tweede, ervoor te zorgen dat levende bacteriën BCECF-AM kan metaboliseren in fluoresceïne BCECF. Variabele concentraties van de bacteriën of BCECF-AM kleurstof kan getest moeten worden voor een optimale labeling.

Representative Results

Protocollen hierboven beschreven werden toegepast in de studie van gastheer-pathogeen interactie tussen P. gingivalis en endotheelcellen. P. gingivalis W83 en P. gingivalis V3150 die een deletie van PG0228 werden gebruikt in de studie. De PG0228 is voorspeld een eiwit dat de niveaus van RNA en eiwitten kunnen veranderen, die uiteindelijk kunnen beïnvloeden interactie van P. coderen gingivalis met gastheercellen. Om het effect van PG0228 op P. onderzoeken gingivalis 's vermogen tot interactie met gastheercellen, het vermogen van de parentale en mutante stammen om met HUVEC vergeleken. De overleving protocol (Figuur 2) werd op dit onderzoek. Zo werden beide stammen gekweekt tot logaritmische fase zoals beschreven in stap 2. Beide stammen hadden dezelfde groeicurven en dus geen significante problemen normalisatie van de celaantallen voorafgaand aan infectie aangetroffen. Na zeven dagen van incubatie werden KVE's waargenomen op het bloed eengar platen (figuur 3). Verschillende verdunningen 1:10 (Figuur 3A), 1: 100 (figuur 3C) en 1: 1000 (figuur 3B) werden uitgeplaat op agarplaten. Zoals blijkt uit figuur 3A het aantal kolonies waren te hoog om te beoordelen; de koloniën waren te onderscheiden van elkaar en als "te veel om te tellen" [TMTC]. De verdunning in figuur 3B is te laag als te weinig kolonies verkregen. De verdunningen van 1: 100 zoals weergegeven in figuur 3C wenselijk, aangezien de kolonies waarneembaar en het aantal kolonies beheersbaar te tellen. Vergelijkbare resultaten werden gevonden voor de mutante stam V3150 (Figuur 3D). Aldus werd de CFU's opgesomd van de platen met de verdunningsfactor van 1: 100.

Met behulp van het aantal CFU's en de verdunningsfactor, werd het geschatte aantal levende bacteriën teruggewonnen voor elke stam berekend. Delen van het aantal viable bacteriën teruggewonnen door het aanvankelijke aantal bacteriën resulteert in een verhouding gedefinieerd als de invasie efficiency. Bij het ​​vergelijken van de invasie rendementen van beide stammen wildtype W83 overleefden in HUVEC met een hoog rendement, terwijl stammen ontbreekt PG0228 toonden een significante afname in overleving (figuur 4).

Om verder te verifiëren dat het defect te wijten was om te overleven in plaats van verminderd internalisering van de bacteriën, werd microscopische analyse uitgevoerd. HUVECs geïnfecteerd met P. gingivalis werden bekeken onder een microscoop (Figuur 5). In dit voorbeeld wordt een HUVEC gepresenteerd. Om het aantal geïnternaliseerde bacteriën te bepalen meerdere beelden werden genomen op verschillende brandpuntsafstanden voor een Z-stack waardoor ruimtelijk-temporele identificatie van geïnternaliseerde P. verkrijgen gingivalis. Ook, ten minste 40 cellen / experiment worden geanalyseerd (per biologisch repliceren) en het aantal geïnternaliseerde bacteriën opgesomd per stregen. Indien het aantal geïnternaliseerde bacteriën is hetzelfde voor elke stam wanneer bekeken onder een microscoop dan beide stammen binnendringen HUVEC gelijke; Echter, de mutant V3150 vermogen om te overleven terwijl in de gastheercel zoals in het antibioticum bescherming assay verminderd.

