Abstract
혐기성 박테리아는 지금까지와 같은 창자, 입 및 질만큼 인간의 틈새에서 성균보다 많다. 또한, 혐기성 감염은 일반적이고 자주 원주민 출신이다. 인간의 세포에 침입하는 일부 혐기성 병원균의 능력은 그들에게 선천성 면역을 탈출뿐만 아니라 숙주 세포의 행동을 조절하는 적응 대책을 제공합니다. 그러나, 혐기성 세균이 문제를 일으킬 수 사건 조사 실험 도중 라이브임을 보장. 포피로 모나스 진지의, 그램 음성 혐기성는 진핵 비 식세포 다양한 침입 할 수있다. 이 문서에서는 성공적으로 문화와는 P.의 능력을 평가하는 방법에 대해 설명합니다 진지 발리는 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를)을 침공. 두 개의 프로토콜이 개발되었다 : 하나는 성공적 침입 숙주 내에서 생존 및 다른 숙주 세포와 상호 작용하는 박테리아를 시각화 할 수있는 박테리아를 측정하기 위해. 이러한 기술은 처남의 사용을 필요robic P. 공급 챔버 최적 성장 혐기성 환경 진지 발리.
제 1 프로토콜은 주로 박테리아 숙주 세포의 침윤을 연구하는 데 사용되는 항생제 보호 분석에 기초한다. 그러나, 항생제 보호 분석법은 제한된다; 항생제 치료 및 숙주 세포 용해 다음 배양 세포 내 박테리아 만이 측정된다. 살아있는 및 죽은 모두 숙주 세포와 상호 작용하는 모든 세균을 평가하기 위해, 우리는 호스트 병원체 상호 작용을 조사하기 위해 형광 현미경을 사용하는 프로토콜을 개발했다. 박테리아 형광, 2 '와 7'- 비스 - (2- 카르복시 에틸)에 표시되어 -5- (및 -6) -carboxyfluorescein 아세 톡시 메틸 에스터 (BCECF-AM) 및 혐기성 조건 하에서 진핵 세포를 감염시키기 위해 사용된다. 0.2 % 트리톤 X-100과 파라 포름 알데히드 및 투과성으로 함께 고정 다음, 숙주 세포는 각각 세포 골격과 핵 라벨을 TRITC의 팔로이 딘 및 DAPI로 라벨링된다. 여러 IMA다른 초점 (Z-스택)에서 촬영 GES는 박테리아의 시간적 공간적 시각화를 얻을 수있다. 이 연구에서 사용되는 방법은 경작 혐기성 및 진핵 세포 유형에 적용될 수있다.
Introduction
혐기성 박테리아는 인체의 거의 모든 표면에 정착. 산소 농도가 낮은 장과 비뇨 생식기 책자의 식물에서 우세하지만, 그들은 또한 피부, 입, 코, 목의 1에 높은 수준으로 존재한다. 혐기성 박테리아는 내인성 감염의 흔한 원인이며, 자주 병에 걸린 사이트에서 격리됩니다. 그러나, 그들의 까다로운 성격, 혐기성 격리하고 문화 어려울 수 있습니다. 혐기성 박테리아를 포함하는 연구는 제한된 조건에서 수행해야합니다. 현대 혐기성 배양 기술은 연구자가 많은 혐기성 실험 균주 또는 임상 분리 2,3을 연구하는 데 필요한 혐기성 설정을 모방 할 수 있습니다.
병원성 혐기성 세균들이 거주하는 숙주 세포와 동적 관계 공진화를 개발했다. 대부분의 혐기성는 infecti에 도달하기 전에 호스트 면역 반응에 의해 살해에 민감하다OU에 수준. 그러나 일부 병원성 박테리아로부터 탈출 또는 숙주 면역 반응을 파괴하는기구를 개발했다. 그들은 이러한 면역 인식, 면역 매개 물질의 중화, 세포 매개 면역의 변경, 숙주 세포의 침윤, 4 신호 면역의 변경의 회피로 메커니즘을 통해이 목표를 달성. 포피 gingivalis에 모두 구강과에 연루 그람 음성 혐기성를 구외 질환, 호스트 5-7 병원성 변화를 일으킬 수있는 매우 적합 세균성 병원체의 일례이다.
생물막 플라크의 포켓은 대기 산소 (8)로부터 보호되는 혐기성 박테리아를 정박 할 수있는 치아와 치은 점막 조직 사이에 형성된 깊은 틈새에서 발생한. 이러한 치주 포켓은 피 등 다양한 혐기성 병원균에 대한 틈새 시장의 역할 진지 발리 (9). P. 진지 발리는 리모델링 할 수있는 키스톤 병원균이다치주 질환 (10)의 발생과 진행을 촉진 방법으로 구강 미생물 커뮤니티를 보내고. 이는 호스트 단백질의 광범위한 스펙트럼에 대해 활성 및 숙주 방어 11 회피 메커니즘을 제공 독성 인자의 대량 생산. 또한, 시험 관내 및 생체 내 12-14 15 상피, 내피, 섬유 아세포, 및 치주 인대 세포에 침입 할 수있다. 효과적으로 피를 숙주 세포에 침입하여 진지 발리는 호스트 면역을 탈출 할 수 있습니다. 숙주 세포의 효과적인 침략뿐만 아니라 박테리아가 숙주 방어를 탈출 할 수 있습니다뿐만 아니라 미래에 다시 감염에 대한 저수지 역할뿐만 아니라 숙주 세포를 변경합니다. 숙주 세포에 의해 부착 및 세균 내면화에 관여하는 분자 메커니즘의 연구가 필요하다. 여러 실험실에서 연구 P.의 국제화와 관련된 분자 이벤트를 이해에 초점을 맞추고 숙주 세포에 의해 진지 발리뿐만 아니라 억제하고 면역 반응을 납치하고 적대적인 호스트 방어 메커니즘을 생존하는 데 사용되는 메커니즘으로.
