Porphyromonas gingivalis som modellorganism för att bedöma Interaktion av anaeroba bakterier med värdceller

Abstract

Anaeroba bakterier långt fler än aerober i många humana nischer såsom tarmen, mun och vagina. Dessutom anaeroba infektioner är vanliga och ofta av inhemskt ursprung. Förmågan hos vissa anaeroba patogener att invadera humana celler ger dem anpassningsåtgärder att fly medfödd immunitet samt att modulera värdcellbeteende. Men se till att anaeroba bakterier är levande under experimentell utredning av händelserna kan utgöra utmaningar. Porphyromonas gingivalis, en gramnegativ anaerob, är i stånd att invadera en mängd olika eukaryota icke-fagocytiska celler. Den här artikeln beskriver hur man framgångsrikt kultur och bedöma förmågan hos P. gingivalis att invadera humana navelvenendotelceller (HUVEC). Två protokoll utvecklades: ett för att mäta bakterier som framgångsrikt kan invadera och överleva i värden, och den andra för att visualisera bakterier interagerar med värdceller. Dessa tekniker nödvändiggör användningen av en AnaeRobic kammare att leverera P. gingivalis med en anaerob miljö för optimal tillväxt.

Det första protokollet är baserat på den antibiotiska skyddsanalys, som till stor del används för att studera invasion av värdceller av bakterier. Emellertid är antibiotikumet skyddsanalysen begränsad; endast intracellulära bakterier som är odlingsbara efter antibiotikabehandling och värdcell lys mäts. För att bedöma alla bakterier interagerar med värdceller, både levande och döda, har vi utvecklat ett protokoll som använder fluorescerande mikroskopi för att undersöka värdpatogen interaktion. Bakterier fluorescent märkt med 2 ', 7'-bis- (2-karboxietyl) -5- (och-6) -karboxifluorescein acetoximetylester (BCECF-AM) och användes för att infektera eukaryotiska celler under anaeroba förhållanden. Efter fixering med paraformaldehyd och permeabilisering med 0,2% Triton X-100, är ​​värdceller märktes med TRITC falloidin och DAPI att märka cell cytoskelettet och kärnan, respektive. Multipel imaGES tagna vid olika fokuspunkter (Z-stack) erhålls för temporal-spatial visualisering av bakterier. Metoder som används i denna studie kan tillämpas på alla odlingsbara anaerob och vilken eukaryot celltyp.

Introduction

Anaeroba bakterier koloniserar nästan alla ytor av människokroppen. Även dominerar i floran av tarm och urogenitala regionerna där syrehalterna är låga, de finns också på höga nivåer på huden, mun, näsa och hals ^1. Anaeroba bakterier är en vanlig orsak till endogena infektioner och ofta isolerade från sjuka ställen. Emellertid på grund av sin kräsna natur kan anaerober vara svårt att isolera och kultur. Studier med anaeroba bakterier måste göras på begränsade villkor. Moderna anaerob-odlingstekniker tillåter forskare att efterlikna de anaeroba inställningar som krävs för att studera många anaeroba laboratoriestammar eller ens kliniska isolat ^2,3.

Patogena anaeroba bakterier har utvecklat en dynamisk relation och co-evolution med värdcellerna där de är bosatta. De flesta anaerober är mottagliga för avlivning av värdimmunsvar innan infectigare nivåer. Men vissa patogena bakterier utvecklat mekanismer för att fly från eller undergräva värdens immunsvar. De uppnå detta mål genom mekanismer som undvikande av immunigenkänning, neutralisering av immunmediatorer, förändring av cellmedierad immunitet, invasion av värdceller, och ändring av immun signalering ^4. Porphyromonas gingivalis, en gramnegativ anaerob inblandad i både tal och extraorala sjukdomar, är ett exempel på en mycket anpassad bakteriell patogen som kan orsaka patogena förändringar i värden ^5-7.

Fickor av biofilm plack upplupna i djupa sprickor bildas mellan tänderna och tandkötts slemhinnevävnaden kan hysa anaeroba bakterier som är skyddade från atmosfäriskt syre ^8. Dessa tandköttsfickor fungera som en nisch för olika anaeroba patogener, såsom P. gingivalis ^9. P. gingivalis är en keystone-patogen som är i stånd att ombyggnadsing den orala mikrobiella på ett sätt som främjar utvecklingen och utvecklingen av parodontala sjukdomar ^10. Den producerar ett stort antal virulensfaktorer som är aktiva mot ett brett spektrum av värdproteiner och innehåller mekanismer för försvårande av värdförsvar ^11. Det är också i stånd att invadera epitel-, endotel-, fibroblastiska, och parodontala ligamentceller in vitro ^12-14 och in vivo ^15. Genom att effektivt invadera värdceller, P. gingivalis kan undkomma värdimmunitet. Effektiv invasion av värdceller inte bara gör det möjligt för bakterien att undkomma värdförsvar, men också fungerar som en reservoar för framtida återinfektion samt förändrar värdcellen. Det krävs Studier av de molekylära mekanismer som är involverade i vidhäftning och internalisering av bakterien av värdceller. Forskning inom flera laboratorier är inriktad på att förstå de molekylära händelser i samband med internalisering av P. gingivalis av värdcellernaliksom de mekanismer som används för att undertrycka och kapa immunsvaret och överleva de fientliga värdens försvarsmekanismer.