Figuur 3. Resultaten van een bacteriële overleving assay. Protocol voor overleving van intracellulaire bacteriën werd gebruikt om het vermogen van wildtype P. beoordelen gingivalis W83 en een mutant V3150 tekort aan PG0228 binnen te vallen en te overleven binnen HUVECs. Geïnternaliseerde levensvatbare bacteriën worden bepaald door visualisatie van CFU's na incubatie van HUVECs- P. gingivalis mengsel op bloedagarplaten gedurende zeven dagen onder anaërobe omstandigheden. Bloed platen worden op lichte doos die het contrast verhoogt en zorgt voor eenvoudiger telling van de CFU's geplaatst. Verschillende verdunningen waren examined. HUVECs geïnfecteerd met P. gingivalis W83 verdunning 1:10 (A), verdunning 1: 1000 (B), en verdunning 1: 100 (C). HUVECs geïnfecteerd met P. gingivalis V3150 verdunning. 1: 100 (D) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Vergelijking van de overlevingskansen tussen de ouders en mutante bacteriestammen. HUVECs werden geïnfecteerd met wild type P. gingivalis W83 en een mutant V3150 deficiënt PG0228. Protocol voor overleving zoals geschetst in figuur 2 werd gevolgd. Experiment werd driemaal uitgevoerd in triplo en het gemiddelde ± standaardafwijkingen worden gepresenteerd. Invasie efficiëntie vertegenwoordigt overleefd / aanvankelijke bacteriën.* De mutante stam is statistisch significant verminderde overleving in vergelijking met de wild-type W83 stam (p <0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. Voorbeeld van een microscopische analyse van P. gingivalis geïnternaliseerd door HUVEC. HUVEC's werden geïnfecteerd met BCECF-AM gelabelde P. gingivalis gedurende 30 min bij een MOI van 100: 1 (P. gingivalis: HUVEC). Cellen werden gefixeerd met paraformaldehyde en gelabeld met TRITC-falloïdine en DAPI. Het beeld toont een enkele HUVEC met de kern (A) en F-actine (B) gekleurd blauw en rood, respectievelijk. De pijl geeft P. gingivalis gemerkt groene (C). Een samengevoegde image wordt geproduceerd P. tonen gingivalis invasie in HUVEC (D). Beelden werden geproduceerd met behulp van scanning confocale microscoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Alle bovengenoemde werkwijzen kunnen worden gebruikt om specifieke assays voor de interactie van anaërobe bacteriën met eukaryotische cellen te beoordelen ontwerpen. Echter, er zijn verschillende overwegingen bij de experimenten te doen dalen. Ten eerste zijn de microbiële stammen worden gebruikt in een studie.

Het is cruciaal bij de vergelijking van twee stammen zowel het overleven assay en microscopisch onderzoek dat ze op vergelijkbare groeifasen en bereiken soortgelijke celconcentraties zoals verschillen in de bovenstaande kan invasie efficiency ¹³ beïnvloeden. Wanneer groeicurven verschillen tussen twee bacteriestammen, moeten aanpassingen worden aangebracht om uiteindelijk vergelijkbare groeipatronen delen consistente concentraties ²¹ bereiken. Ook moet bacteriën gelijkmatig verdeeld naar cel aggregatie te voorkomen. Voorts is het essentieel om antibiotica die effectief elimineren extracellulaire bacteriën te selecteren. Als gekozen antibioticum schadelijke effecten op gastheercellen, danalternatief antibioticum of lytische enzymen kunnen worden gebruikt ^24,25. Ten slotte moet stam heterogeniteit worden beschouwd; hoewel een species kan worden geïdentificeerd gastheercellen binnendringen, kunnen er grote verschil in pathogeniteit vanaf één stam naar een andere ²⁶ en dus een proefonderzoek worden uitgevoerd voor elke stam te onderzoeken.

Een tweede kritische stap is om een ​​optimale incubatietijd en bacterieel inoculum (multipliciteit van infectie [MOI] dat het aantal bacteriën gebruikt om gastheercellen te infecteren) bij het ontwerpen van protocollen vast. Kortere incubatietijd beoordeelt het vermogen van bacteriën om internalisering van gastheercellen tijdens langere tijdstippen kunnen nodig zijn om de overleving van bacteriën en intracellulaire replicatie ²⁷ bepalen. Als intracellulaire overleving van bacteriën kan worden beïnvloed door de MOI worden gebruikt, is het het beste om te testen meerdere MOI te voorkomen dat schade aan cellen veroorzaakt die leidt tot celdood of permeabilized membranen met toegang tot antibiotica doden van intracellulaire bacteriën. Na vaststelling van MOI en de incubatie tijd die nodig is om de specifieke vraag wordt gesteld, wordt het experiment uit te voeren volgens het protocol; moet echter verscheidene seriële verdunningen van de eukaryotische cel-lysis bacteriën mengsel gemaakt. De optimale verdunningsfactor wordt bepaald op basis van KVE's waargenomen. Verdunningsfactoren die resulteren in platen met 50-200 CFU's zijn optimaal voor de beoordeling overleven efficiency. Als het aantal CFU te hoog, kolonies te onderscheiden van elkaar en wordt het moeilijk om elke kolonie handmatig tellen. Als het aantal CFU te laag, kleine afwijkingen overdrijven voudige verandering tussen stammen onderzocht en produceren grote standaardafwijkingen tussen herhalingen.