식별 및 숙주 세포에 침입 할 수있는 병원체의 특성을 분석 할 수있는 많은있다. 이 산소없이 부피 악기에 의존 연구를 수행하는 것은 곤란하다 때문에, 혐기성 병원균 관내 연구는 주로 많은 실험적 연구 문제를 제기. 이는 진핵 세포 성장에 산소를 필요로하며, 따라서 조직 배양 인큐베이터에서 별도로 준비되어야한다는 사실에 의해 복잡해진다. 그러한 장애물을 피할 수있는 한 가지 방법은 산소 분위기 하에서 조사를 수행하는 것,하지만 혐기성 박테리아의 성장이 불가능하게된다. 또 다른 방법은 감염 숙주 세포의 상호 작용을 연구하기 위해 열 살해 박테리아를 사용하는 것이다. 그러나 차이는 호스트 병원체 interacti의 관련성을 감소 열 명이 사망하고 실행 가능한 박테리아 사이에 존재16. 그것은 숙주 세포와의 상호 작용 변경되지 않은 표현으로 가능한 박테리아를 연구하는 중심; 피를 배양 따라서 방법 혐기성 환경에서 진지 발리가 제공됩니다. 또한, 간단한 두 비용 효율적인 프로토콜 P.의 능력을 평가하기위한 입증되고 진지 발리는 인간 제대 정맥 내피 세포 (HUVECs를)에 의해 내면화한다. 제 1 프로토콜은 인기 항생제 보호 분석에 기초한다. 분석이 간단하지만, 혐기성 미생물을 이용한 고려 주어진다. 제 2 프로토콜은 상호 작용 시각화 형광 주사 현미경의 사용을 필요로하며, P. 내재화 진지 발리. 각 분석은 한계 및 혐기성 세균의 침입을 연구 연구자에게 개요를 제공하도록 설명되는 장점을 갖는다. 현재 원고는 피를 연구했지만 HUVECs를 진지 발리 및 이러한 프로토콜뿐만 아니라 다른 많은 혐기성 세균에 대해 사용될 수있다숙주 세포의 다른 유형에도.
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Protocol
다음 프로토콜은 혐기성 종, 경찰에 의해 침략을 배양하고 연구하는 방법을 설명합니다 진지 발리; 그러나, 이들 프로토콜은 혐기성 병원균에 사용될 수있다. HUVECs를 사용하고 있지만,이 프로토콜은 면역 및 비 면역 다른 진핵 세포 모두에 사용될 수있다.
1. 혐기성 상공 회의소 사용 및 유지 보수
참고 : P. gingivalis에이 주변 공기에서 발생하는 산소의 정상 수준에 민감 혐기성이다. 제어 혐기성 환경은 P.의 재배에 매우 중요합니다 진지 발리.
- 여기서, 무산소 혼합 가스 (80 % N 2, 10 % H 2, 2~10 %의 CO) 비닐 혐기 챔버에서 (도 1a)로 지정 인공 분위기를 유지한다. 혐기성 챔버 실험실 환경에서 항목을 전송하기위한 에어 록 (그림 1B)를 사용합니다. 에어 록 수동 TW를 운영혼합 된 혐기성 가스를 도입하기 전에 N2 가스와 얼음 퍼지.
- 바람직 황화수소 무보수 제거 황화수소 제거 칼럼 (도 1C)를 사용한다. 촉매에 의해 생성 된 O H 2를 제거하고 오염의 확산을 촉진 에어로졸을 방지하기 위해 챔버 내에서 제습기를 놓습니다.
주 : 황화수소 많은 혐기성 세균의 천연 대사 부산물 및 축적은 세균에 독성이고 가전 손상되고, 촉매의 수명을 감소시킬 수있다. - 수소의 존재 (그림 1D)에서 산소를 제거하는 팔라듐 촉매를 통해 챔버의 분위기를 순환 팬 상자를 사용합니다.
참고 : 순환 대기 (HEPA) 필터는 0.22 μm의 또는 더 큰 크기로 공기 중 오염 물질을 제거합니다. - 혐기성의 내부에 위치하는 37 ° C 배양기에서 배양 혐기성 세균방. 혐기성 챔버 내부에서 작업 할 때 표준 무균 기술을 사용합니다.
그림 1. 혐기성 비닐 챔버와 그 구성 요소. (A) 대기 중 산소로부터 완전히 밀봉 된 비닐 혐기성 챔버는 한 번에 (32 X 78 년) 두 개인 작업 공간을 제공합니다. 그것은 (다시 중간) 37 ℃로 설정 인큐베이터가 포함되어 있습니다. (B)는 에어 록 혐기성 챔버로 실험실 환경에서 상품의 전달을 위해 사용된다. 사진은 자동적으로 혐기성 환경을 조성하기 위해 필요한 진공 및 퍼지 절차를 수행하도록 프로그램 될 수있는 제어기를 통해 작동 자동 출입구이다. (C) 황화수소 제거 컬럼은 바람직 황화수소 무보수 고용량 제거를 제공한다. (D)는 두 촉매 팬 박스 아르수소의 존재 하에서, 산소를 제거하고, 팔라듐 촉매를 통해 챔버의 대기를 순환하기 위해 혐기 챔버에 걸쳐 두었다. 혐기성 챔버는 제조업체의 지침에 따라 설정됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
혐기성 박테리아 2. 준비
참고 : P.을 진지 발리는 aerotolerant이고 호기성 조건에서 저장 될 수 있지만, 6 % (17, 18)보다 높은 수준의 산소의 존재하에 성장하지 않을 것이다. 혐기성 챔버의 P. 적절한 배양에 필요한 진지 발리와 다른 혐기성 종 (그림 1). 혐기성 실 사용에 대한 적절한 훈련과 교육은 microanaerobes 19을 사용하기 전에 필요합니다.
- 혐기성 CONDIT 모든 액체 매체와 판 평형적어도 12 시간 이전에 실험에 이온이 잔류 산소를 제거합니다.
- P. 이동 혐기성 챔버 -80 ° C의 냉동고에서 진지 발리는 해동을 할 수 있습니다.
- 킬 P. (TSA II 5 % 양 혈액) 트립 티카 간장 혈액 한천 플레이트에 진지 발리. 4~7일에 대한 혐기성 배양기에서 37 ℃에서 파라 필름과 가게에서 판을 바꿈.
- P. 접종 3 ㎖ 뇌 심장 주입에 진지 발리는 (BHI) 국물은 멸균 루프를 사용하여, 헤민와 메나 디온, 혐기성과 까다로운 미생물의 분리 및 문화에 대한 풍부한 비 선택적 액체 매체와 보충.
주 : 장기 저장을 위해, -80 ° C의 냉동고에 글리세롤 또는 DMSO (10 내지 20 %의 최종 농도) 및 장소 BHI 준비 박테리아 문화를 섞는다. - P.의 스타터 문화를 준비 1:10 희석을하고 박테리아가 중반 로그 단계까지 성장 할 수 있도록하여 진지 발리.
참고 : 혈중 알코올 농도의 광학 밀도를박테 리아 현탁액을 판정하고 피검 각 균주 박테리아 농도를 조정한다. 피하십시오 진지 발리 미드 로그 상 및 7 ~ 8 × 106 세포 / mL를 0.7 OD (660)의 대응에 현탁. 프로토콜에 설명 된 성장 조건은 위의 피에 대한 특정 진지 발리와는 다른 균주에 적응해야 할 수도 있습니다.
