Porphyromonas gingivalis come organismo modello per la Valutazione Interazione di batteri anaerobici con cellule ospiti

Abstract

I batteri anaerobici lontano superano aerobi in molte nicchie umani, come l'intestino, bocca e vagina. Inoltre, infezioni anaerobiche sono comuni e spesso di origine indigena. La capacità di alcuni agenti patogeni anaerobici di invadere le cellule umane dà loro misure di adattamento per sfuggire immunità innata nonché per modulare il comportamento della cellula ospite. Tuttavia, garantire che i batteri anaerobici sono vivo durante un'indagine sperimentale degli eventi che può porre problemi. Porphyromonas gingivalis, un anaerobio Gram-negativi, è in grado di invadere una varietà di cellule non fagocitiche eucariotiche. In questo articolo viene descritto come con successo la cultura e valutare la capacità di P. gingivalis di invadere le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). Sono stati sviluppati due protocolli: uno per misurare batteri che possono con successo invadere e sopravvivere all'interno dell'ospite, e l'altro per visualizzare i batteri interagiscono con le cellule ospiti. Queste tecniche richiedono l'uso di un anaeRobic camera per la fornitura di P. gingivalis con un ambiente anaerobico per la crescita ottimale.

Il primo protocollo si basa sulla misurazione di protezione antibiotico, che è ampiamente utilizzato per studiare l'invasione delle cellule ospiti da batteri. Tuttavia, il saggio di protezione antibiotico è limitata; solo i batteri intracellulari che sono coltivabili a seguito di trattamento antibiotico e lisi della cellula ospite sono misurati. Per valutare tutti i batteri interagiscono con le cellule ospiti, sia vivi e morti, abbiamo sviluppato un protocollo che utilizza il microscopio a fluorescenza per esaminare l'interazione ospite-patogeno. I batteri sono fluorescente con 2 ', 7'-Bis- (2-carbossietil) -5- (e-6) -carboxyfluorescein acetossimetil estere (BCECF-AM) e utilizzato per infettare cellule eucariotiche in condizioni anaerobiche. Dopo fissazione con paraformaldeide e permeabilizzazione con 0,2% Triton X-100, cellule ospiti sono etichettati con TRITC falloidina e DAPI etichettare citoscheletro cellulare e nucleo, rispettivamente. Molteplici images prelevati in differenti punti focali (Z-stack) sono ottenuti per la visualizzazione spazio-temporale dei batteri. I metodi utilizzati in questo studio possono essere applicati a qualsiasi anaerobio coltivabili e qualsiasi tipo di cellula eucariotica.

Introduction

Batteri anaerobici colonizzano quasi tutte le superfici del corpo umano. Sebbene predominante nella flora dei tratti intestinali e genito-urinario in cui le concentrazioni di ossigeno sono bassi, esistono anche ad alti livelli sulla pelle, bocca, naso e gola ^1. I batteri anaerobici sono una causa comune di infezioni endogene e sono spesso isolati da siti malati. Tuttavia, a causa della loro natura esigente, anaerobi possono essere difficili da isolare e cultura. Gli studi che coinvolgono batteri anaerobi devono essere effettuate in condizioni ristrette. Tecniche anaerobico-cultura moderna permettono ai ricercatori di imitare le impostazioni anaerobici necessarie per studiare molti ceppi di laboratorio anaerobica o addirittura isolati clinici ^2,3.

Batteri anaerobi patogeni hanno sviluppato un rapporto dinamico e co-evoluzione con le cellule ospiti in cui risiedono. La maggior parte degli anaerobi sono suscettibili di aver ucciso dalla risposta immunitaria dell'ospite prima di raggiungere infectii livelli di unità organizzative. Tuttavia, alcuni batteri patogeni hanno sviluppato meccanismi per sfuggire o sovvertire la risposta immunitaria dell'ospite. Compiono questo obiettivo attraverso meccanismi quali l'evasione del riconoscimento immunitario, la neutralizzazione dei mediatori immunitari, alterazione di immunità cellulo-mediata, l'invasione delle cellule ospiti e l'alterazione delle immunitario segnalazione ^4. Porphyromonas gingivalis, un anaerobio gram-negativi implicati sia orale e malattie extraorali, è un esempio di un batterio patogeno altamente adattato in grado di provocare cambiamenti patogeni nell'ospite ^5-7.

Sacche di biofilm placca accantonati in profonde fessure formatesi tra i denti e tessuto mucoso gengivale può ospitare batteri anaerobici che sono protetti dall'ossigeno atmosferico ^8. Queste tasche parodontali servono come una nicchia per vari patogeni anaerobici, come P. gingivalis ^9. P. gingivalis è un patogeno chiave di volta che è in grado di rimodellareing comunità microbica orale in modo da promuovere lo sviluppo e la progressione delle malattie parodontali ^10. Produce un gran numero di fattori di virulenza che sono attivi contro un ampio spettro di proteine ​​dell'ospite e fornisce meccanismi per evasione di difese dell'ospite ^11. È anche in grado di invadere epiteliali, endoteliali, fibroblasti e cellule del legamento parodontale in vitro e in vivo ^{12-14 15.} Con efficacemente invadere cellule ospiti, P. gingivalis può sfuggire immunità dell'ospite. Invasione efficace delle cellule ospiti non solo permette al batterio di sfuggire difese dell'ospite ma serve anche da serbatoio per il futuro reinfezione e altera la cellula ospite. Sono necessari studi sui meccanismi molecolari coinvolti nella adesione e internalizzazione del batterio da cellule ospiti. La ricerca in diversi laboratori è focalizzata sulla comprensione degli eventi molecolari associati con l'internalizzazione di P. gingivalis da parte delle cellule ospitinonché i meccanismi utilizzati per sopprimere e dirottare la risposta immunitaria e sopravvivere i meccanismi di difesa dell'ospite ostili.