Det finns många analyser som kan identifiera och karakterisera patogener som har förmåga att invadera värdceller. Men studier med anaeroba patogener in vitro utgör många experimentella problem för forskaren främst eftersom det är svårt att genomföra studier som förlitar sig på skrymmande instrument i frånvaro av syre. Detta förvärras av det faktum att eukaryota celler kräver syre för att växa och därmed måste framställas separat i vävnadskultur inkubatorer. Ett sätt att undvika sådana hinder skulle vara att utföra de studier under atmosfärs syre, men som skulle göra tillväxten av anaeroba bakterier omöjligt. En annan metod skulle vara att använda värmeavdödade bakterier att infektera och studera värd-cell-interaktioner. Det finns dock skillnader mellan värmeavdödade och livskraftiga bakterier som minskar relevansen av värdpatogen interactipå ^16. Det är centralt att studera livskraftiga bakterier med oförändrad uttryck interagerar med värdceller; därför, metoder för odling av P. gingivalis i en anaerob miljö ges. Dessutom är två enkla kostnadseffektiva protokoll visat för att bedöma förmågan hos P. gingivalis att internaliseras av mänskliga navelvenendotelceller (HUVEC). Det första protokollet är baserad på den populära antibiotikaskyddsanalys. Även om analysen är enkel, är överväganden vid användning av anaeroba mikroorganismer ges. Det andra protokollet kräver användning av en fluorescerande svepmikroskop för att visualisera interagera och internaliserad P. gingivalis. Varje analys har sina begränsningar och fördelar som kommer att diskuteras för att förse forskaren en kontur för att studera invasivitet av anaeroba bakterier. Även om den nuvarande manuskriptet studerar P. gingivalis och HUVEC, kan dessa protokoll användas för många andra anaeroba bakterier samtsom för andra typer av värdceller.

Protocol

Följande protokoll beskriver metoder för odling och studera invasion av anaeroba arter, P. gingivalis; emellertid kan dessa protokoll användas för ett antal anaeroba patogener. Även HUVECs används, kan detta protokoll användas för andra eukaryota celler både immuna och icke-immuna.

1. anaerob kammare Användning och underhåll

Obs: P. gingivalis är en anaerob känslig för normala nivåer av syre förekommer i luften. En kontrollerad anaerob miljö är avgörande för odling av P. gingivalis.

1. Här, upprätthålla en artificiell atmosfär som betecknas som blandad anaerob gas (80% N _2, 10% _{H2, 10%} CO2) i en vinyl anaerob kammare (Figur 1A). Använd en luftsluss (Figur 1B) för att överföra objekt från laboratoriemiljö till den anaeroba kammaren. Luftslussen fungerar manuellt twis spolning _med N2 gas innan man inför den blandade anaerob gas.
2. Använd en vätesulfid avlägsnande kolonn (Figur 1C) för underhållsfritt avlägsnande av den oönskade vätesulfid. Placera en avfuktare i kammaren för att avlägsna _H2O skapats av katalysatorn och för att undvika aerosoler som underlättar spridningen av föroreningar.
   Obs: Vätesulfid är en naturlig metabolisk biprodukt av många anaeroba bakterier och dess ackumulering är giftigt för bakterier och kan resultera i skador på elektroniken och minska livslängden för en katalysator.
3. Använd en fläkt låda att cirkulera kammarens atmosfären genom en palladiumkatalysator, som avlägsnar syre i närvaro av väte (figur 1D).
   Anmärkning: En recirkulerande atmosfärs (HEPA) filter avlägsnar luftburna föroreningar med en storlek av 0,22 ^ m eller större.
4. Kultur anaeroba bakterier i en 37 ° C inkubator som är placerade inne i den anaerobakammare. Använd sedvanlig aseptisk teknik när du arbetar inuti anaerob kammare.

Figur 1. Anaerob vinyl kammaren och dess komponenter. (A) En vinyl anaerob kammare tätad helt från atmosfäriskt syre ger arbetsyta för två personer åt gången (32 tum x 78 tum). Den innehåller en inkubator inställd på 37 ° C (tillbaka mitten). (B) En luftsluss används för överföring av artiklar från labbmiljö till den anaeroba kammaren. På bilden är en automatisk luftsluss drivs genom en regulator som kan programmeras för att automatiskt utföra vakuum och avluftningsprocedurer behövs för att skapa en anaerob miljö. (C) En svavelväte Removal Kolumn ger underhållsfri hög kapacitet avlägsnande av oönskad svavelväte. (D) Två katalysatorfläktlådor ärplacerade i hela den anaeroba kammaren för att cirkulera kammarens atmosfären genom palladiumkatalysator, vilken, i närvaro av väte, avlägsnar syre. Den anaerob kammare är inställd enligt tillverkarens anvisningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. Framställning av anaeroba bakterier

Obs: P. gingivalis är aerotolerant och kan lagras i aeroba förhållanden men det kommer att växa i närvaro av syre vid högre nivåer än 6% ^17,18. En anaerob kammare är nödvändig för en korrekt odling av P. gingivalis och andra anaeroba arter (Figur 1). Ordentlig utbildning på anaerob kammare användning krävs innan du börjar arbeta med microanaerobes ^19.