3. 내피 세포 배양
주 : 매입은 제조업체의 지시에 따라 5 % CO 2에서 37 ° C에서 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)를 포함하는 기본 배지에서 일차 배양 된 HUVECs 및 풀링.
- 15 ml의 VEGF 미디어 2.5 × 10 5 세포 / 플라스크에 T-75 플라스크에 씨앗 된 HUVEC.
참고 : 4.0 % 트리 판 블루 (1) 희석 : 1을 통해 가능성을 확인합니다. 양안 광 현미경으로 볼 때 트리 판 블루를 유지합니다 손상된 세포막과 세포, 양막 건강한 세포는 흰색 나타납니다. COUN세포의 80 % 이상이 20 가능한 지 확인, 100 세포를 톤. - 세포가 ~ 80 % 포화 상태에 도달 할 때까지 예열 신선한 VEGF 매체와 미디어를 2 일마다 교체합니다.
- 미리 예열 PBS로 한 번 세포를 씻으십시오. 2 ㎖의 트립신 중화 솔루션 다음 5 분 동안 2 ㎖의 트립신 EDTA (0.25 %)와 함께 배양하여 T75 플라스크에서 세포를 해방.
- 50 ML 원뿔 튜브 중단 된 HUVEC를 수집합니다. PBS로 T-75 플라스크에서 여분의 세포를 씻어 내고 50 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 10 분 동안 200 XG에 원심 분리기 세포.
- , 뜨는을 제거 10ml를 미리 예열 VEGF 미디어에서 세포 펠렛을 일시 중지합니다.
- 혈구 세포 또는 유사한 계산 장치를 이용하여 세포 농도를 결정.
- (50,000 / 웰) 된 커버와 6 웰 플레이트 (400,000 / 웰) 또는 12 웰 플레이트 중 하나에 추가 세포 현탁액의 양을 계산합니다. HUVECs를 다음날 실험을위한 준비가 될 것입니다.
4. 생존 분석 침략 / 상호 작용(도금)
참고 :이 분석을 수행 할 때, / 잘 400,000 세포에 접종 내피 세포의 두 6 웰 플레이트를 준비합니다. 하나의 판에 부착 된 박테리아 및 숙주 세포에 의해 내재화를 평가하기 위해 사용될 것이다. 다른 판은 세포 내 세균을 설명합니다. 두 샘플의 삼중 한 실험에서 수행하는 6- 웰 플레이트는 허용한다. 이 프로토콜의 개요는 생존 분석 흐름도 (그림 2)를 참조하시기 바랍니다.
- 그들이 중반 로그 성장 (OD 660 0.5-0.7)에 도달 할 때까지 (제 1 참조) 상기 한 바와 같이 혐기성 박테리아를 준비합니다.
- 원심 분리기 박테리아 10 분 동안 5,000 XG에.
원심 분리기는 챔버 외부 혐기성 인 경우, 15 mL의 밀봉 된 튜브에서 세균 시료를 운반 산소 누출을 방지하기 위해 파라 필름으로 뚜껑을 감싸는 참고. - 펠렛 P. 배치 gingivalis에 다시 실, 상층 액을 버린다. VEGF 나에 재현 탁 전에 다시 PBS로 펠렛 박테리아를 씻어디아. 모든 균주가 중반 로그 단계 (~ 7 × 10 8 세포 / ml)에 해당하는 0.7의 OD 660에서 테스트 할 수 있도록 현탁액을 준비합니다. 박테리아는 현재 감염에 대한 준비가되어 있습니다.
- 혐기성 챔버로 조직 문화 인큐베이터에서 된 HUVEC를 포함하는 전송 6 웰 플레이트. 용지를 제거하고 혐기성 PBS로 3 회 세척한다. 각 웰에 혐기성 VEGF 미디어 2 ㎖를 추가하고 감염에 대한 온도를 평형 20 분 동안 혐기성 배양기에서 37 ° C에서 접시를 놓습니다.
참고 : 감염에 사용되는 것을 보장하기 위해 혈액 한천 플레이트에 플레이트 박테리아가 균일 감염에 오염되지 않습니다. - 100 : 감염 다중의 박테리아 숙주 세포 (숙주 박테리아 MOI) 감염 1.
주 : HUVEC 세포 수는 감염 전에 단일 웰에 트리 판 제외 테스트를 수행하여 결정된다. 박테리아 세포의 수는 (0.5 = 5 × 10 8 세포 / ㎖의 OD, 예) 광학 밀도를 통해 결정된다. 비acterial 농도는 HUVEC를 농도 (21)에 기초하여 적절한 방어로 조정된다. - 혐기성 배양기에 감염된 HUVECs를 6 웰 플레이트를 놓고 세균이 30 분 동안 숙주 세포와 상호 작용 할 수 있습니다.
- 비에이치 아이에 사포닌 혐기성 챔버 내부와 0.2 μm의 필터를 통해 필터링 (/ V W 1.0 %)을 준비합니다.
- 모두 부착 내면화 박테리아의 생존.
- , 인큐베이터, 흡 매체에서 플레이트를 제거 혐기성 PBS로 3 회 세척하고 2 ㎖를 (단계 4.8에 기재된 바와 같이 제조) 1.0 %의 사포닌을 추가 여과. 숙주 세포 용해를 허용하도록 15 분 동안 배양한다.
- 세포 스크레이퍼 잘 각각의 바닥을 쳤어요. 각 웰의 세포 혼합물을 수집하고는 1 : 비에이치 아이 1 희석.
- 샘플의 일련 희석을 진행합니다. 박테리아 종과 농도에 따라, 연속 희석을 조정합니다. (1) 시작 : 100 또는 1 : 1,000 희석.
- 혈액 한천 플레이트에 원하는 희석 200 μl를 접시. 랩 T37 ° C에서 혐기성 배양기에서 파라 필름과 장소에서 그가 판.
- 37 ° C에서 배양 7 일 후, 플레이트를 제거하고 수동으로 식민지를 계산하는 라이트 박스를 이용하여 콜로니 형성 단위 (CFUs)를 계산합니다.
참고 : CFUs이 열거되어있다. CFUs의 대량 들어, 화상이 촬영 될 수 있고, 컴퓨터 소프트웨어 CFUs의 열거를 용이하게하기 위해 사용될 수있다.
- 내면화 된 박테리아의 생존.
- 인큐베이터에서 접시를 제거합니다. 혐기성 PBS로 3 회 세척하고 보충 항생제 (겐타 마이신 300 μg의 / ㎖과 메트로니다졸 400 ㎍ / ml)로 2 ml의 VEGF 미디어를 추가 할 수 있습니다.
- 1 시간 동안 품어. 그들이 원하는 균주를 죽이는 100 % 효과가 있으므로 항생제를 테스트하고 그들이 숙주 세포 (22, 23)을 관통하지 않는 것이 있는지 확인해야합니다.