Een derde kritieke punt gastheercellen die gezond en klaar om met bacteriën te bereiden. In het bovenstaande protocol gastheercellen worden gekweekt afzonderlijk met behulp van standaard aseptische techniques. Het gebruik van antibiotica en antischimmelmiddelen in weefselkweek kan raadzaam zijn, vooral voor beginners celkweek biologen. Echter, voordat de overleving assay gastheercellen worden gekweekt in een antibiotisch-vrij medium gedurende ten minste 12 uur voor het overbrengen van de cellen in de anaërobe kamer. Eenmaal in de kamer, moet de media worden uitgewisseld met anaërobe-antibiotica vrije media om geen afbreuk doen aan anaërobe bacteriën tijdens infectie. Als er problemen bestaan ​​hechting van gastheercellen plastic weefselkweekplaten dekglaasjes of het kan wenselijk zijn een kleefstof toepassen zoals poly-L-lysine of gelatine. Ook kunnen technieken voor het coaten weefselkweekschalen met een natuurlijk geproduceerde basaalmembraan-achtige extracellulaire matrix (ECM) de onderzoeker met meer als in vivo omstandigheden ^28,29. Lyseren gastheercellen vereist een evenwichtige reinigingsmiddel in staat is van de openstelling van gastheercellen zonder dat bacteriële levensvatbaarheid. Hoewel saponine niet zal kziek bacteriën, kan de groei van bepaalde soorten remmen. Voor onze studies het effect van saponine op P. gingivalis stammen te worden gebruikt voor de gastheer-pathogeen analyse werd geverifieerd geen effect op de groei / overleving. Als bacteriën zijn zeer gevoelig voor detergentia, zoals saponine, kunnen herhaalde vries-dooi cycli of gedestilleerd water worden toegepast om gastheercellen te lyseren met weinig schade aan bacteriën.

Een vierde kritisch punt omvat de overwegingen moeten worden genomen bij het uitvoeren van de microscopie experimenten. Ten eerste is het gebruik van een fluorescerende kleurstof om bacteriën te gebruiken voor de microscopie protocol label. Veel van de huidige etikettering methoden voor bacteriën vereisen een primair antilichaam of gebruikelijke bacteriële kleurstoffen met aanzienlijke beperkingen, zoals de toxische effecten en uitspoeling van de kleurstof in de omgeving waardoor hoge achtergrond. BCECF-AM is een membraan-permeabel kleurstof gewoonlijk gebruikt als een fluorescentie-indicator van intracellulaire pH in zowel prokaryote en eukaryoten ^30-32. Het bleek effectief bij het ​​benoemen van een reeks anaërobe bacteriën in eerdere studies ^33-35 zijn. BCECF-AM alleen etiketteren levensvatbare bacteriën in staat verestering. De conversie naar BCECF door intracellulaire esterasen resulteert in een fluorescerende vorm die lekt uit cellen veel langzamer dan de oorspronkelijke stof. Er zijn veel fluorescerende kleurstoffen en kleuring technieken die kunnen worden gebruikt ^36; Maar dit protocol beschrijft een eenvoudige bevestiging / kleuring techniek die kan worden gebruikt met vrijwel elke microorganisme. Bovendien kunnen andere kleurstoffen (TRITC-falloïdine en DAPI) worden gebruikt om meer duidelijk de grenzen van de eukaryotische cellen en maken slechts bacteriën die interageren met gastheercellen.

Fluorescente kleurstoffen zijn gevoelig voor foto-bleking en er zijn verschillende commerciële antifades en montage media beschikbaar die verzwakking van het fluorescentiesignaal ³⁷ kunnen verhinderen. Er zijn ook keuzes tussen hard-set montage media eennd soft-set degenen. Terwijl de hard-set die kan leiden tot significante veranderingen in de vuurvaste index en krimp en weefselschade ³⁸ de soft-instelling media vereisen afdichtingsmiddelen, zoals nagellak, het dekglaasje te beveiligen. Dan te wijten aan variaties waargenomen bij geïnfecteerde eukaryote cellen; het aantal geïnternaliseerde bacteriën tussen cellen kan variëren en bijgevolg verschillende eukaryotische cellen worden gebruikt voor analyse. In onze studies, worden ten minste veertig eukaryote cellen geëvalueerd en geïnternaliseerde bacteriën opgesomd per experiment ^33,34. Tenslotte duidelijk zichtbaar afzonderlijke cellen, eukaryotische cellen voor infectie mogen worden gekweekt tot confluentie. Microscopisch onderzoek van Prevotella intermedia infectie met epitheliale cellen vertoonden voorkeur voor specifieke gebieden van de gastheer celmembraan en de bacteriën zou niet aan plaatsen waar epitheelcellen werden in contact met elkaar en had geen lamellipodia ^39.