Ci sono molti saggi in grado di identificare e caratterizzare agenti patogeni che sono in grado di invadere cellule ospiti. Tuttavia, studi in vitro con patogeni anaerobici presentano molti problemi sperimentali per il ricercatore principalmente perché è difficile da eseguire studi che si basano su strumenti ingombranti in assenza di ossigeno. La situazione è aggravata dal fatto che le cellule eucariotiche hanno bisogno di ossigeno per crescere e quindi devono essere preparati separatamente in incubatori di coltura dei tessuti. Un modo per evitare tali ostacoli sarebbe quella di effettuare gli studi sotto ossigeno atmosferico, ma che avrebbe fatto la crescita di batteri anaerobi impossibile. Un altro metodo sarebbe quello di utilizzare i batteri ucciso al calore di infettare e studiare le interazioni ospite-cellulari. Tuttavia, esistono delle differenze tra batteri ucciso al calore e vitali che diminuiscono la pertinenza della dello s ospite-patogenosu ^16. E 'centrale per studiare batteri vitali con l'espressione inalterata l'interazione con le cellule ospiti; quindi, i metodi per la coltura di P. gingivalis in un ambiente anaerobico sono dati. Inoltre, sono dimostrati due protocolli convenienti semplici per valutare la capacità di P. gingivalis da interiorizzato da vena cellule umane endoteliali (ombelicali HUVECs). Il primo protocollo si basa sul popolare protection assay antibiotico. Anche se il test è semplice, le considerazioni quando si utilizza microrganismi anaerobi sono dati. Il secondo protocollo richiede l'uso di un microscopio a scansione a fluorescenza per visualizzare interagire e internalizzata P. gingivalis. Ogni test ha i suoi limiti e vantaggi che verranno discusse a rilasciare al ricercatore uno schema per studiare l'invasività dei batteri anaerobici. Anche se il manoscritto corrente studia P. gingivalis e HUVEC, questi protocolli possono essere usati per molti altri batteri anaerobici ecome per altri tipi di cellule ospiti.

Protocol

I seguenti protocolli descrivono i metodi per la coltura e lo studio l'invasione da parte della specie anaerobiche, P. gingivalis; Tuttavia, possono essere utilizzati tali protocolli per un certo numero di agenti patogeni anaerobici. Anche se vengono utilizzati HUVECs, questo protocollo può essere utilizzato per altre cellule eucariotiche sia immunitarie e non immuni.

1. anaerobica Camera uso e manutenzione

Nota: P. gingivalis è un anaerobio sensibile ai normali livelli di ossigeno riscontrati nell'aria ambiente. Un ambiente anaerobico controllato è di vitale importanza per la coltivazione del P. gingivalis.

1. Qui, mantenere un'atmosfera artificiale designato come gas anaerobico misto (80% N _2, 10% H _2, 10% CO ₂₎ in una camera di vinile anaerobica (Figura 1A). Utilizzare una camera di compensazione (Figura 1B) per trasferire oggetti dall'ambiente di laboratorio alla camera anaerobica. La camera di compensazione opera manualmente, twspurgo ghiaccio con N ₂ gas prima di introdurre il gas misto anaerobico.
2. Utilizzare una colonna di rimozione dell'idrogeno solforato (Figura 1C) per la rimozione del solfuro di idrogeno indesiderabile senza manutenzione. Collocare un deumidificatore entro la camera per rimuovere H ₂ O creato dal catalizzatore e per evitare aerosol che facilitano la diffusione della contaminazione.
   Nota: L'idrogeno solforato è un sottoprodotto metabolico naturale di molti batteri anaerobici e l'accumulo è tossica per i batteri e può provocare danni all'elettronica e diminuire la durata di un catalizzatore.
3. Utilizzare una scatola ventilatore per far circolare l'atmosfera della camera attraverso un catalizzatore di palladio, che rimuove l'ossigeno in presenza di idrogeno (Figura 1D).
   Nota: Un atmosferico (HEPA) ricircolo rimuove i contaminanti presenti nell'aria con una dimensione di 0,22 micron o più grandi.
4. Batteri anaerobici cultura a 37 ° C incubatore che si trova all'interno del anaerobicacamera. Utilizzare tecniche asettiche standard, quando si lavora all'interno della camera anaerobica.

Figura 1. camera anaerobica vinile e dei suoi componenti. (A) Una camera anaerobica vinile sigillato completamente dall'ossigeno atmosferico fornisce spazio di lavoro per due persone alla volta (32 in x 78 in). Contiene un incubatore a 37 ° C (posteriore centrale). (B) una camera di compensazione è utilizzato per il trasferimento di articoli dalla ambiente di laboratorio alla camera anaerobica. Nell'immagine è una camera di compensazione automatica gestito tramite un controller che può essere programmato per eseguire automaticamente le procedure di vuoto e spurgo necessarie per creare un ambiente anaerobico. (C) Un acido solfidrico Colonna rimozione fornisce rimozione elevata capacità esente da manutenzione di indesiderabile idrogeno solforato. (D) Due contenitori di fan catalizzatore sonoposto in tutta la camera anaerobica per favorire la circolazione dell'atmosfera della camera attraverso il palladio catalizzatore, che, in presenza di idrogeno, rimuove l'ossigeno. La camera di anaerobico è impostato secondo le istruzioni del produttore. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. Preparazione di batteri anaerobici

Nota: P. gingivalis è aerotolleranti e può essere conservato in condizioni aerobiche, ma non crescerà in presenza di ossigeno a livelli superiori a 6% ^17,18. Una camera anaerobica è necessario per il corretto coltivazione di P. gingivalis e altre specie anaerobiche (Figura 1). È necessaria una formazione adeguata e di educazione sull'uso camera anaerobica prima di lavorare con microanaerobes ^19.