- 대기음 매체는 필터링 1.0 % 사포닌 2 ㎖를 추가합니다. 숙주 세포 용해를 허용하도록 15 분 동안 배양한다.
- 각 아의 바닥을 쳤어요세포 스크레이퍼와 L. 각 우물에서 세포 혼합물을 수집하고는 1 : 비에이치 아이 1 희석.
- 샘플 (: 100, 1 : 1,000 1)의 연속 희석을 준비합니다.
- 혈액 한천 플레이트에 원하는 희석 200 μl를 접시. 혐기성 배양기에서 파라 필름과 장소에 판을 바꿈.
- 37 °에서 배양 7 일 후 판을 제거하고 CFUs를 계산 C.
그림 2. 진핵 세포와 혐기성 세균의 생존을 위해 사용되는 프로토콜의 도식 표현. 총 세균의 생존과 내면화 박테리아의 생존을위한 두 가지 분석을 동시에 수행 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
호스트 세륨에 박테리아의 5 내면화LLS (형광 현미경)
참고 : P.을 gingivalis에, 2 '로 7'- 비스 -로 표시되는 (2- 카복시 에틸) -5- (및 -6) -Carboxyfluorescein, 아세 에스터 (BCECF-AM). BCECF-AM은 비 형광 막 투과성 염료이다; 세포 내 에스 테라 제의 작용을 통해 형광 BCECF에의 변환은 세포 생존 능력을 표시 할 수 있습니다. 피를 진지 발리는 BCECF-AM 염료로 표지 한 후 진핵 세포를 감염하는 데 사용됩니다. 감염 후, 세포를 고정하고 DAPI와 TRITC-팔로이 딘으로 표시. 진핵 세포의 핵을 염색하는데 사용 DAPI 염색은 또한 대사되지 쪼개짐 BCECF-AM 수 비 생존 박테리아를 식별 할 대응책을 제공하는 박테리아 세포 핵을 레이블링한다. 호스트 세포 TRITC-팔로이 딘, 빨간색 굴지 염료로 강조 표시됩니다.
- 오토 클레이브 된 커버. 무균 / 웰 5 × 10 4 세포에서 내피 세포를 파종하기 전에 12 웰 플레이트로 된 커버를 추가합니다. (실험 전 준비 일)
- 제 1 절에 설명 된대로 중반 로그 단계로 성장 혐기성 세균 (= 0.5-0.7 OD 660)를 준비합니다.
- 워시 박테리아는 5,000 XG에 원심 분리 및 5-7 × 10 8 세포 / ml에서 PBS에 펠렛을 일시 중단하여 혐기성 PBS로 2 배.
- 2 μM의 BCECF-AM의 최종 농도 세균 현탁액 (5-7 X 108 세포 / ml) 2 ㎖에 0.2 mM의 BCECF-AM의 20 μL를 추가한다.
- 어둠 속에서 30 분 동안 37 ° C에서 품어.
- 혐기성 챔버로 조직 문화 인큐베이터에서 18mm (# 1.5 두께) 원형 된 커버에 시드 내피 세포와 전송 플레이트. PBS 및 혐기성 VEGF 매체과의 교류로 씻으십시오.
참고 : HUVECs를 가벼운 현미경 건강 있는지 확인합니다. HUVEC를 80 %의 합류는, 형태는 제조 업체와 비교해야한다 ~해야한다. - 원심 분리기 표시 박테리아10 분 동안 5,000 XG 잔류 BCECF-AM 염료를 제거합니다. 2 ml의 혐기성 VEGF 매체에서 일시 중단합니다.
- 1 (세균 : 호스트) (100)의 MOI에서 표지 된 박테리아 숙주 세포를 감염시킨다.
- 30 분 동안 37 ℃의 혐기성 챔버에서 배양한다.
- 및 PBS로 3 회 감염 세척 세포 후 10 분 동안 새로 제조 4.0 % 파라 포름 알데히드에 고정합니다.
주 : 세포를 고정 후, 실험을 혐기 챔버 밖에서 실시 할 수있다. - 워시는 PBS로 3 회 된 커버.
- 10 분 동안 0.2 % 트리톤 X-100 1 ㎖를 추가한다.
- 워시는 PBS로 3 회 된 커버.
- 45 분 동안 커버 슬립에 TRITC의 팔로이 딘 (50 μg의 / ㎖)의 50 μl를 추가합니다.
- 워시는 DAPI를 포함하는 소프트 세트 장착 매체와 슬라이드에 12 웰 플레이트와 장소에서 제거, 세 번 된 커버. 매니큐어 측면을 밀봉합니다.
참고 : 슬라이드 어둠 속에서 몇 달 동안 저장 될 수있다. 사진 표백을 방지하기 위해 빛의 노출을 피하십시오. - 보기 슬라이드공 초점 현미경을 사용.
- 여기서, (반전) AxioObserver 주위 구성된 34 채널 분광 시스템 (32 채널 어레이 검출기와 두 개의 측면 PMT 검출기, 플러스 전송 된 광 검출기) 전동 XY 스테이지 스탠드를 사용합니다. 파란색 다이오드 (405 ㎚), 멀티 라인 아르곤 (458, 488, 514 ㎚), 녹색 다이오드 (561 ㎚), 빨간색 헬륨 네온 (633 ㎚) 및 440 nm의 펄스 레이저 :이 시스템은 다섯 레이저를 보유하고 있습니다. (FRET-FLIM 용) 2 하이브리드 하나로 이루어질 탐지기 형광 수명 이미징 시스템을 착용.
- 3백40부터 3백80까지 nm 내지 5백40에서 5백60까지 nm의 각각 4백35부터 4백85까지 nm 내지 5백70에서 5백90까지 nm 인 발광 필터의 여기 파장을 가진 듀얼 - 밴드 필터를 사용하여 하나의 채널에 DAPI와 TRITC에서 형광을 검출한다. 4백40에서 5백까지 나노 미터의 여기 파장 및 5백10에서 5백90까지 nm 인 발광 필터와 필터를 사용 BCECF-AM에서 형광을 검출한다.
참고 : 모든 균주에 수행해야 BCECF-AM에 대한 제어하는 실행 가능한 박테리아의 적절한 라벨을 보장하기 위해 연구되고있다. 먼저 nonviab을 확인제작 박테리아는 DAPI 양성 및 BCECF 음성이다. 둘째, 살아있는 박테리아가 형광 BCECF에 BCECF-AM을 대사 할 수 있는지 확인합니다. 세균이나 BCECF-AM 염료의 변수 농도는 최적의 라벨 검사를해야 할 수도 있습니다.