1. Jämvikta alla flytande medier och plattor till anaerob conditjoner i åtminstone 12 h före experimentet för att avlägsna kvarvarande syre.
2. Överför P. gingivalis från -80 ° C frys anaerob kammare, låt tina.
3. Serie P. gingivalis på Trypticase soja blodagarplattor (TSA II med 5% fårblod). Wrap plattorna i parafilm och förvara vid 37 ° C i en anaerob inkubator under 4-7 dagar.
4. Inokulera P. gingivalis i 3 ml hjärna-hjärta-infusion (BHI) buljong kompletterad med hemin och menadion, ett anrikat icke-selektiva flytande medier för isolering och odling av anaeroba och svårodlade mikroorganismer, med användning av sterila loopar.
   Anmärkning: För långtidsförvaring, blanda bakteriekulturer framställda i BHI med glycerol eller DMSO (10-20% slutlig koncentration) och placera i en -80 ° C frys.
5. Bered en startkultur av P. gingivalis genom att göra en 1:10 utspädning och låta bakterier att växa fram till mitten av log-fasen.

Obs: Den optiska densiteten hos bacrial suspensionen bestäms och bakteriekoncentrationen för varje stam som skall undersökas justeras. För P. gingivalis en suspension vid OD ₆₆₀ av 0,7 motsvarar mitten av log-fasen och ~ 7 x 10 ⁸ celler / ml. Tillväxtbetingelser som beskrivs i protokollet ovan är specifika för P. gingivalis och kan behöva anpassas för andra bakteriestammar.

3. Endothelial Cell Culture

Obs: Inköp poolade primära HUVEC och kultur i basalmedium innehållande vaskulära endoteliala tillväxtfaktorer (VEGF) vid 37 ° C i 5% CO ₂ i enlighet med tillverkarens instruktioner.

1. Seed HUVEC i T-75 flaskor på 2,5 x 10 ⁵ celler / kolv i 15 ml VEGF media.
   Obs: Kontrollera lönsamheten via en 1: 1 utspädning med 4,0% trypanblått. Celler med en komprometterad membran kommer att behålla trypanblått, kommer friska celler med intakta membran visas vita när den visas med en kikare ljusmikroskop. CounT 100-celler, se till att över 80% av cellerna är viabla ^20.
2. Byt media varje 2 dagar med förvärmda frisk VEGF media tills cellerna når ca 80% konfluens.
3. Tvätta cellerna en gång med förvärmda PBS. Befria cellerna från T75-flaska genom att inkubera med 2 ml trypsin-EDTA (0,25%) under 5 minuter följt av 2 ml trypsin neutraliserande lösning.
4. Samla suspenderade HUVEC i en 50 ml koniska rör. Tvätta ut några extra celler från T-75 flaskor med PBS och överför till 50 ml koniska rör.
5. Centrifugera cellerna vid 200 xg under 10 min.
6. Avlägsna supernatanten, suspendera cellpelleten i 10 ml förvärmda VEGF media.
7. Bestäm cellkoncentrationen med hjälp av en hemocytometer eller liknande cellräkning enhet.
8. Beräkna mängden cellsuspension för att lägga till antingen 6-brunnars platta (400 tusen / brunn) eller 12-brunnar med täckglas (50 tusen / brunn). HUVECs kommer att vara redo för experiment nästa dag.

4. Överlevnads analys Invasion / Interaktion(Plating)

Obs: När du utför denna analys, förbereda två 6-brunnsplattor av endotelceller sådda på 400.000 celler / brunn. En platta kommer att användas för att bedöma bakterier fästa till och internaliserats genom värdceller. Den andra plattan kommer att stå för intracellulära bakterier. 6-brunnar tillåter triplikat av två prover som skall utföras i ett experiment. För en beskrivning av detta protokoll hänvisas till överlevnadsanalys flödesschemat (Figur 2).