1. Equilibrare tutti i liquidi e le piastre a condiz anaerobicaioni per almeno 12 ore prima della sperimentazione per rimuovere l'ossigeno residuo.
2. Trasferimento P. gingivalis da -80 ° C freezer alla camera anaerobica, lasciate disgelo.
3. Streak P. gingivalis su piastre di agar sangue soia Trypticase (TSA II con il 5% di sangue di montone). Wrap piastre in parafilm e conservare a 37 ° C in un incubatore anaerobico per 4-7 giorni.
4. Seminare P. gingivalis in 3 ml di Brain Heart Infusion (BHI) brodo integrate con emina e menadione, un arricchiti terreni liquidi non selettivi per l'isolamento e la coltura di anaerobi e microrganismi esigenti, usando i loop sterili.
   Nota: Per la conservazione a lungo termine, mescolare colture batteriche preparate in BHI con glicerolo o DMSO (concentrazione finale 10-20%) e posto in una -80 ° C freezer.
5. Preparare una coltura starter di P. gingivalis facendo una diluizione 1:10 e permettendo ai batteri di crescere fino a metà fase di log.

Nota: La densità ottica del bacsospensione riale è determinato e la concentrazione di batteri per ogni ceppo da esaminare viene regolata. Per P. gingivalis una sospensione a OD ₆₆₀ di 0,7 corrisponde alla fase di mid-log e ~ 7 x 10 ⁸ cellule / ml. Condizioni di crescita descritte nel protocollo di cui sopra sono specifici per P. gingivalis e potrebbero dover essere adattato per altri ceppi batterici.

3. Endothelial Cell Culture

Nota: Acquisto pool HUVECs primarie e cultura a medio basale contenenti fattori di crescita endoteliale vascolare (VEGF) a 37 ° C in 5% di CO ₂ in base alle istruzioni del produttore.

1. HUVECs Seed in T-75 palloni a 2.5 x 10 ⁵ cellule / fiasco in 15 ml mezzi VEGF.
   Nota: Controllare la redditività attraverso una diluizione 1: 1 con il 4,0% trypan blu. Le cellule con una membrana compromessa manterrà trypan blu, le cellule sane con membrana è ancora intatta appariranno bianco se visti al microscopio ottico binoculare. Count 100 cellule, in modo che oltre l'80% delle cellule sono vitali ^20.
2. Sostituire i media ogni 2 giorni con pre-riscaldato supporti VEGF fresco fino a cellule raggiungono ~ 80% di confluenza.
3. Lavare le cellule una volta con PBS preriscaldata. Liberate cellule dal matraccio T75 incubando con 2 ml di tripsina-EDTA (0,25%) per 5 min seguita da soluzione neutralizzante 2 ml di tripsina.
4. Raccogliere HUVECs sospesi in un tubo da 50 ml. Lavare le cellule in più dal T-75 palloni con PBS e trasferire 50 ml provette coniche.
5. Cellule centrifugare a 200 xg per 10 min.
6. Rimuovere il surnatante, sospendere pellet cellulare in 10 ml di media VEGF pre-riscaldato.
7. Determinare la concentrazione cellulare mediante un emocitometro o un dispositivo simile conteggio delle cellule.
8. Calcola quantità di sospensione cellulare per aggiungere a uno 6-pozzetti (400.000 / pozzetto) o 12-pozzetti con coprioggetto (50.000 / pozzetto). HUVECs sarà pronto per la sperimentazione del giorno successivo.

4. La sopravvivenza Assay Invasion / Interazione(Placcatura)

Nota: Quando si esegue questo test, preparare due 6 pozzetti delle cellule endoteliali seminate a 400.000 cellule / pozzetto. Una piastra sarà utilizzato per valutare batteri attaccati da e interiorizzati da cellule ospiti. L'altra piastra rappresenterà per i batteri intracellulari. La piastra da 6 pozzetti consente triplicato di due campioni da eseguire in un esperimento. Per una descrizione di questo protocollo fare riferimento al diagramma di flusso del test di sopravvivenza (Figura 2).