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Representative Results
위에서 설명한 프로토콜 (P) 사이에 호스트 병원체 상호 작용을 연구에 사용 된 진지 발리와 내피 세포. P. 진지 발리 W83 및 P. PG0228의 삭제를 수행 진지 발리 V3150이 연구에 사용 하였다. PG0228 궁극적 P.의 상호 작용에 영향을 미칠 수있는 RNA와 단백질의 레벨을 변경할 수 단백질을 인코딩하도록 예측되고 숙주 세포와 진지 발리. 경찰에 PG0228의 효과를 알아보고자 진지 발리의 숙주 세포와 상호 작용하는 능력 된 HUVEC와 상호 작용하는 부모 및 돌연변이 균주의 능력을 비교 하였다. 생존 프로토콜 (도 2) 본 연구에 적용 하였다. 두 균주 따라서 비슷한 성장 곡선 및 감염 이전에 발생 된 세포 수의 정상화와 더 큰 문제가 있었다 2 단계에 설명 된대로 따라서, 두 균주는 대수 단계로 성장시켰다. 배양 7 일 후, CFUs는 혈액에서 관찰되었다갈치 판 (그림 3). 여러 희석 1시 10분 (도 3a), 1 : 100 (도 3c) 및 1 : 1,000 (도 3b) 혈액 아가 플레이트 상에 플레이 팅 하였다. 도 3a에서 알 수있는 바와 같이, 콜로니의 수가 너무 높은 평가 하였다; 식민지 [TMTC] "를 계산하기 위해 너무 많은"로 서로 지정에서 식별 할 수없는했다. 그림 (b)의 희석도 몇 식민지가 얻어 너무 낮았다. 1의 희석 : 식민지 식별하고 식민지의 수를 계산하기 위해 관리했다으로 100도 3c에 도시는 바람직했다. 유사한 결과가 돌연변이 균주 V3150 (그림 3D)에 대한 발견되었다. 따라서 CFUs 1의 희석 배수와 플레이트에서 열거 하였다 : 100.
CFUs의 수 및 희석 배수를 사용하여, 각 균주에 대해 회수 된 박테리아의 생존 예상 개수를 계산 하였다. viabl 수 나누는내습 효율로 정의 비율 박테리아 결과의 초기 번호로 회수 E 박테리아. 두 균주의 침입의 효율을 비교할 때, 야생형 W83은 PG0228 결여 균주 반면 (도 4)의 생존에 현저한 감소를 보였다, 고효율로 된 HUVEC에서 살아 남았다.
더 결함이 생존보다는 박테리아의 감소 국제화로 인해되었는지 확인하려면, 현미경 분석을 실시 하였다. HUVECs를 피 감염 진지 발리는 현미경 (그림 5)에서 볼 수 있었다. 이 예에서, 하나의 HUVEC 제시된다. 내재화 된 박테리아의 수를 결정하기 위해 복수의 화상은 내재화 P.의 시공간 식별을 가능하게 Z-스택을 얻기 위해 서로 다른 초점 거리에서 촬영 한 진지 발리. 또한, 적어도 40 세포 / 실험 (각 생물학적 복제에 대한) 분석을 위해 각 세인트 열거 내재화 균수되어야비. 현미경으로 보면 내재화 균수가 각 스트레인에 대해 동일한 경우 모두 동일 균주 침입 된 HUVEC; 그러나, 돌연변이 체는 항생제 V3150 보호 분석에서와 같이 숙주 세포 내 동안 생존하는 능력을 감소시켰다.
박테리아 생존 분석 3. 결과 도표. 프로토콜을 세포 내 박테리아의 생존을 위해 야생형 P.의 능력을 평가하는 데 사용 된 진지 발리 W83과 PG0228의 돌연변이 V3150 결핍이 침입 된 HUVEC에서 살아남을 수 있습니다. 내면화 가능한 박테리아는 HUVECs- P.의 배양 다음 CFUs의 시각화에 의해 결정된다 혐기성 조건에서 이레 동안 혈액 아가 플레이트에 진지 발리 혼합물. 혈액 플레이트는 대비를 증가시키고 CFUs 쉽게 계산이 가능 라이트 박스에 배치됩니다. 다양한 희석 전이었다amined. HUVECs를 피 감염 진지 발리 W83 희석 1시 10분 (A), 희석 1 : 1000 (B), 및 희석 1 : 100 (C). HUVECs를 피 감염 진지 발리 V3150 희석 1 :. 100 (D) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
부모와 돌연변이 균주 사이. HUVECs를 생존율 그림 4. 비교는 야생형 (P)에 감염되었다 진지 발리 W83과 PG0228 결핍 돌연변이 V3150. 그림 2에 설명 된대로 생존을위한 프로토콜 하였다. 실험은 3 회 반복 세 번 수행하고 표준 편차 ± 평균이되게됩니다. 침략 효율 / 초기 박테리아를 살아냅니다.야생형 W83 균주 (P <0.05)에 비해 * 돌연변이 균주가 생존을 통계적으로 유의 한 감소시켰다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
P.의 현미경 분석 그림 5. 예 HUVECs를. HUVECs를 내재화 진지 발리는 BCECF-AM에 감염된 피를 표시 1 (P. 진지 발리 : HUVEC) (100)의 MOI에서 30 분 동안 진지 발리. 세포는 파라 포름 알데히드로 고정 TRITC-팔로이 딘과 DAPI으로 표시했다. 이미지는 핵 (A)와 각각 청색과 적색 염색 F 액틴 (B)와 하나의 HUVEC를 나타낸다. 화살표를 표시 P. 진지 발리는 녹색 (C)를 표시. 병합 된 IMAGE는 P.을 보여주기 위해 제작 HUVECs를 (D)에 진지 발리 침공. 이미지가 스캐닝 공 초점 현미경을 사용하여 제작 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
위의 모든 방법들은 진핵 세포와 혐기성 세균의 상호 작용을 평가하기위한 특정 분석법을 설계하는데 사용될 수있다. 그러나 성공적으로 실험을 수행 할 수있는 몇 가지 고려 사항이 있습니다. 먼저 실험에 사용되는 균주이다.
그것은 그들이 유사한 성장 단계에 있으며 침입 효율 (13)에 영향을 미칠 수있는 전술의 차이와 유사한 세포 농도를 달성한다는 생존 분석 모두 두 균주의 비교뿐만 아니라 현미경 분석에 의해 결정적이다. 성장 곡선은 두 균주 서로 다른 경우, 조정은 궁극적으로 일관된 농도 21 공유 유사한 성장 패턴을 달성하기 위해 만들어 져야한다. 또한, 박테리아 세포 응집을 피하기 위해 균일하게 분산되어야한다. 또한, 박테리아 세포를 효과적으로 제거하는 항생제를 선택하는 것이 중요하다. 항생제 선택은 숙주 세포에 악영향을 가지고 있다면다른 항생제 또는 용균 효소 (24, 25)을 사용할 수있다. 마지막으로, 변형 이질성이 고려되어야한다; 종 숙주 세포에 침입하는 식별 될 수 있지만,도 26에 또 다른 하나의 변형에서 병원성에 중요한 차이가있을 수 있고, 따라서 파일럿 연구는 각각의 변형을 조사하기 위해 수행되어야한다.
