ऑक्सीडेटिव परिवर्तनों के लिए एक सहायक कारक – हम हाइड्रोजन पेरोक्साइड के प्रकाश उत्प्रेरित पीढ़ी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन।
Oxidoreductases सबसे लागू औद्योगिक एंजाइमों के हैं। फिर भी, वे बाहरी इलेक्ट्रॉनों जिनकी आपूर्ति अक्सर महंगा और चुनौतीपूर्ण है की जरूरत है। इलेक्ट्रॉन दाताओं NADH या NADPH के पुनर्चक्रण अतिरिक्त एंजाइम और बलि substrates के उपयोग की आवश्यकता है। दिलचस्प है, कई oxidoreductases इलेक्ट्रॉन दाता के रूप में हाइड्रोजन पेरोक्साइड स्वीकार करते हैं। जबकि सस्ती जा रहा है, इस अभिकर्मक अक्सर एंजाइमों की स्थिरता को कम कर देता है। इस समस्या का समाधान cofactor में सीटू पीढ़ी है। कम एकाग्रता में सहायक कारक की सतत आपूर्ति एंजाइम स्थिरता आई बिना प्रतिक्रिया ड्राइव। इस अखबार के लिए एक विधि दर्शाता प्रकाश उत्प्रेरित हीम निर्भर फैटी एसिड decarboxylase OleT जेई के उदाहरण के साथ हाइड्रोजन पेरोक्साइड के सीटू पीढ़ी में। फैटी एसिड decarboxylase OleT जेई अपनी अनूठी फैटी एसिड होता है, एक अब तक अज्ञात एंजाइमी से लंबी श्रृंखला 1-alkenes उत्पादन करने की क्षमता के कारण की खोज की थीप्रतिक्रिया। 1-alkenes व्यापक रूप से plasticizers और स्नेहक के लिए additives इस्तेमाल कर रहे हैं। OleT जेई ऑक्सीडेटिव डिकार्बोजाइलेशन के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड से इलेक्ट्रॉनों को स्वीकार करने के लिए दिखाया गया है। हाइड्रोजन पेरोक्साइड हर्जाना एंजाइम और कम पैदावार में परिणाम, सहायक कारक के सीटू पीढ़ी में के अलावा इस समस्या में गतिरोध उत्पन्न है। photobiocatalytic प्रणाली, एंजाइम गतिविधि और उपज के बारे में फैटी एसिड decarboxylation के लिए एक सरल और कुशल प्रणाली है, जिसके परिणामस्वरूप स्पष्ट लाभ से पता चलता है।
जलवायु परिवर्तन और अक्षय संसाधनों के निकट कमी हमारे समाज के लिए एक गंभीर खतरा बन गया है। इस संदर्भ में, एंजाइम कटैलिसीस टिकाऊ के विकास और 'हरियाली' रसायन शास्त्र 1 के लिए एक अभी भी पूरी तरह दोहन नहीं संभावित प्रतिनिधित्व करता है। Oxidoreductases परिचय और कार्य समूहों के संशोधन हल्के प्रतिक्रियाओं की शर्तों के तहत उत्प्रेरित और सबसे महत्वपूर्ण biocatalysts 2 के हैं की क्षमता है। अधिकांश redox परिवर्तनों ऐसे NAD (पी) के रूप में एच सहकारकों के बाहरी की आपूर्ति की आवश्यकता है। सहायक कारक के उत्थान के लिए तरीके औद्योगिक पैमाने में लागू किया गया है। हालांकि, वे अभी भी उच्च प्रक्रिया लागत, जो उच्च मूल्य के उत्पादों के लिए ज्यादातर उनके आवेदन की सीमा में परिणाम। दिलचस्प है, कई पराक्सिडेजों 3,4 और P450 monooxygenases 5 तथाकथित पेरोक्साइड अलग धकेलना के माध्यम से हाइड्रोजन पेरोक्साइड से इलेक्ट्रॉनों को स्वीकार करते हैं। जबकि एच 2 ओ 2 एक सस्ते सह अभिकर्मक है, यह कथित harmf हैकई एंजाइमों के लिए उल। सीटू के गठन में एक स्थिर हाइड्रोजन पेरोक्साइड के की कम मात्रा का एक व्यावहारिक दृष्टिकोण एंजाइम के संचालन स्थिरता आई बिना प्रतिक्रिया ड्राइव करने के लिए है।
चित्रा 1. प्रायोगिक OleT जेई द्वारा फैटी एसिड की photobiocatalytic decarboxylation के सेट-अप। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