1. Preparare batteri anaerobici come sopra descritto (vedi capitolo 1) fino a raggiungere una crescita mid-log (OD ₆₆₀ 0,5-0,7).
2. Batteri centrifugare a 5.000 g per 10 min.
   Nota: se centrifuga è al di fuori della camera anaerobica, trasportare i campioni batterici in un tubo ben chiuso da 15 ml, avvolgere il tappo con parafilm per evitare perdite di ossigeno.
3. Posizionare pellettato P. gingivalis indietro nella camera, scartare il surnatante. Lavare con PBS, batteri pellet di nuovo prima di risospendere in VEGF media. Preparare sospensioni per tutti i ceppi batterici da testare a OD ₆₆₀ di 0,7 che corrisponde alla fase di mid-log (~ 7 x 10 ⁸ cellule / ml). I batteri sono ora pronti per l'infezione.
4. Trasferimento 6-pozzetti contenenti HUVECs dal tessuto cultura incubatore nella camera anaerobico. Rimuovere i supporti e lavare tre volte con PBS anaerobica. Aggiungere 2 ml di media VEGF anaerobica in ciascun pozzetto e posizionare le piastre a 37 ° C in incubatore anaerobico per 20 min per equilibrare la temperatura per l'infezione.
   Nota: i batteri piastra su piastre di agar sangue per garantire quelli utilizzati per le infezioni sono omogenei e non contaminati dopo l'infezione.
5. Infect cellule ospiti con batteri ad una molteplicità di infezione (MOI batteri: host) di 100: 1.
   Nota: numero di cellule HUVEC è determinato eseguendo un test di esclusione del trypan una singola ben prima dell'infezione. Numero di cellule batteriche viene determinata mediante densità ottica (ad esempio, 0,5 OD = 5 x 10 ⁸ cellule / ml). Bconcentrazione acterial viene regolato alla corretta MOI basato sulla concentrazione HUVECs ^21.
6. Mettere 6 pozzetti con HUVECs infetti in incubatrice anaerobica e permettono ai batteri di interagire con le cellule ospiti per 30 min.
7. Preparare saponina in BHI (1,0% w / v) all'interno della camera anaerobica e filtrata attraverso un filtro da 0,2 micron.
8. La sopravvivenza di entrambi i batteri attaccati e interiorizzato.
   1. Rimuovere le piastre dal termostato, i media aspirare, lavare tre volte con anaerobica PBS e aggiungere 2 ml di filtrati 1,0% saponina (preparato come descritto al punto 4.8). Incubare per 15 minuti per consentire la lisi della cellula ospite.
   2. Raschiare fondo di ogni pozzetto con raschietto cellulare. Raccogliere la miscela di cellule da ciascun pozzetto e fare una diluizione 1: 1 in BHI.
   3. Procedere per fare diluizioni seriali del campione. A seconda delle specie batteriche e concentrazione, regolare diluizioni seriali. Iniziare con 1: 100 o 1: 1.000 diluizioni.
   4. Piatto 200 ml di diluizione desiderata su piastre di agar sangue. Wrap tegli piastre in parafilm e posto in incubatrice anaerobica a 37 ° C.
   5. A seguito di sette giorni di incubazione a 37 ° C, rimuovere le piastre e contare unità formanti colonie (CFU) utilizzando una scatola luminosa di contare manualmente colonie.
      Nota: CFU vengono enumerati. Per grandi quantità di CFU, le immagini possono essere prese e software possono essere utilizzati per facilitare l'enumerazione di CFU.
9. La sopravvivenza dei batteri interiorizzato.
   1. Rimuovere le piastre dal termostato. Lavare tre volte con PBS e anaerobica aggiungere media 2 ml di VEGF con integrate antibiotici (300 mg / ml di gentamicina e 400 ug / ml di metronidazolo).
   2. Incubare per 1 ora. Assicurati di testare gli antibiotici in modo che siano al 100% efficace nell'uccidere il ceppo batterico desiderato e fare in modo che essi non penetrano le cellule ospiti ^22,23.
   3. Aspirare il terreno, aggiungere 2 ml di filtrato 1,0% saponina. Incubare per 15 minuti per consentire la lisi della cellula ospite.
   4. Raschiare inferiore di ogni well con raschietto cellulare. Raccogliere la miscela di cellule da ciascun pozzetto e rendere diluizione 1: 1 in BHI.
   5. Preparare diluizioni seriali del campione (1: 100, 1: 1000).
   6. Piatto 200 ml di diluizione desiderata su piastre di agar sangue. Avvolgere piastre in parafilm e posto in incubatrice anaerobica.
   7. Dopo sette giorni di incubazione a 37 ° C togliere piastre e contare CFU.

Figura 2. Rappresentazione schematica di un protocollo utilizzato per la sopravvivenza dei batteri anaerobici con cellule eucariotiche. Entrambi i test per una sopravvivenza batterica totale e la sopravvivenza di batteri internalizzati possono essere eseguite contemporaneamente. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

5. internalizzazione di batteri in Ce HostLLS (Fluorescent Microscopy)

Nota: P. gingivalis è etichettato con 2 ', 7'-Bis- (2-carbossietil) -5- (e-6) -Carboxyfluorescein, acetossimetil Ester (BCECF-AM). BCECF-AM è un colorante membrana permeabile non fluorescente; la sua conversione a BCECF fluoresceina tramite l'azione di esterasi intracellulari può indicare la vitalità cellulare. P. gingivalis è etichettato con il BCECF-AM colorante e poi utilizzato per infettare le cellule eucariotiche. A seguito di infezione, le cellule vengono fissate ed etichettati con DAPI e TRITC-falloidina. La macchia DAPI utilizzato per colorare il nucleo della cellula eucariotica anche etichettare nucleo della cellula batterica, che fornisce una contromisura per identificare i batteri non vitali che non possono metabolicamente fendere BCECF-AM. Cellule ospiti sono evidenziati con TRITC-falloidina, un actina colorante rosso.