1. Förbered anaeroba bakterier som beskrivits ovan (se avsnitt 1) tills de når mitten av log tillväxt (OD ₆₆₀ 0,5-0,7).
2. Centrifugera bakterier vid 5000 xg under 10 min.
   Obs: Om centrifug är utanför anaerob kammare, bär bakterieprover i en tätt tillsluten 15 ml rör, linda locket med parafilm för att förhindra syreläckage.
3. Placera pellete P. gingivalis tillbaka i kammaren, kassera supernatanten. Tvätta med PBS, pellets bakterier igen innan det blandas i VEGF migdiam. Förbered suspensioner för alla bakteriestammar som skall testas vid OD ₆₆₀ av 0,7, som motsvarar mitten av log-fasen (~ 7 x 10 ⁸ celler / ml). Bakterierna är nu redo för infektion.
4. Överför 6-brunnars plattor innehållande HUVEC från vävnadsodlingsinkubator i anaerob kammare. Ta bort media och tvätta tre gånger med anaerob PBS. Tillsätt 2 ml av anaerob VEGF media till varje brunn och placera plattorna vid 37 ° C i den anaeroba inkubator under 20 min för att få samma temperatur för infektion.
   Obs: Plate bakterier på blodagarplattor för att säkerställa de som används för infektion är homogen och inte förorenats vid infektion.
5. Infektera värdceller med bakterier vid en infektionsmultiplicitet (MOI bakterier: värd) av 100: 1.
   Obs: HUVEC cellantalet bestäms genom att utföra en trypan uteslutningstest på ett enda långt före infektion. Antal bakterieceller, bestäms via optisk densitet (t.ex. OD av 0,5 = 5 X 10 ⁸ celler / ml). Bacterial koncentration justeras till korrekt MOI baserat på HUVEC koncentration ^21.
6. Placera 6-brunnars plattor med smittade HUVEC i anaerob inkubator och tillåta bakterier att interagera med värdceller under 30 min.
7. Förbered saponin i BHI (1,0% vikt / volym) inuti den anaeroba kammaren och filtrera genom ett 0,2 pm filter.
8. Överlevnad av både fästa och internaliserade bakterier.
   1. Avlägsna plattorna från inkubatorn, aspirera mediet, tvätta tre gånger med anaerob PBS och tillsätt 2 ml filtrerat 1,0% saponin (framställd såsom beskrivs i steg 4,8). Inkubera i 15 min för att medge värd cellys.
   2. Skrapa botten av varje brunn med cellskrapa. Samla cellblandningen från varje brunn och göra en 1: 1 spädning i BHI.
   3. Fortsätt att göra serieutspädningar av provet. Beroende på bakteriearter och koncentration, justera serieutspädningar. Börja med ett: 100 eller 1: 1000 utspädningar.
   4. Plate 200 pl önskade utspädningen på blodagarplattor. Wrap than plattor i parafilm och plats i den anaeroba inkubator vid 37 ° C.
   5. Efter sju dagars inkubation vid 37 ° C, ta bort plattorna och räkna kolonibildande enheter (CFU) med användning av en ljuslåda för att manuellt räkna kolonier.
      Obs: CFU räknas. För större mängder av CFU, kan bilderna tas och programvara kan användas för att underlätta uppräkning av CFU.
9. Överlevnad av internaliserade bakterier.
   1. Ta plattor från inkubatorn. Tvätta tre gånger med anaerob PBS och tillsätt 2 ml VEGF-media med kompletterade antibiotika (300 | ig / ml gentamicin och 400 ug / ml av metronidazol).
   2. Inkubera i en timme. Var noga med att testa antibiotika så att de är 100% effektiv på att döda den önskade bakteriestam och se till att de inte tränger värdceller ^22,23.
   3. Aspirera media, tillsätt 2 ml filtrerat 1,0% saponin. Inkubera i 15 min för att medge värd cellys.
   4. Skrapa botten av varje well med cellskrapa. Samla cellblandningen från varje brunn och göra en: 1 spädning i BHI.
   5. Förbered spädningar av provet (1: 100, 1: 1000).
   6. Plate 200 pl önskade utspädningen på blodagarplattor. Wrap plattorna i parafilm och plats i anaerob inkubatorn.
   7. Efter sju dagars inkubation vid 37 ° C avlägsna plattorna och räkna CFU.

Figur 2. Schematisk bild av ett protokoll som används för överlevnad av anaeroba bakterier med eukaryota celler. Båda analyserna för en total bakteriell överlevnad och överlevnad internaliserade bakterier kan utföras samtidigt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

5. Internalisering av bakterier i värd Cells (fluorescensmikroskopi)

Obs: P. gingivalis är märkt med 2 ', 7'-bis- (2-karboxietyl) -5- (och-6) -karboxifluorescein, acetoximetylester (BCECF-AM). BCECF-AM är ett icke-fluorescerande membran-permeabla färgämne; dess omvandling till fluorescein BCECF via verkan av intracellulära esteraser kan indikera cellernas livskraft. P. gingivalis märks med BCECF-AM färgämne och sedan för att infektera eukaryotiska celler. Efter infektion, celler fixeras och märkas med DAPI och TRITC-falloidin. DAPI fläcken som används för att färga den eukaryota cellkärnan kommer också att märka bakteriecellkärnan, vilket ger en motåtgärd för att identifiera icke livskraftiga bakterier som kan inte metaboliskt klyver BCECF-AM. Värdceller är markerade med TRITC-falloidin, en röd aktin färgämne.