초 임계 공정 프로토콜을 설계 할 때 (숙주 세포를 감염시키기 위해 사용 된 박테리아의 수는 감염의 다중성 [MOI]) 최적의 배양 시간 및 박테리아 접종원을 확립하는 것이다. 짧은 배양 기간이 긴 시간 포인트 박테리아 생존뿐만 아니라 세포 내 복제 (27)를 결정하기 위해 필요할 수있는 반면 박테리아의 능력은 숙주 세포에 의해 내재화 될 평가할 것이다. 박테리아의 세포 내 생존이 방어에 의해 영향을받을 수 사용하고, 그것은 세포에 손상이 세포 사멸 또는 permeabiliz으로 이어질 것이라고 발생되지 않았 음을 확인하기 위해 여러 MOIs을 테스트하는 것이 가장 좋습니다ED는 세포 내 박테리아의 항생제 살해에 액세스 할 수있는 막. 요청을 받고 특정 질문에 대답하는 데 필요한 관성 모멘트 및 배양 시간을 설정 한 후, 실험 프로토콜에 따라 실행됩니다; 그러나, 진핵 세포 세균 용해 액의 여러 연속 희석이 이루어져야한다. 최적의 희석은 관찰 CFUs 인자에 기초하여 결정될 것이다. 50-200 CFUs와 플레이트 초래할 희석 요인 생존 효율을 평가하기에 최적이다. CFU 카운트가 너무 높은 경우, 콜로니를 서로 식별 할 수없는이며 수동 각 콜로니를 계산하는 것이 곤란해진다. CFU 카운트가 너무 낮 으면, 작은 편차 균주 사이 배 변화가 검사되고 과장뿐만 아니라 복제간에 큰 표준 편차를 생성한다.
세 번째 중요한 점은 건강하고 박테리아와 상호 작용 할 준비가 숙주 세포를 준비하는 것입니다. 상기 프로토콜에서 숙주 세포를 개별적으로 표준 무균 TEC를 사용하여 배양된다hniques. 조직 배양에서 항생제와 항진균제의 사용은 특히 초보자 세포 배양 생물 학자에 대한 것이 바람직 할 수있다. 그러나, 생존 분석을 수행하기 전에, 숙주 세포는 혐기 챔버에 세포를 전달하기 전에 최소 12 시간 동안 항생제가없는 배지에서 배양한다. 감염시 혐기성 세균에 충돌하지 않도록으로 일단 챔버 내부, 미디어는 혐기성 항생제 무료 매체와 교환해야한다. 문제는 플라스틱 조직 배양 플레이트에 숙주 세포의 부착과 함께 존재하거나 커버 슬립 경우는 폴리 -L- 라이신 또는 젤라틴과 같은 접착제 코팅을 적용하는 것이 바람직 할 수있다. 또한, 자연적으로 생성 된 기저막과 같은 세포 외 기질 (ECM)와 코팅 조직 문화 요리에 대한 기술 조건 28, 29 등의 생체 내 이상과 연구자를 제공 할 수 있습니다. 숙주 세포를 용해하는 것은 박테리아 생존력을 변경하지 않고 개방 숙주 세포 가능한 세제 균형을 필요로한다. 사포닌은 케이하지는 않지만세균 병, 그것은 어떤 종의 성장을 억제 할 수있다. 경찰에 사포닌의 우리의 연구에 앞서 효과 진지 발리 그들의 성장 / 생존에 영향을 미치지 않음을 확인 하였다 호스트 병원체 해석에 사용하는 균주. 박테리아 사포닌 포함한 세제, 매우 민감한 경우, 반복 된 동결 - 해동 사이클 또는 증류수 세균에 약간의 손상에 숙주 세포를 용해시키기 위하여 사용될 수있다.
네 번째 중요한 점은 현미경 실험을 수행 할 때 고려 사항이 촬영 될이 포함되어 있습니다. 제 현미경 프로토콜에 사용되는 박테리아에 레이블 형광 염료의 사용이다. 박테리아에 대한 많은 현재의 표시 방법은 차 항체 또는 독성 효과 때문에 높은 배경을주고 주변에 염료의 침출과 같은 중요한 제한과 관습 세균 염료를 필요로한다. BCECF-AM은 일반적으로 원핵 생물과 진핵 생물 (30-32)를 모두 세포 내 pH를 지표로 사용하는 형광 막 투과성 염료. 이는 이전의 연구 33-35에서 혐기성 세균의 범위 라벨링에 효과적인 것으로 밝혀졌다. BCECF-AM은 에스테르 화 할 수있는 실행 가능한 박테리아 레이블을 것입니다. 변환은 모 화합물보다 훨씬 더 천천히 세포 밖으로 새어 형광 형태로 세포 내 에스 테라 결과에 의해 BCECF합니다. 많은 형광 염료 (36)를 사용할 수있다 염색 기술이있다; 그러나,이 프로토콜은 거의 모든 미생물을 사용할 수있는 간단한 고정 / 염색 기법을 설명합니다. 또한, 다른 염료 (TRITC-팔로이 딘, 및 DAPI)을보다 명확하게 숙주 세포와 상호 작용 만 박테리아 및 진핵 세포 계정의 경계를 구별하기 위해 사용된다.
형광 염료는 사진 표백에 취약하고 형광 신호 (37)의 약화를 방지 할 수있다 사용할 수있는 여러 가지 상업 antifades 및 설치 매체가있다. 미디어를 장착 하드 집합 사이의 선택이있다ND 것들을 소프트 설정합니다. 하드 설정 사람이 중요한 내화물 지수의 변화뿐만 아니라 수축 및 조직 손상 (38)이 발생할 수 있지만 소프트 설정 용지가 커버 슬립을 확보하기 위해, 같은 매니큐어로 밀봉을 필요로합니다. 그리고 감염된 진핵 세포 사이에 관찰 된 변화로 인해; 다를 수 있으므로 여러 세포 진핵 세포 사이 내재화 균수는 해석에 사용한다. 우리의 연구에서, 적어도 마흔 진핵 세포는 실험 33, 34 당 열거 박테리아를 평가하고, 내장되어 있습니다. 마지막으로, 명확하게 하나의 세포를 시각화, 감염에 사용 진핵 세포 합류로 성장하지 않아야합니다. 상피 세포가 Prevotella intermedia에 감염 현미경 검사는 숙주 세포막의 특정 지역에 대한 선호도를 보였고, 박테리아는 상피 세포가 서로 접촉 하였다 더 lamellipodia 39 없었다 사이트에 부착하지 않았다.
