Vi beskriver en protokoll for lys-katalysert generering av hydrogenperoksyd – en kofaktor for oksidative transformasjoner.
Oxidoreductases tilhører de mest anvendte industrielle enzymer. Likevel må de ytre elektroner hvis tilførsel er ofte kostbart og vanskelig. Resirkulering av den elektrondonorer NADH eller NADPH som krever bruk av ytterligere enzymer og offer substrater. Interessant nok flere oxidoreductases godta hydrogenperoksyd som elektrondonor. Mens den er billig, denne reagensen reduserer ofte stabiliteten av enzymene. En løsning på dette problemet er in situ dannelse av kofaktor. Den kontinuerlige tilførsel av kofaktor ved lav konsentrasjon driver reaksjonen uten å redusere enzymstabilitet. Dette papir demonstrerer en fremgangsmåte for lys-katalysert in situ dannelse av hydrogenperoksyd med eksempelet av heme-avhengige fettsyre decarboxylase olet JE. Fettsyre decarboxylase olet JE ble oppdaget på grunn av dens enestående evne til å produsere langkjedede 1-alkener fra fettsyrer, et hittil ukjent enzymatiskreaksjon. 1-alkener er mye brukt additiver for myknere og smøremidler. Olet JE har vist seg å akseptere elektroner fra hydrogenperoksyd for den oksydative dekarboksylering. Mens tilsetning av hydrogenperoksyd skader enzym og resulterer i lave utbytter, in situ-genereringen av kofaktor omgår dette problem. Den photobiocatalytic Systemet viser klare fordeler med hensyn til enzymaktivitet og utbytte, noe som resulterer i et enkelt og effektivt system for fettsyre dekarboksylering.
Den klimaendringer og overskuelig uttømming av fornybare ressurser utgjør en alvorlig trussel mot vårt samfunn. I denne sammenheng representerer enzymkatalyse en fortsatt ikke fullt utnyttet potensial for utvikling av bærekraftige og "grønnere" kjemi 1. Oksidoreduktaser har kapasitet til å katalysere innføring og modifisering av funksjonelle grupper under milde reaksjonsbetingelsene og hører til de viktigste biokatalysatorer 2. De fleste redoks transformasjoner krever tilførsel av ytre av kofaktorer så som NAD (P) H. Metoder for kofaktor regenerering har blitt brukt i industriell skala. Men de fortsatt resultere i høye prosesskostnader, som begrenser deres søknad meste til høyverdige produkter. Interessant, flere peroxidases 3,4 og P450 monooxygenases 5 akseptere elektroner fra hydrogen peroxide via den såkalte peroxide shunt. Mens H 2 O 2 er et billig co-reagens, er det angivelig harmful for mange enzymer. En jevn in situ dannelse av lave konsentrasjoner av hydrogenperoksyd er en levedyktig metode for å drive reaksjonen uten å forringe driftsstabilitet av enzymet.
Figur 1. Eksperimentell oppsett av photobiocatalytic dekarboksylering av fettsyrer av olet JE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Bruken av lys som energikilde for kjemiske og biologiske prosesser har fått økt oppmerksomhet de siste årene 6. Lys-drevet generering av hydrogenperoksyd har dukket opp som en enkel og robust metode for å forsyne hydrogenperoksyd for redox-transformasjoner (figur 1). En fotokatalysator som flavin adenin manonucleotide (FMN) kan reduksjonen av molekylært oksygen til hydrogenperoksid, som deretter anvendes som kofaktor for den enzymatiske oxyfunctionalization reaksjonen. Mulige elektrondonorer er etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), askorbat eller billig formiat. Metoden er som gjelder generelt for H 2 O 2 -avhengige enzymer, inkludert peroxidases 3,4 og P450 monooxygenases 5.
Vi har nylig undersøkt anvendelsen av en ny bakteriell dekarboksylase 7 for transformasjonen av naturlig fett til olefiner 8. Dette ville være en bærekraftig rute for syntese av mest brukte plattform kjemikalier fra et biobasert kilde. Den decarboxylase olet JE fra den gram-positive bakterie Jeotgalicoccus sp. katalyserer den oksydative dekarboksylering av fettsyrer og danner 1-alkener som produkter. Olet JE er nært knyttet til bakterielle P450 monooxygenases og trenger elektroner from hydrogenperoksyd for reaksjonen.
Dessverre, tilsetning av H 2 O 2 til en løsning av substrat og enzym resultert i lave omsettinger og en dårlig reproduserbarhet av resultatene, antagelig på grunn av en skadelig virkning av hydrogenperoksyd på stabiliteten av olet JE. Generering av et fusjonsprotein med NADPH-reduktase RhFred laget en NADPH-avhengig dekarboksylering mulig. 9 Likevel den høye prisen på NADPH og dagens begrensede muligheter for en kostnadseffektiv regenerering bedt oss om å undersøke billigere elektrondonorer. Inspirert av likheten av olet JE med P450 monooxygenases, brukte vi lys-katalysert generasjon av H 2 O 2. Vi var glade for å oppnå høye konverteringer (opp til> 95%) ved hjelp av cellefrie ekstrakter eller rensede enzymløsninger.