1. Coprioggetti Autoclave. Aggiungere asetticamente coprioggetti a piastre da 12 pozzetti prima della semina cellule endoteliali a 5 x ¹⁰ 4 cellule / pozzetto. (Giorno preparati prima dell'esperimento)
2. Preparare batteri anaerobici cresciuti a metà fase di log (OD ₆₆₀ = 0,5-0,7), come descritto nella sezione 1.
3. Batteri Lavare 2x con PBS anaerobica per centrifugazione a 5.000 xg e sospende pellet in PBS a 5-7 x ¹⁰ 8 cellule / ml.
4. Aggiungere 20 ml di 0,2 mM BCECF-AM a 2 ml di sospensione batterica (5-7 x 10 ⁸ cellule / ml) ad una concentrazione finale di BCECF-AM di 2 mM.
5. Incubare a 37 ° C per 30 minuti al buio.
6. Piastre di trasferimento con le cellule endoteliali seminate su 18 mm (# 1.5 spessore) lamelle circolari dal coltura tissutale incubatore nella camera anaerobico. Lavare con PBS e scambio con i media VEGF anaerobica.
   Nota: Verificare che HUVECs sono sani al microscopio ottico. HUVECs dovrebbe essere ~ 80% confluenti, morfologia dovrebbe essere paragonabile ai produttori.
7. Centrifuga etichettato batteri a5.000 xg per 10 min per rimuovere residui di colorante BCECF-AM. Sospendere in 2 ml di mezzi VEGF anaerobica.
8. Infettare le cellule ospiti con batteri etichettati a MOI di 100: 1 (batteri: host).
9. Incubare in ambiente anaerobico a 37 ° C per 30 min.
10. Dopo che le cellule lavare infezione con PBS per tre volte e fissare in preparati al momento 4,0% paraformaldeide per 10 min.
    Nota: Dopo aver fissato le cellule, esperimento può essere condotto all'esterno della camera anaerobica.
11. Lavare coprioggetto con PBS per tre volte.
12. Aggiungere 1 ml di 0,2% Triton X-100 per 10 min.
13. Lavare coprioggetto con PBS per tre volte.
14. Aggiungere 50 ml di TRITC falloidina (50 mg / ml) per vetrini per 45 min.
15. Lavare coprioggetto tre volte, togliere dal 12-pozzetti e posto su un vetrino con mezzo di montaggio morbido-set contenente DAPI. Sigillare i lati con smalto.
    Nota: vetrini possono essere conservati per un paio di mesi al buio. Evitare l'esposizione alla luce per evitare che foto-sbiancamento.
16. Vista diapositiveutilizzando un microscopio confocale.
    1. Qui, utilizzare un sistema di 34 canali spettrali (rivelatore a serie di 32 canali e due rivelatori PMT lato, oltre a un rilevatore di luce trasmessa) configurato attorno ad un AxioObserver (invertito) stare con uno stadio XY motorizzato. Il sistema dispone di cinque laser: diodo blu (405 nm), multi-linea Argon (458, 488, 514 nm), LED verde (561 nm), rosso HeNe (633 nm) e un laser pulsato 440 nm. Dotare di un sistema di imaging a vita a fluorescenza con 2 rilevatori GaAsP ibridi (per FRET-FLIM).
    2. Rileva la fluorescenza da DAPI e TRITC in un canale usando un filtro dual-band con lunghezze d'onda di eccitazione di 340-380 nm e 540-560 nm, ed un filtro per le emissioni di 435-485 nm e 570-590 nm, rispettivamente. Rileva la fluorescenza da BCECF-AM utilizzando un filtro di eccitazione con lunghezza d'onda di 440-500 nm e un filtro di emissione di 510-590 nm.
       Nota: Controlli per BCECF-AM dovrebbe essere fatto su ogni ceppo batterico in fase di studio per garantire la corretta etichettatura dei batteri vitali. In primo luogo verificare che nonviabbatteri LE sono DAPI-positivi e BCECF-negativi. In secondo luogo, in modo che batteri vivi possono metabolizzare BCECF-AM in fluoresceina BCECF. Concentrazioni variabili dei batteri o BCECF-AM dye possono avere bisogno di essere testati per l'etichettatura ottimale.

Representative Results

Protocolli di cui sopra sono stati utilizzati nello studio interazione ospite-patogeno tra P. gingivalis e cellule endoteliali. P. gingivalis W83 e un P. gingivalis V3150 portando una delezione di PG0228 stati utilizzati nello studio. Il PG0228 è previsto per codificare una proteina che può alterare i livelli di RNA e proteine, che possono incidere in definitiva interazione di P. gingivalis con cellule ospiti. Per studiare l'effetto di PG0228 su P. capacità di interagire con le cellule ospiti gingivalis s ', la capacità dei ceppi parentali e mutanti di interagire con HUVEC è stato confrontato. Il protocollo di sopravvivenza (Figura 2) è stata applicata a questo studio. Così, entrambi i ceppi sono stati coltivati ​​a fase logaritmica come indicato nel punto 2. Entrambi i ceppi avevano curve di crescita simili e quindi senza problemi significativi con normalizzazione dei numeri di cellulare prima di infezione è stato rilevato. Dopo sette giorni di incubazione, CFU sono stati osservati sul sangue unPiastre gar (Figura 3). Diverse diluizioni 1:10 (Figura 3A), 1: 100 (Figura 3C) e 1: 1000 (Figura 3B) sono state piastrate su piastre di agar sangue. Come si vede nella Figura 3A del numero di colonie erano troppo alti per valutare; le colonie erano indistinguibili tra loro e designato come "troppi per contare" [TMTC]. La diluizione in Figura 3B era troppo basso in quanto si ottengono anche alcune colonie. Le diluizioni di 1: 100 come mostrato in Figura 3C era desiderabile, le colonie sono distinguibili e il numero di colonie erano gestibili a contare. Risultati simili sono stati trovati per il ceppo mutante V3150 (Figura 3D). Così il CFU erano indicati dalle piastre con il fattore di diluizione di 1: 100.