1. Autoklavera täckglas. Aseptiskt täckglas till 12-brunnsplattor innan ympning endotelceller vid 5 x 10 ⁴ celler / brunn. (Framställd dagen före experimentet)
2. Förbered anaeroba bakterier som odlas till mitten av log-fasen (OD ₆₆₀ = 0,5-0,7) som beskrivs i avsnitt 1.
3. Tvätta bakterier 2x med anaerob PBS genom centrifugering vid 5000 x g och suspensions pelleten i PBS vid 5-7 x 10 ⁸ celler / ml.
4. Tillsätt 20 | il 0,2 mM BCECF-AM till 2 ml av bakteriesuspensionen (5-7 x 10 ⁸ celler / ml) till en slutkoncentration av BCECF-AM av 2 ^ M.
5. Inkubera vid 37 ° C under 30 minuter i mörker.
6. Överför plattor med endotelceller sådda på 18 mm (# 1.5 tjocklek) cirkulära täck från vävnadskultur inkubator i den anaeroba kammaren. Tvätta med PBS och utbyte med anaerob VEGF media.
   Observera: Kontrollera att HUVECs är friska under ett ljusmikroskop. HUVECs bör vara ~ 80% konfluenta, bör morfologi vara jämförbar med tillverkarna.
7. Centrifugera märkta bakterier vid5000 xg i 10 min för att avlägsna kvarvarande BCECF-AM färgämne. Suspendera i 2 ml anaerob VEGF media.
8. Infektera värdceller med märkta bakterier vid MOI av 100: 1 (bakterier: värd).
9. Inkubera i anaerob kammare vid 37 ° C under 30 minuter.
10. Efter infektion Tvätta cellerna med PBS tre gånger och fixera i nyberedd 4,0% paraformaldehyd under 10 minuter.
    Obs: Efter fixering celler kan experiment genomföras utanför den anaeroba kammaren.
11. Tvätta täckglas med PBS tre gånger.
12. Tillsätt 1 ml 0,2% Triton X-100 under 10 min.
13. Tvätta täckglas med PBS tre gånger.
14. Tillsätt 50 pl av TRITC falloidin (50 | ig / ml) till täckglas i 45 minuter.
15. Tvätta täck tre gånger, ta bort från 12-brunnar och plats på en bild med mjuk-set monteringsmedium innehållande DAPI. Täta sidor med nagellack.
    Obs: Diabilder kan lagras under ett par månader i mörker. Undvik ljusexponering för att förhindra fotoblekning.
16. Visa diabildermed användning av ett konfokalt mikroskop.
    1. Här kan du använda en 34 kanal spektral systemet (32-kanal systemdetektor och två sido PMT detektorer, plus en överförd ljusdetektor) konfigurerad runt en AxioObserver (inverterad) stå med en motoriserad XY skede. Systemet har fem lasrar: blå diod (405 nm), multi-line Argon (458, 488, 514 nm), grön diod (561 nm), röd HeNe (633 nm) och en 440 nm pulsad laser. Utrusta en fluorescenslivstid avbildningssystem med 2 hybrid GaAsP detektorer (för FRET-FLIM).
    2. Identifiera fluorescens från DAPI och TRITC i en kanal med hjälp av en dual-band filter med excitationsvåglängder av 340-380 nm och 540-560 nm, och en emissionsfilter av 435-485 nm och 570-590 nm respektive. Identifiera fluorescens från BCECF-AM med hjälp av ett filter med excitationsvåglängd av 440-500 nm och en emissionsfilter av 510-590 nm.
       Obs: Kontroller för BCECF-AM bör göras på varje bakteriestam som studeras för att säkerställa korrekt märkning av livskraftiga bakterier. Först validera att nonviable bakterier är DAPI-positiva och BCECF-negativa. För det andra, se till att levande bakterier kan metabolisera BCECF-AM i fluorescein BCECF. Varierande koncentrationer av bakterier eller BCECF-AM färgämne kan behöva testas för optimal märkning.

Representative Results

Protokoll som beskrivs ovan användes för att studera värdpatogen interaktion mellan P. gingivalis och endotelceller. P. gingivalis W83 och en P. gingivalis V3150 som bär en deletion av PG0228 användes i studien. Den PG0228 förutspås koda för ett protein som kan förändra nivåerna av RNA och proteiner, vilket i slutändan kan påverka interaktionen av P. gingivalis med värdceller. För att undersöka effekten av PG0228 på P. gingivalis förmåga att interagera med värdceller, var förmågan hos föräldra- och mutantstammar att interagera med HUVEC jämföras. Överlevnads protokollet (figur 2) applicerades på denna studie. Således var båda stammarna vuxit till logaritmisk fas som beskrivs i steg 2. Båda stammarna hade liknande tillväxtkurvor och därmed inga väsentliga problem med normalisering av antalet celler före infektion påträffades. Efter sju dagars inkubation CFU observeras på blod engar plattor (Figur 3). Flera utspädningar 1:10 (Figur 3A), 1: 100 (figur 3C) och en: 1000 (figur 3B) ströks ut på blodagarplattor. Som ses i figur 3A antalet kolonier var för höga för att bedöma; kolonierna var urskiljas från varandra och betecknas som "för många att räkna" [TMTC]. Utspädningen i figur 3B var för låg som för få kolonier erhålles. De spädningar av 1: 100, såsom visas i figur 3C var önskvärd, eftersom kolonierna är urskiljbara och antalet kolonier var hanterbara att räkna. Liknande resultat hittades för mutantstammen V3150 (Figur 3D). Den CFU var således räknas från plattorna med utspädningsfaktorn 1: 100.