L현미경의 모방은 낮은 처리량이 될 수 있습니다. 따라서, 세균의 침입 속성 유동 세포 계측법에 대규모의 정량적 인 데이터 (40)에도 사용될 수있다. 이 방법은 형광 표지 된 세균을 사용 (현미경에 사용되는 박테리아에 대해 기재된 바와 같이 그 달성 될 수 있음)와 관련된 몇몇 연구자 매력적일 수도 한번에 여러 샘플을 연구 할 수 있습니다.
두 개의 프로토콜들에 대한 변경은 세균 숙주 세포 흡수에 관여하는 경로를 식별 할 수있다. 성공적인 세균의 침입은 다섯 단계에서 발생한다 : (1) 첨부 파일 (2) 항목 / 국제화 (3) 매매 (4) 지속성 (5) 출구 (41). 따라서 입 / 내재화 중에, 박테리아는 호스트에 자신의 위치를 정하고 신호 전달을 통해 수정 내재화에 대한 숙주 세포를 가로채는. 선택적 대사 억제제는 성공적인 내습 선도 신호의 변화를 결정하기 위해 숙주 세포에 첨가 할 수있다. 에 대한액틴의 중합을 억제 예를 들어 latrunculin은, 경찰의 국제화에 미치는 영향을 세포 골격의 재 배열 연구하는 데 사용할 수 있습니다 진지 발리. 세포 특이 수용체 또는 특정 유전자를 넉다운시킬의 siRNA를 표적 항체는 박테리아의 내재화에 관련된 이벤트를 시그널링 숙주 세포의 더 나은 이해를 위해 사용될 수있다. 모든 대사 억제제 제외한 숙주 세포에 최소한의 전체적인 효과를 가져야 조사되고 있지만, 세균에 독성이없는 억제제 치료를 보장하는 것이 중요하다.
앞으로의 연구는 아마도, 이러한 기술의 일부를 완벽한 상태와 같은 생체 내에서 더 많은 것을 달성하기 위해 보일 것이다. 현재 기사에서는, 중 세균이나 숙주 세포는 열악한 환경에 노출되어있다. 실험의 유기체, 세포주, 및 목표에 따라 일부 연구자들은 CO 2 인큐베이터에서 상기 프로토콜을 수행하는 것을 선호 할 수있다. 그러나, 치주 병소S는 박테리아가 호스트와 상호 작용하는 무산소 미세 환경을 반영한다. 세포 반응의 변화는 혐기성 조건 대 호기성에서 구강 세균에 도전하기 위해 조사 연구는보고 된 예 감소 산소 장력 (2 % 산소) 박테리아, Tannerella의 개나리, 경찰에서 gingivalis에, 그리고 P. 인터 호기성 조건 (42)에 비해 IL-8 및 TNFα 높은 수준을 유도. 혐기성 조건에서 살아 남기 진핵 세포의 능력은 인간 중간 엽 줄기 세포, 인간 치과 모낭 줄기 세포, 인간 치은 섬유 아세포, 치은 암종 세포, 인간의 구강 상피 세포 43,44,45의 능력을 조사 연구에 의해 확인 하였다. WST-1 세포 증식 분석을 사용하여 우리의 연구는 HUVECs를이 무산소 조건에서 최대 48 시간 동안 생존 할 수 있음을 보여 주었다. 결정은 P. 때문에 혐기성 챔버에서 세포를 감염되었다 진지 발리는에 민감하다mospheric 산소 농도는 HUVEC를 혐기성 조건에서 장시간 견딜 수있다. 앞으로의 연구는 다른 46 (동맥 등) 단층 및 혐기성 조건 중 하나의 표면에 산소를 제공하는 마이크로 유체 세포 배양 장치의 구현을 조사한다. 이 방법의 조건은 세균이나 감염에 따라 호스트 중 하나를 희생하지 않습니다. 요약하면, 혐기성 세균에 대한 숙주 - 병원체 상호 작용을 조사하기 위해 사용될 수있는 몇 가지 간단한 프로토콜을 설명한다. 이러한 프로토콜은 또한 세균의 침입 (40)뿐만 아니라 박테리아 (47)에 속성을 부여 침습 단백질을 발현 대리 비 침습성 세균을 촉진 internalins 세균성 단백질의 효과를 평가하기 위해 사용되어왔다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vinyl Anaerobic Chamber-Type B | Coy Laboratory Products | Model 2000 incubator | |
| TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | BBL | 221261 | |
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool | LifeLine Technology | FC-0044 | |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Technology | LL-0003 | |
| TrypKit | LifeLine | LL-0013 | |
| Saponin | Riedel-de Haen | 16109 | |
| Gentamicin Sulfate Salt | Sigma-Aldrich | G-1264 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M-3761 | |
| BCECF-AM | LifeTechnologies | B1150 | |
| TRITC Phalloidin | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 18 mm Circular Coverslips | Electron Microscopy Sciences | 72222-01 | |
| VectaShield Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Hentges, D. J. The Anaerobic Microflora of the Human Body. Clin. Infect. Dis. 16 (4), S175-S180 (1993).
- Willis, A. T. Anaerobic bacteriology: clinical and laboratory practice. , (2014).
- Wren, M. W., Baldwin, A. W., Eldon, C. P., Sanderson, P. J. The anaerobic culture of clinical specimens: a 14-month study. J. Med. Microbiol. 10 (1), 49-61 (1977).
- Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41 (3), 188-202 (2008).
- Mayrand, D., Holt, S. C. Biology of asaccharolytic black-pigmented Bacteroides species. Microbiol. Rev. 52 (1), 134-152 (1988).
- Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Life below the gum line: pathogenic mechanisms of Porphyromonas gingivalis. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (4), 1244-1263 (1998).
- Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Microbial etiological agents of destructive periodontal diseases. Periodontol. 2000. 5 (1), 78-111 (1994).
- Listgarten, M. A. Structure of the microbial flora associated with periodontal health and disease in man. A light and electron microscopic study. J. Periodontol. 47 (1), 1-18 (1976).
- Ximénez-Fyvie, L. A., Haffajee, A. D., Socransky, S. S. Comparison of the microbiota of supra- and subgingival plaque in health and periodontitis. J. Clin. Periodontol. 27 (9), 648-657 (2000).
- Darveau, R. P., Hajishengallis, G., Curtis, M. A. Porphyromonas gingivalis as a potential community activist for disease. J. Dent. Res. 91 (9), 816-820 (2012).