Utilizzando il numero di CFU e il fattore di diluizione, è stato calcolato il numero stimato di batteri vitali recuperati per ogni ceppo. Dividendo il numero di viable batteri recuperati dal numero iniziale di batteri risultati in un rapporto definito come l'efficienza di invasione. Nel confrontare l'efficienza di invasione di entrambi i ceppi, wild type W83 sopravvissuto all'interno HUVECs con alta efficienza, mentre i ceppi privi PG0228 ha mostrato una significativa riduzione della sopravvivenza (Figura 4).

Per verificare ulteriormente che il difetto era dovuto alla sopravvivenza, piuttosto che ridotto internalizzazione dei batteri, è stata eseguita l'analisi di microscopia. HUVECs infettati con P. gingivalis sono stati visti al microscopio (Figura 5). In questo esempio, si è presentato HUVEC. Per determinare il numero di batteri internalizzati più immagini sono state prese a diverse distanze focali per ottenere un Z-stack consentendo l'identificazione spazio-temporale internalizzato P. gingivalis. Inoltre, almeno 40 cellule / esperimento devono essere analizzati (per ogni replica biologica) e il numero di batteri internalizzati elencate per ogni mpioggia. Se il numero di batteri internalizzati è la stessa per ogni ceppo se visti al microscopio allora entrambi i ceppi invadono HUVECs altrettanto; tuttavia, il mutante V3150 ha ridotto la capacità di sopravvivere mentre all'interno della cellula ospite come visto nel test di protezione antibiotico.

Figura 3. I risultati da un test di sopravvivenza batterica. Protocollo per la sopravvivenza dei batteri intracellulari è stato utilizzato per valutare la capacità di tipo selvaggio P. gingivalis W83 e una carente V3150 mutante in PG0228 di invadere e sopravvivere all'interno HUVECs. Batteri vitali interiorizzato sono determinate dalla visualizzazione di CFU dopo incubazione di HUVECs- P. gingivalis miscela su piastre di agar sangue per sette giorni in condizioni anaerobiche. Piastre di sangue sono immessi sul light box che aumenta il contrasto e consente una più facile conteggio del CFU. Varie diluizioni erano examined. HUVECs infettati con P. gingivalis W83 diluizione 1:10 (A), diluizione 1: 1000 (B), e diluizione 1: 100 (C). HUVECs infettati con P. diluizione gingivalis V3150. 1: 100 (D) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Confronto tra un tasso di sopravvivenza tra ceppi batterici parentali e mutanti. HUVECs sono stati infettati con wild type P. gingivalis W83 e un V3150 mutante carente in PG0228. Protocollo per la sopravvivenza come illustrato in figura 2 è stata seguita. Esperimento stata eseguita tre volte in triplicato e la media ± la deviazione standard sono rappresentati. Efficienza Invasion rappresenta sopravvissuto / batteri iniziali.* Il ceppo mutante è statisticamente significativo della sopravvivenza ridotto rispetto al ceppo di tipo W83 selvatico (P <0,05). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Esempio di analisi microscopica di P. gingivalis interiorizzati da HUVECs. HUVECs sono stati infettati con BCECF-AM marcato P. gingivalis per 30 minuti a una MOI di 100: 1 (P. gingivalis: HUVEC). Le cellule sono state fissate con paraformaldeide ed etichettati con TRITC-falloidina e DAPI. L'immagine mostra un singolo HUVEC con il nucleo (A) e F-actina (B) di colore blu e rosso, rispettivamente. La freccia indica P. gingivalis etichettati verde (C). A ima unitoge è prodotto per mostrare P. gingivalis invasione nella HUVECs (D). Le immagini sono state realizzate con microscopio a scansione confocale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Discussion

Tutti i metodi di cui sopra possono essere utilizzati per progettare saggi specifici per valutare l'interazione di batteri anaerobici con cellule eucariotiche. Tuttavia, ci sono diverse considerazioni per eseguire con successo gli esperimenti. Innanzitutto sono i ceppi microbici essere utilizzati in uno studio.

E 'fondamentale nel confronto di due ceppi sia con il saggio di sopravvivenza come anche per microscopia che sono in fase di crescita simili e raggiungono concentrazioni cellulari simili qualsiasi differenza di quanto sopra può influenzare l'efficienza di invasione ^13. Quando le curve di crescita differiscono tra due ceppi batterici, è opportuno adeguare per raggiungere infine la condivisione di modelli di crescita simili concentrazioni costanti ^{di 21.} Inoltre, i batteri dovrebbero essere dispersi in modo uniforme per evitare l'aggregazione delle cellule. Inoltre, è fondamentale selezionare antibiotici che eliminano efficacemente i batteri extracellulari. Se antibiotico scelto ha effetti deleteri sulla cellule ospiti, poiuna alternativa enzimi litici antibiotiche o possono essere usati ^24,25. Infine, ceppo eterogeneità deve essere considerato; anche se una specie può essere identificato per invadere le cellule ospiti, non ci può essere grande differenza in patogenicità da un ceppo all'altro ²⁶ e, quindi, uno studio pilota devono essere eseguiti per ogni ceppo da esaminare.