Med hjälp av antalet CFU och utspädningsfaktorn, var det uppskattade antalet levande bakterier återvinns för varje stam beräknas. Dividera antalet viable bakterier som återvinns genom det ursprungliga antalet bakterier resulterar i ett förhållande som definieras som invasionen effektivitet. Vid jämförelse av invasions effektiviteten för båda stammarna, överlevde vildtyp W83 inom HUVEC med hög effektivitet, medan stammar som saknar PG0228 visade en signifikant minskning i överlevnad (Fig 4).

För att ytterligare kontrollera att felet berodde på överlevnad snarare än minskad internalisering av bakterierna var mikroskopi analys. HUVEC infekterade med P. gingivalis betraktades under ett mikroskop (Figur 5). I det här exemplet är ett HUVEC presenteras. För att bestämma antalet internaliserade bakterier flera bilder togs vid olika brännvidder för att erhålla en Z-stack möjliggör för rumslig-temporala identifiering av intern P. gingivalis. Också, minst 40 celler / experimentet bör analyseras (för varje biologisk replikat) och antalet interna bakterier uppräknas för varje mregn. Om antalet internaliserade bakterier är densamma för varje stam när de ses under ett mikroskop då båda stammarna invadera HUVEC lika; emellertid, har det mutanta V3150 minskad förmåga att överleva medan inuti värdcellen, såsom visas i den antibiotiska skyddsanalysen.

Figur 3. Resultat från en bakterieöverlevnadsanalys. Protokoll för överlevnad av intracellulära bakterier användes för att bedöma förmågan hos vildtyp P. gingivalis W83 och en mutant V3150 saknar PG0228 att invadera och överleva i HUVEC. Internaliserade livskraftiga bakterier bestäms genom visualisering av CFU efter inkubation av HUVECs- P. gingivalis blandningen på blodagarplattor för sju dagar under anaeroba förhållanden. Blod plattorna placeras på ljuslåda som ökar kontrasten och gör det enklare räkning av CFU. Olika utspädningar var exgranskat. HUVEC infekterade med P. gingivalis W83 utspädning 1:10 (A), spädning 1: 1000 (B), och spädning 1: 100 (C). HUVEC infekterade med P. gingivalis V3150 utspädning 1:. 100 (D) Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4. Jämförelse av en överlevnadsgraden mellan föräldraledighet och muterade bakteriestammar. HUVEC infekterades med vild typ P. gingivalis W83 och en mutant V3150 brist på PG0228. Protokoll för överlevnad som beskrivs översiktligt i fig 2 följdes. Experiment utfördes tre gånger i triplikat och medelvärdet ± standardavvikelser presenteras. Invasion effektivitet representerar levde / initiala bakterier.* Den mutantstammen har statistiskt signifikant minskad överlevnad jämfört med vildtypen W83-stammen (P <0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. Exempel på en mikroskopisk analys av P. gingivalis intern av HUVEC. HUVEC infekterades med BCECF-AM märkt P. gingivalis för 30 min vid ett MOI av 100: 1 (P. gingivalis: HUVEC). Celler fixerades med paraformaldehyd och märkt med TRITC-falloidin och DAPI. Bilden visar en enda HUVEC med kärnan (A) och F-aktin (B) färgas blått och rött, respektive. Pilen visar P. gingivalis märkt grön (C). En sammanslagna imaGE är gjord för att visa P. gingivalis invasion i HUVECs (D). Bilder framställdes med användning skanning konfokalmikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Alla ovan nämnda metoder kan användas för att utforma specifika analyser för att bedöma samverkan av anaeroba bakterier med eukaryota celler. Det finns dock flera faktorer för att framgångsrikt utföra experimenten. Först är de mikrobiella stammar som kan användas i en studie.

Det är viktigt i en jämförelse mellan två stammar med både överlevnadsanalys samt genom mikroskopi analys att de är likartade tillväxtfaser och uppnå liknande cellkoncentrationer som eventuella skillnader i ovanstående kan påverka invasion effektiviteten ^13. När tillväxtkurvorna skiljer sig mellan två bakteriestammar, bör justeringar göras för att i slutändan uppnå liknande tillväxtmönster delar konsekventa koncentrationer ^21. Dessutom bör bakterier dispergeras jämnt för att undvika cellaggregation. Dessutom är det viktigt att välja antibiotika som effektivt eliminerar extracellulära bakterier. Om valt antibiotikum har skadliga effekter på värdceller, sedanett annat antibiotikum eller lytiska enzymer kan användas ^24,25. Slutligen måste stammen heterogenitet övervägas; även om en art kan identifieras att invadera värdceller, kan det finnas stor skillnad i patogenicitet från en stam till en annan ²⁶ och bör därför genomföras en pilotstudie för varje stam som skall undersökas.