- Holt, S. C., Kesavalu, L., Walker, S., Genco, C. A. Virulence factors of Porphyromonas gingivalis. Periodontol. 2000. 20 (1), 168-238 (1999).
- Lamont, R. J., Yilmaz, öZ. In or out: the invasiveness of oral bacteria. Periodontol. 2000. 30 (1), 61-69 (2002).
- Lamont, R. J., et al. Porphyromonas gingivalis invasion of gingival epithelial cells. Infect. Immun. 63 (10), 3878-3885 (1995).
- Belton, C. M., Izutsu, K. T., Goodwin, P. C., Park, Y., Lamont, R. J. Fluorescence image analysis of the association between Porphyromonas gingivalis and gingival epithelial cells. Cell. Microbiol. 1 (3), 215-223 (1999).
- Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
- Kaufmann, S. H. Immunity to intracellular bacteria. Annu. Rev. Immunol. 11 (1), 129-163 (1993).
- Diaz, P., Rogers, A. The effect of oxygen on the growth and physiology of Porphyromonas gingivalis. Oral Microbiol. Immunol. 19 (2), 88-94 (2004).
- Lewis, J. P., Iyer, D., Anaya-Bergman, C. Adaptation of Porphyromonas gingivalis to microaerophilic conditions involves increased consumption of formate and reduced utilization of lactate. Microbiology. 155, 3758-3774 (2009).
- Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. J. Vis. Exp. (79), e50787 (2013).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr. Protoc. Immunol. , (2001).
- Koch, A. L., Crandall, M. Photometric measurement of bacterial growth. The American Biology Teacher. 30 (6), 481-485 (1968).
- Wikins, T. D., Holdeman, L. V., Abramson, I. J., Moore, W. E. Standardized single-disc method for antibiotic susceptibility testing of anaerobic bacteria Antimicrob. Agents Chemother. 1 (6), 451-459 (1972).
- Bauer, A. W., Kirby, W. M., Sherris, J. C., Turck, M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. Am. J. Clin. Pathol. 45 (4), 493-496 (1966).
- Mandell, G. L. Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics. J. Clin. Invest. 52 (7), 1673-1679 (1973).
- Menzies, B. E., Kourteva, I. Internalization of Staphylococcus aureus by endothelial cells induces apoptosis. Infect. Immun. 66 (12), 5994-5998 (1998).
- Naito, M., et al. Determination of the genome sequence of Porphyromonas gingivalis strain ATCC 33277 and genomic comparison with strain W83 revealed extensive genome rearrangements in P. gingivalis. DNA Res. 15 (4), 215-225 (2008).
- Goebel, W., Kuhn, M. Bacterial replication in the host cell cytosol. Curr. Opin. Microbiol. 3 (1), 49-53 (2000).
- Gospodarowicz, D. III C. Extracellular matrix and control of proliferation of vascular endothelial cells. J. Clin. Invest. 65 (6), 1351-1364 (1980).
- DeQuach, J. A., et al. Simple and high yielding method for preparing tissue specific extracellular matrix coatings for cell culture. PloS One. 5 (9), e13039 (2010).
- Sellers, J. R., Cook, S., Goldmacher, V. S. A cytotoxicity assay utilizing a fluorescent dye that determines accurate surviving fractions of cells. J. Immunol. Methods. 172 (2), 255-264 (1994).
- Van Veen, H. W., et al. Generation of a proton motive force by the excretion of metal-phosphate in the polyphosphate-accumulating Acinetobacter johnsonii strain 210A. J. Biol. Chem. 269 (47), 29509-29514 (1994).
- Jackson, V. N., Halestrap, A. P. The kinetics, substrate, and inhibitor specificity of the monocarboxylate (lactate) transporter of rat liver cells determined using the fluorescent intracellular pH indicator, 2',7'-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein. J. Biol. Chem. 271 (2), 861-868 (1996).
- He, J., et al. Role of Porphyromonas gingivalis FeoB2 in metal uptake and oxidative stress protection. Infect. Immun. 74 (7), 4214-4223 (2006).
- Anaya-Bergman, C., et al. Porphyromonas gingivalis ferrous iron transporter FeoB1 influences sensitivity to oxidative stress. Infect. Immun. 78 (2), 688-696 (2010).
- Ueshima, J., et al. Purification, gene cloning, gene expression, and mutants of Dps from the obligate anaerobe Porphyromonas gingivalis. Infect. Immun. 71 (3), 1170-1178 (2003).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. JoVE. (79), (2013).
- Cordes, T., Maiser, A., Steinhauer, C., Schermelleh, L., Tinnefeld, P. Mechanisms and advancement of antifading agents for fluorescence microscopy and single-molecule spectroscopy. Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (14), 6699-6709 (2011).
- Pawley, J. Handbook of biological confocal microscopy. , (2010).
- Gursoy, U., Könönen, E., Uitto, V. Prevotella intermedia ATCC 25611 targets host cell lamellipodia in epithelial cell adhesion and invasion. Oral Microbiol. Immunol. 24 (4), 304-309 (2009).
- Sengupta, D., et al. Interaction of Prevotella intermedia strain 17 leucine-rich repeat domain protein AdpF with eukaryotic cells promotes bacterial internalization. Infect. Immun. 82 (6), 2637-2648 (2014).
- Reyes, L., Herrera, D., Kozarov, E., Roldán, S., Progulske-Fox, A. Periodontal bacterial invasion and infection: contribution to atherosclerotic pathology. J. Clin. Periodontol. 40, S30-S50 (2013).
- Grant, M. M., et al. Oxygen tension modulates the cytokine response of oral epithelium to periodontal bacteria. J. Clin. Periodontol. 37 (12), 1039-1048 (2010).
- Biedermann, A., Kriebel, K., Kreikemeyer, B., Lang, H. Interactions of Anaerobic Bacteria with Dental Stem Cells: An In Vitro Study. PloS One. 9 (11), e110616 (2014).
- Kriebel, K., Biedermann, A., Kreikemeyer, B., Lang, H. Anaerobic Co-Culture of Mesenchymal Stem Cells and Anaerobic Pathogens-A New In Vitro Model System. PloS One. 8 (11), e78226 (2013).
- Peyyala, R., Kirakodu, S. S., Novak, K. F., Ebersole, J. L. Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses. Cytokine. 58 (1), 65-72 (2012).
- Halldorsson, S., Lucumi, E., Gòmez-Sjöberg, R., Fleming, R. M. Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices. Biosens Bioelectro. 63, 218-231 (2015).
- Iyer, D., et al. AdpC is a Prevotella intermedia 17 leucine-rich repeat internalin-like protein. Infect. Immun. 78 (6), 2385-2396 (2010).