Un secondo passo fondamentale è quello di stabilire un tempo di incubazione ottimale e inoculo batterico (molteplicità di infezione [MOI] che è il numero di batteri utilizzati per infettare cellule ospiti) nella progettazione dei protocolli. Periodi di incubazione più brevi valuterà la capacità dei batteri di essere interiorizzata da cellule ospiti, mentre possono essere necessari intervalli di tempo più lunghi per determinare la sopravvivenza dei batteri, così come la replicazione intracellulare ^27. Come la sopravvivenza intracellulare dei batteri potrebbe essere influenzata dal MOI in uso, si consiglia di testare più MOI per garantire che nessun danno è stato causato alla cella che avrebbe portato alla morte delle cellule o permeabilized membrane con accesso a uccisione antibiotici dei batteri intracellulari. Dopo aver stabilito MOI e incubazione tempi necessari per rispondere alla domanda specifica viene chiesto, l'esperimento viene eseguito secondo il protocollo; tuttavia, diverse diluizioni seriali della miscela lisi cellulare-batteri eucariotiche dovrebbero essere resi. Il fattore di diluizione ottimale sarà determinato sulla base di CFU osservati. Fattori di diluizione che si traducono in piatti con 50-200 CFU sono ottimali per valutare l'efficienza della sopravvivenza. Se il conteggio CFU è troppo alta, le colonie sono indistinguibili gli uni dagli altri e diventa difficile contare manualmente ogni colonia. Se il conteggio CFU è troppo bassa, piccole deviazioni esagerano il fold change tra i ceppi in esame così come producono grandi deviazioni standard tra le repliche.

Un terzo punto critico è quello di preparare cellule ospiti che sono sani e pronti ad interagire con i batteri. Nel protocollo sopra cellule ospiti vengono coltivate separatamente utilizzando tec asettica standardhniques. L'uso di antibiotici e antimicotici in coltura tissutale può essere consigliabile, soprattutto per principianti biologi coltura cellulare. Tuttavia, prima di eseguire il test di sopravvivenza, cellule ospiti dovrebbero essere coltivate in mezzi privo di antibiotici per almeno 12 ore prima di trasferire le cellule nella camera anaerobica. Una volta all'interno della camera, media dovrebbero essere scambiati con mezzi senza antibiotico anaerobica per non incidere sulla batteri anaerobici durante l'infezione. Se esistono problemi con il collegamento di cellule ospiti di piastre di coltura di tessuto o plastica coprioggetto può essere consigliabile applicare un rivestimento adesivo, come poli-L-lisina o gelatina. Inoltre, le tecniche di rivestimento dei tessuti cultura piatti con un piano interrato di matrice prodotta naturalmente membrana simile extracellulare (ECM) possono fornire l'investigatore con più in vivo come condizioni ^28,29. Lisi cellule ospiti richiede un detergente equilibrata capace di aprire cellule ospiti senza alterarne la vitalità batterica. Anche se saponina non kbatteri malati, può inibire la crescita di alcune specie. Prima nostri studi l'effetto di saponina su P. gingivalis ceppi da utilizzare per l'analisi ospite-patogeno è stata verificata avere alcun effetto sulla loro crescita / sopravvivenza. Se i batteri sono molto sensibili ai detersivi, tra cui saponina, ripetuti cicli di congelamento o di acqua distillata possono essere utilizzati per lisare cellule ospiti con pochi danni ai batteri.

Un quarto punto critico comprende le considerazioni da prendere durante l'esecuzione degli esperimenti di microscopia. Il primo è l'uso di un colorante fluorescente per etichettare batteri da utilizzare per il protocollo microscopia. Molti metodi di etichettatura vigenti per i batteri richiedono un anticorpo primario o coloranti batterici abituali con significative limitazioni, come gli effetti tossici e lisciviazione del colorante in un ambiente dando così alta sfondo. BCECF-AM è un colorante membrana permeabile comunemente usato come indicatore fluorescente di pH intracellulare in entrambi procariota ed eucarioti ^30-32. È stato trovato per essere efficace a etichettare una gamma di batteri anaerobici in studi precedenti ^33-35. BCECF-AM solo etichettare batteri vitali in grado di esterificazione. La conversione di BCECF da intracellulari esterasi risultati in una forma fluorescente che fuoriesce dalle cellule molto più lentamente rispetto al suo composto principale. Ci sono molti coloranti fluorescenti e tecniche di colorazione che possono essere utilizzati ^36; Tuttavia, questo protocollo delinea una semplice tecnica di fissaggio / colorazione che può essere utilizzato con qualsiasi microrganismo. Inoltre, altri coloranti (TRITC-falloidina, e DAPI) vengono utilizzati per distinguere più chiaramente i confini delle cellule eucariotiche e rappresentano solo i batteri che interagiscono con le cellule ospiti.