Ett andra viktigt steg är att etablera en optimal inkubationstid och bakteriell inokulum (infektionsmultiplicitet [MOI] som är antalet bakterier som används för att infektera värdcell) vid utformningen protokollen. Kortare inkubationsperioder kommer att bedöma förmågan hos bakterier som ska internaliseras av värdceller medan längre tidpunkter kan behövas för att fastställa bakterie överlevnad samt intracellulär replikering ^27. Som intracellulär överlevnad av bakterier skulle kunna påverkas av MOI som används, är det bäst att testa flera MOIs att säkerställa att ingen skada på cell orsakades som skulle leda till celldöd eller permeabilized membran med tillgång till antibiotika dödande av intracellulära bakterier. Efter att ha etablerat MOI och inkubationstider som behövs för att besvara den specifika frågan som ställs är experimentet körs enligt protokollet; emellertid bör flera seriespädningar av den eukaryota cell bakterier lys blandning göras. Den optimala utspädningsfaktorn kommer att fastställas på grundval av CFU observerade. Utspädningsfaktorer som resulterar i plattor med 50-200 CFU är optimala för att bedöma överlevnad effektivitet. Om CFU räkna är för hög, kolonier urskilja från varandra och det blir svårt att manuellt räkna varje koloni. Om CFU räkna är för låg, små avvikelser överdriva faldig förändring mellan stammar granskas samt producera stora standardavvikelser mellan replikat.

En tredje kritisk punkt är att framställa värdceller som är hälsosamma och redo att interagera med bakterier. I ovanstående protokoll värdcellerna odlas separat med användning av standard aseptisk techniques. Användningen av antibiotika och antimykotika i vävnadsodling kan vara lämpligt, i synnerhet för nybörjare cellodlings biologer. Men innan du utför överlevnadsanalys, värdceller bör odlas i antibiotikafritt medium under åtminstone 12 h före överföring av cellerna in i anaerob kammare. Väl inne i kammaren, bör media bytas ut mot anaeroba antibiotikafritt medium för att inte inkräkta på anaeroba bakterier under infektion. Om det finns problem med vidhäftning av värdceller till plastvävnadsodlingsplattor eller täckglas kan det vara lämpligt att applicera en vidhäftande beläggning, såsom poly-L-lysin eller gelatin. Dessutom kan tekniker för beläggning vävnadsodlingsskålar med en naturligt producerat basmembran liknande extracellulära matrix (ECM) ge utredaren med mer in vivo liknande förhållanden ^28,29. Lysevärdceller kräver en balanserad rengöringsmedel som kan öppna upp värdceller utan att ändra bakteriell livsduglighet. Även saponin inte ksjuk bakterier, kan det hämma tillväxten av vissa arter. Innan våra studier effekten av saponin på P. gingivalis stammar skall användas för värdpatogen analysen verifierades att ha någon effekt på deras tillväxt / överlevnad. Om bakterier är mycket känsliga för detergenter, inklusive saponin, kan upprepade frysnings-upptiningscykler eller destillerat vatten kan användas för att lysera värdceller med liten skada på bakterier.

En fjärde kritisk punkt omfattar de överväganden som skall vidtas när utför mikroskopi experiment. Första är användningen av ett fluorescerande färgämne för att märka bakterier som skall användas för mikroskopi-protokollet. Många nuvarande märkningsmetoder för bakterier kräver en primär antikropp eller sedvanliga bakterie färgämnen med betydande begränsningar, såsom toxiska effekter och läckage av färgämnet i omgivningen vilket ger hög bakgrund. BCECF-AM är ett membran-permeabel färgämne som vanligen används som en fluorescerande indikator för intracellulär pH inom både prokaryota och eukaryoter ^30-32. Den befanns vara effektiva vid märkning av en rad anaeroba bakterier i tidigare studier ^33-35. BCECF-AM kommer bara märka livskraftiga bakterier som kan förestring. Omvandlingen till BCECF av intracellulära esteraser resulterar i en fluorescerande form som läcker ut ur cellerna betydligt långsammare än sin moderförening. Det finns många fluorescerande färgämnen och färgningstekniker som kan användas ^36; Men, beskriver detta protokoll en enkel fixering / färgningsteknik som kan användas med nästan alla mikroorganismer. Dessutom är andra färgämnen (TRITC-falloidin och DAPI) som används för att tydligare särskilja gränserna för eukaryota celler och svarar för endast bakterier som interagerar med värdceller.