Med eksempel på fettsyre dekarboksylering, gir vi en generell protokoll for lys-drevet enzymtiske redoks transformasjoner ved hjelp FMN som photocatalyst og hydrogen peroxide som kofaktor. De presenterte fremgangsmåter omfatter fremstilling av enzymet i rekombinant celle av E. coli, rensing av enzymet, anvendelse for syntese av 1-alkener, og analyse av reaksjonsproduktene.
Lyset drevet generasjon av hydrogen peroxide kan brukes for en rekke redoks transformasjoner, inkludert peroxygenases 3, chloroperoxidases 10 og P450 monooxygenases 5. Det er en enkel og praktisk tilnærming. På lang sikt, åpnes ved bruk av synlig lys opp i perspektiv for å utnytte sollyset for kjemiske omdannelser, som er et bærekraftig alternativ for energirike reaksjoner.
Fremgangsmåten er anvendelig med renset enzym eller med cellefritt ekstrakt. Mens den sistnevnte krever mindre kostnad og arbeid, bør det bemerkes at små molekyler i råekstraktet kan interferere med lys katalyserte konvertering. En praktisk fremgangsmåte er å fjerne disse små komponenter med en micromembrane (dvs. ved sentrifugering i en sentrifugal filterenhet eller ved dialyse). Konsentrasjonen av den lette innhøsting molekyl FMN bestemmer konsentrasjonen av hydrogenperoksydet. Avhengig av Affinity av oksidoreduktase, er denne konsentrasjonen avgjørende for den enzymatiske aktivitet. En annen viktig faktor er den konsentrasjonen av offerelektrondonor EDTA. Den viktigste parameter, er imidlertid den operative stabilitet og aktivitet av enzymet.
Den olefinization av fettsyrer er en elegant reaksjon for konvertering av biobaserte fettsyrer i olefiner som tilhører de store varer for den kjemiske industrien. Lyset-drevet biokatalytisk dekarboksylering kan utføres ved romtemperatur og ved nøytral pH, og har klare fordeler når det gjelder bærekraft.
Våre resultater viser at in situ dannelse av hydrogenperoksyd er en strategi for å forsyne kofaktor uten å svekke enzymstabilitet, noe som fører til en høy omdannelse. Presentere metoder for kofaktor regenerering bruke landbruksprodukter eller bensinbaserte kjemikalier. Lys-drevet reaksjoner er fremstår som fornybar alternativ. Framtidforskning vil være dedikert til metoder for substitusjon av offer reagens EDTA ved billigere molekyler og for å redusere mengden av den lette innhøsting molekyl FMN.
The authors have nothing to disclose.
R.K. and F.H. are grateful for the EU-commision for financial support within the Marie-Sklodowska ITN Biocascades (Nr. 634200).
Chemicals | |||
Ampicillin | Sigma Aldrich | 69-52-3 | |
Bradford reagent | Roth | K015.1 | |
BSA | Sigma Aldrich | 90604-29-8 | |
DMSO | Sigma Aldrich | 67-68-5 | |
Ethyl acetate | Fisher Chemical | 141-78-6 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Roth | 8043.1 | |
Riboflavin 5-monophosphate sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | 130-40-5 | |
Hydrochlorid acid 37% | Sigma Aldrich | 7647-01-0 | |
Hydrogen peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | |
δ-Amino levulinic acid | Sigma Aldrich | 5451-09-2 | |
N-Methyl-N-(Trimethylsilyl)trifluoro acetamide (MSTFA) | Sigma Aldrich | 24589-78-4 | |
Myristic acid >99% | Sigma Aldrich | 208-875-2 | |
Imidazole | Sigma Aldrich | 288-32-4 | |
Sodium chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
Stearic acid >99% | Sigma Aldrich | 57-11-4 | |
Tetracycline | Sigma Aldrich | 60-54-8 | |
Tergitol | Sigma Aldrich | MFCD01779855 | |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Sigma Aldrich | 77-86-1 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Device | |||
Incubator shaker | G-25CK | New Brunswick Scientific | |
Ecotron | Infors HT | ||
Centrifugation | Labofuge 400R | Heraeus | |
RC 5B Plus | Sorvall | ||
Fresco 17 | Thermo Scientific | ||
Centrifugation rotors | SS34 | Sorvall | |
SLA | Sorvall | ||
Clean bench | Envirco | Ceag Schirp Reinraum technik | |
Column GC-FID | CP-Sil 5CB (30 m x 0.25 mmx 0.25 µm) | Agilent Technologies | |
Column GC-MS | FactorFour Capillary Coloumn (VF-5 ms + 5 m EZ Guard) | Varian | |
GC-FID | GC-2010 plus | Shimadzu | |
GC-MS | IST-40 | Varian | |
Magnetic stirrer | RCT classic | IKA | |
pH meter | SevenEasy | Mettler toledo | |
Sonicator | Branson Sonifier 250 | Branson | |
Spectral photometer | FLUOstar Omega | BMG Labtech | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Affinity chromatography column | His Pur Ni-NTA spin column | Thermo Scientific | |
Centricon | Vivaspin turbo 15 | VWR International | |
Microtiter plates | 96 Well Multiply®PCR Plates | Sarstedt |