De limitatie van de microscopie kon zijn lage doorvoer zijn. Aldus, voor grootschalige kwantitatieve gegevens over de eigenschap invasieve bacteriën een doorstroomcytometrie kan ook worden gebruikt ^40. Deze werkwijze omvat het gebruik van fluorescent gemerkte bacteriën (die kan worden uitgevoerd zoals beschreven voor bacteriën te gebruiken voor microscopie) en maakt het bestuderen van meerdere monsters tegelijk dat aantrekkelijk is voor sommige onderzoekers zijn.

Wijzigingen in de twee protocollen kunnen worden gemaakt routes betrokken bij gastheercel opname van bacteriën te identificeren. Succesvolle bacteriële invasie vindt plaats in vijf fasen: (1) bijlage (2) entry / internalisatie (3) handel (4) persistentie en (5) ^afslag 41. Zo tijdens entry / internalisatie, de bacterie lokaliseert zich op de host en eigent zich de gastheercel voor internalisatie door middel van het wijzigen van signaaltransductie. Selectieve metabole remmers kan worden toegevoegd aan de cellen op veranderingen in signalering leidt tot succesvolle invasie bepalen gastheer. VoorZo latrunculine dat actine polymerisatie remt, kan worden gebruikt om te bestuderen hoe cytoskelet omlegging internalisatie beïnvloedt P. gingivalis. Antilichamen die celspecifieke receptoren of siRNA kan neerhalen bepaalde genen doelwit kan ook worden gebruikt voor een beter begrip van de gastheercel signaleringsgebeurtenissen betrokken in bacteriële internalisatie. Terwijl alle metabolische remmers minimale totale effect op gastheercellen, behalve die moeten worden onderzocht, is het belangrijk te zorgen voor de inhibitor behandelingen een toxisch effect op bacteriën hebben.

Toekomstige studies zou kijken naar een aantal van deze technieken te perfectioneren, eventueel bereiken van een in-vivo-achtige toestand. In het huidige artikel, zijn ofwel bacteriën of gastheer cellen blootgesteld aan extreme omstandigheden. Afhankelijk van het organisme, de cellijn en doel van het experiment sommige onderzoekers de voorkeur aan bovengenoemde protocol uitvoeren in een _CO2 incubator. Echter, parodontale laesieweerspiegelen een anaërobe micro waarin de bacterie interactie met de gastheer. Een studie die onderzocht variaties in de cellulaire respons op te dagen met orale bacteriën onder aerobe versus anaërobe omstandigheden gemeld dat onder verlaagde zuurstofspanning (2% zuurstof) bacteriën, bv Tannerella forsythia, P. gingivalis en P. intermedia ontlokte hogere niveaus van IL-8 en TNFa in vergelijking met aërobe omstandigheden ^42. Het vermogen van eukaryote cellen overleven onder anaërobe omstandigheden werd ook bevestigd door studies die het vermogen van menselijke mesenchymale stamcellen, humane dentale follikel stamcellen, humane gingivale fibroblasten, gingival carcinoomcellen en humane orale epitheelcellen ^43,44,45 onderzocht. Onze studies met WST-1 celproliferatie-assay bleek dat HUVEC kan overleven tot 48 uur onder anoxische omstandigheden. Het besluit werd genomen om de cellen te infecteren in de anaërobe kamer omdat P. gingivalis is gevoelig tenmospheric zuurstofgehalte, terwijl HUVECs kan langere tijd overleven onder anaerobe omstandigheden. Toekomstig onderzoek zal de uitvoering van micro-fluïde apparaten celcultuur die zuurstof aan één oppervlak van een monolaag (zoals een slagader) en anaerobe omstandigheden op de andere ⁴⁶ onderzoeken. Zo voorwaarden niet worden opgeofferd voor zowel bacteriën of gastheer na infectie. Samengevat beschreven enkele eenvoudige protocollen die kunnen worden gebruikt om gastheer-pathogeen interactie anaërobe bacteriën onderzocht. Deze protocollen zijn ook gebruikt om het effect van bacteriële internalins, eiwitten bevorderen bacteriële invasie ^40, alsmede surrogaat niet-invasieve bacterie een eiwit tot expressie verleent invasieve woning op de bacteriën ⁴⁷ te beoordelen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vinyl Anaerobic Chamber-Type B	Coy Laboratory Products		Model 2000 incubator
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood	BBL	221261
Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool	LifeLine Technology	FC-0044
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Technology	LL-0003
TrypKit	LifeLine	LL-0013
Saponin	Riedel-de Haen	16109
Gentamicin Sulfate Salt	Sigma-Aldrich	G-1264
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M-3761
BCECF-AM	LifeTechnologies	B1150
TRITC Phalloidin	Sigma-Aldrich	P1951
18 mm Circular Coverslips	Electron Microscopy Sciences	72222-01
VectaShield Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200