Fluorescerande färgämnen är känsliga för fotoblekning och det finns flera kommersiella antifades och monterings medier tillgängliga som kan förhindra försvagning av den fluorescerande signalen ^37. Det finns också val mellan hårt set montering media ennd mjuk-set sådana. Medan hårda set som kan leda till betydande förändringar i den eldfasta index samt krympning och vävnadsskador ³⁸ mjukhärdande media kräver tätningsmedel, såsom nagellack, för att säkra täck. Då på grund av variationer som observerats bland infekterade eukaryota celler; antalet interna bakterier mellan celler kan variera och således multipla eukaryota celler bör användas för analys. I våra studier är minst fyrtio eukaryota celler utvärderas och intern bakterier uppräknade per experiment ^33,34. Slutligen, att tydligt visualisera enstaka celler, eukaryota celler som används för infektion bör inte odlas till sammanflödet. Mikroskopiska undersökningar av Prevotella inter infektion med epitelceller uppvisade preferens för specifika regioner i värdcellmembranet, och bakterierna skulle inte följa platser där epitelceller var i kontakt med varandra och inte hade någon lamellipodia ^39.

Limitation av mikroskopi kan vara dess låga genomströmningen. Således, för storskaliga kvantitativa uppgifter om den invasiva egenskapen av bakterier en flödescytometri kan också användas ^40. Denna metod innefattar användning av fluorescensmärkta bakterier (som kan åstadkommas såsom beskrivits för bakterier som skall användas för mikroskopi) och tillåter för att studera flera prov vid en tidpunkt som kan vara attraktiva för vissa forskare.

Ändringar av de två protokollen kan göras för att identifiera vägar som är involverade i värdcellupptag av bakterier. Framgångsrik bakteriell invasion sker i fem steg: (1) fäste (2) inträde / internalisering (3) människohandel (4) persistens och (5) ^avfart 41. Därmed under posten / internalisering, lokaliserar bakterien sig på värden och inkräktar värdcellen för internalisering genom modifiering av signalöverföring. Selektiva metabola hämmare kan läggas till värdceller för att bestämma förändringar i signalering som leder till framgångsrika invasionen. Förexempel latrunculin, som inhiberar aktin polymerisation, kan användas för att studera hur cytoskelettet omlagring påverkar internalisering av P. gingivalis. Antikroppar som målcellspecifika receptorer eller siRNA med förmåga att taga isär vissa gener kan också användas för en bättre förståelse av värdcellsignalhändelser som är involverade i bakteriell intemalisering. Även om alla metaboliska hämmare bör ha minimal totala effekten på värdceller, utom den som undersöks, är det viktigt att se till att behandlingar hämmar inte har en toxisk effekt på bakterier.

Framtida studier skulle se att fullända en del av dessa tekniker, eventuellt uppnå en mer in vivo liknande tillstånd. I den aktuella artikeln, är antingen bakterier eller värdceller som utsätts för tuffa miljöer. Beroende på organismen, cellinjen, och målet med experimentet vissa forskare kanske föredrar att utföra ovanstående protokollet i en _{CO2-inkubator.} Emellertid periodontal lesions återspeglar en anaerob mikromiljö i vilken bakterierna interagerar med värden. En studie som undersökte variationerna i cellulärt svar att utmana med orala bakterier under aeroba kontra anaeroba betingelser rapporterade att under reducerat syretryck (2% syre) bakterier, till exempel, Tannerella forsythia, P. gingivalis, och P. inter framkallade högre nivåer av IL-8 och TNFa jämfört med aeroba förhållanden ^42. Förmågan hos eukaryota celler för att överleva under anaeroba betingelser bekräftades också av studier som undersökte förmågan hos humana mesenkymala stamceller, mänskliga tand follikelstimulerande stamceller, humana gingivala fibroblaster, tandkötts karcinomceller och humana orala epitelceller ^43,44,45. Våra studier med användning av WST-1 cellproliferationsanalys visade att HUVEC kan överleva under upp till 48 timmar under anoxiska förhållanden. Beslutet fattades för att infektera celler i den anaeroba kammaren eftersom P. gingivalis är känslig för åtminmospheric syrenivåer, medan HUVECs kan överleva långa perioder under anaeroba förhållanden. Framtida forskning kommer att undersöka genomförandet av mikro fluidic cellodlingsanordningar som ger syre till en yta av ett monolager (som en artär) och anaeroba förhållanden i den andra ^46. Detta sätt villkor kommer inte att offras för antingen bakterier eller värd vid infektion. Sammanfattningsvis beskrivs är några enkla protokoll som kan användas för att undersöka värdpatogen interaktion för anaeroba bakterier. Dessa protokoll har också använts för att bedöma effekten av bakterie internalins, proteiner som främjar bakteriell invasion ^40, liksom surrogat icke-invasiva bakterier som uttrycker ett protein som ger invasiv egendom på bakterierna ^47.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vinyl Anaerobic Chamber-Type B	Coy Laboratory Products		Model 2000 incubator
TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood	BBL	221261
Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool	LifeLine Technology	FC-0044
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Technology	LL-0003
TrypKit	LifeLine	LL-0013
Saponin	Riedel-de Haen	16109
Gentamicin Sulfate Salt	Sigma-Aldrich	G-1264
Metronidazole	Sigma-Aldrich	M-3761
BCECF-AM	LifeTechnologies	B1150
TRITC Phalloidin	Sigma-Aldrich	P1951
18 mm Circular Coverslips	Electron Microscopy Sciences	72222-01
VectaShield Mounting Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200