Coloranti fluorescenti sono suscettibili di fotometabolismo e ci sono diversi antifades commerciali e mezzi di montaggio disponibili che potrebbero impedire indebolimento del segnale fluorescente ^37. Ci sono anche scelte tra hard-set di montaggio supporti unND quelli soft-set. Mentre quelle dure-set possono comportare cambiamenti significativi dell'indice refrattario così come ritiro e danni ai tessuti molli ³⁸ media-impostazione richiedono sigillanti, come smalto per unghie, per fissare il vetrino. Poi a causa di variazioni osservate tra cellule eucariotiche infette; il numero di batteri internalizzati tra cellule possono variare e quindi più celle eucariotiche deve essere utilizzato per l'analisi. Nei nostri studi, almeno quaranta cellule eucariotiche sono valutati e internalizzati batteri elencati per esperimento ^33,34. Infine, per visualizzare chiaramente singole cellule, le cellule eucariotiche usati per l'infezione non devono essere coltivate a confluenza. Esami microscopici di infezione intermedia Prevotella con cellule epiteliali mostrano preferenza per regioni specifiche della membrana della cellula ospite, e batteri non aderirebbero a siti in cui cellule epiteliali erano in contatto tra loro e non aveva lamellipodia ^39.

Il limitazione del microscopio potrebbe essere il suo basso rendimento. Così, per i dati quantitativi grandi sulla proprietà invasiva di batteri un citometria di flusso possono anche essere utilizzati ^40. Questo metodo comporta l'uso di batteri fluorescente (che può essere realizzato come descritto per i batteri da utilizzare per la microscopia) e consente lo studio più campioni in un tempo che può essere interessante per alcuni ricercatori.

Le modifiche ai due protocolli possono essere effettuate per identificare meccanismi coinvolti nel ospitante uptake cellulare dei batteri. Invasione batterica successo avviene in cinque fasi: (1) di fissaggio (2) di ingresso / internalizzazione (3) traffico (4) e la persistenza (5) ^uscita 41. Così durante l'entrata / interiorizzazione, il batterio si colloca sull'ostia e usurpa la cellula ospite per interiorizzazione attraverso la modifica di trasduzione del segnale. Inibitori metabolici selettivi possono essere aggiunti alle cellule ospiti per determinare le variazioni di segnalazione che porta all'invasione successo. PerEsempio Latrunculin, che inibisce la polimerizzazione, può essere utilizzato per studiare come citoscheletro riarrangiamento influisce internalizzazione di P. gingivalis. Anticorpi che colpiscono recettori o siRNA in grado di abbattere alcuni geni specifici delle cellule possono anche essere utilizzati per una migliore comprensione della cellula ospite segnalazione eventi coinvolti in internalizzazione batterica. Mentre tutti gli inibitori metabolici dovrebbero avere il minimo effetto complessivo sul cellule ospiti, tranne quello indagato, è importante garantire i trattamenti inibitori non hanno un effetto tossico sui batteri.

Studi futuri dovrebbero guardare per perfezionare alcune di queste tecniche, forse raggiungere un più vivo come condizione. Nell'articolo corrente, batteri o cellule ospiti sono esposti a condizioni ambientali difficili. A seconda del microrganismo, la linea cellulare, e obiettivo dell'esperimento alcuni ricercatori possono preferire per eseguire il protocollo di cui sopra in un incubatore CO _2. Tuttavia, lesione parodontales riflettono un microambiente anaerobico in cui i batteri interagiscono con l'host. Uno studio che ha esaminato le variazioni di risposta cellulare di sfidare con batteri orali sotto aerobiche contro condizioni anaerobiche ha riferito che in tensione ridotta di ossigeno (2% di ossigeno) dei batteri, ad esempio, Tannerella forsizia, P. gingivalis, P. intermedia suscitato alti livelli di IL-8 e TNF rispetto alle condizioni aerobiche ^42. La capacità delle cellule eucariotiche a sopravvivere in condizioni anaerobiche è stato confermato anche da studi che hanno esaminato la capacità delle cellule umane mesenchimali staminali, cellule staminali del follicolo dentale umane, fibroblasti gengivali umani, cellule di carcinoma gengivale, e le cellule epiteliali orali umane ^43,44,45. I nostri studi con WST-1 saggio di proliferazione delle cellule hanno mostrato che HUVECs può sopravvivere fino a 48 ore in condizioni anossiche. La decisione è stata presa per infettare le cellule nella camera anaerobica perché P. gingivalis è sensibile adlivelli di ossigeno mospheric, mentre HUVECs possono sopravvivere lunghi periodi di tempo in condizioni anaerobiche. La ricerca futura esaminerà attuazione di dispositivi di coltura cellulare micro-fluidico che forniscono ossigeno ad una superficie di un monostrato (come un'arteria) e condizioni anaerobiche all'altra ^46. Queste condizioni modo non saranno sacrificati per batteri o ospite dopo l'infezione. In sintesi, descritto sono alcune semplici protocolli che possono essere usati per esaminare interazione ospite-patogeno per i batteri anaerobici. Questi protocolli sono stati utilizzati anche per valutare l'effetto di internalins batterici, proteine ​​che promuovono l'invasione batterica ^40, così come i batteri non invasivi surrogate che esprimono una proteina che conferisce proprietà invasivo sui batteri ^47.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vinyl Anaerobic Chamber-Type B	Coy Laboratory Products		Model 2000 incubator
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood	BBL	221261
Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool	LifeLine Technology	FC-0044
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Technology	LL-0003
TrypKit	LifeLine	LL-0013
Saponin	Riedel-de Haen	16109
Gentamicin Sulfate Salt	Sigma-Aldrich	G-1264
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M-3761
BCECF-AM	LifeTechnologies	B1150
TRITC Phalloidin	Sigma-Aldrich	P1951
18 mm Circular Coverslips	Electron Microscopy Sciences	72222-01
VectaShield Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200