रासायनिक और जैविक प्रक्रियाओं के लिए ऊर्जा स्रोत के रूप में प्रकाश का इस्तेमाल पिछले साल 6 में बढ़ती ध्यान प्राप्त किया गया है। हाइड्रोजन पेरोक्साइड के प्रकाश संचालित पीढ़ी एक आसान और मजबूत विधि redox परिवर्तनों (चित्रा 1) के लिए हाइड्रोजन पेरोक्साइड की आपूर्ति करने के रूप में उभरा है। ऐसे adenine सोम पीला रंग के रूप में एक photocatalystonucleotide (FMN) हाइड्रोजन पेरोक्साइड, जो तब एंजाइमी oxyfunctionalization प्रतिक्रिया के लिए सहायक कारक के रूप में इस्तेमाल किया जाता है के लिए आणविक ऑक्सीजन की कमी की अनुमति देता है। संभव इलेक्ट्रॉन दाताओं ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), एस्कॉर्बेट या सस्ती formiate हैं। विधि एच के लिए आम तौर पर लागू पराक्सिडेजों 3,4 और P450 monooxygenases 5 सहित 2 ओ 2 निर्भर एंजाइमों, है।
हमने हाल ही में olefins 8 में प्राकृतिक वसा के परिवर्तन के लिए एक उपन्यास बैक्टीरियल decarboxylase 7 के आवेदन की जांच की है। यह एक जैव आधारित स्रोत से व्यापक रूप से इस्तेमाल मंच रसायनों के संश्लेषण के लिए एक स्थायी मार्ग होगा। Decarboxylase OleT जेई ग्राम पॉजिटिव जीवाणु Jeotgalicoccus सपा से। फैटी एसिड की ऑक्सीडेटिव डिकार्बोजाइलेशन उत्प्रेरित और रूपों उत्पादों के रूप में 1-alkenes। OleT जेई बारीकी से बैक्टीरियल P450 monooxygenases से संबंधित है और इलेक्ट्रॉनों की जरूरत है चप्रतिक्रिया के लिए ROM हाइड्रोजन पेरोक्साइड।
दुर्भाग्य से, सब्सट्रेट और एंजाइम का एक समाधान करने के लिए एच 2 ओ 2 के अलावा शायद OleT जेई की स्थिरता पर हाइड्रोजन पेरोक्साइड के एक हानिकारक प्रभाव के कारण, कम रूपांतरण और परिणामों के एक गरीब reproducibility में हुई। NADPH-reductase RhFred के साथ एक संलयन प्रोटीन की पीढ़ी फिर भी एक NADPH निर्भर decarboxylation संभव। 9 बनाया, NADPH की ऊंची कीमत और एक लागत प्रभावी उत्थान के लिए वर्तमान सीमित संभावनाओं सस्ता इलेक्ट्रॉन दाताओं की जांच करने के लिए हमें प्रेरित किया। P450 monooxygenases साथ OleT जेई की समानता से प्रेरित होकर, हम एच 2 ओ 2 के आलोक उत्प्रेरित पीढ़ी का इस्तेमाल किया। हम उच्च रूपांतरण (> 95% तक) प्राप्त करने के लिए सेल मुक्त अर्क या शुद्ध एंजाइम समाधान का उपयोग कर प्रसन्न थे।
फैटी एसिड decarboxylation के उदाहरण के साथ, हम प्रकाश संचालित Enzym के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल प्रस्तुतatic redox FMN सहायक कारक के रूप photocatalyst और हाइड्रोजन पेरोक्साइड के रूप में उपयोग करते हुए परिवर्तनों। प्रस्तुत तरीकों ई की पुनः संयोजक सेल में एंजाइम के उत्पादन में शामिल कोलाई, एंजाइम की शुद्धि, 1-alkenes के संश्लेषण और प्रतिक्रिया उत्पादों के विश्लेषण के लिए आवेदन।
हाइड्रोजन पेरोक्साइड की रोशनी से चलने वाली पीढ़ी के एक रेंज redox परिवर्तनों के लिए लागू किया जा सकता है, peroxygenases 3 सहित, chloroperoxidases 10 और P450 monooxygenases 5। यह एक आसान और साध्य दृष्टिकोण है। लंबे समय में, दृश्य प्रकाश का उपयोग रासायनिक परिवर्तनों के लिए सूरज की रोशनी है, जो ऊर्जा से भरपूर प्रतिक्रियाओं के लिए एक स्थायी विकल्प है का उपयोग करने के परिप्रेक्ष्य को खोलता है।
विधि शुद्ध एंजाइम के साथ या सेल मुक्त निकालने के साथ लागू है। बाद कम लागत और मेहनत की आवश्यकता है, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कच्चे तेल निकालने में छोटे अणुओं प्रकाश उत्प्रेरित रूपांतरण के साथ हस्तक्षेप कर सकता है। एक साध्य दृष्टिकोण (एक केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट में या डायलिसिस से, यानी centrifugation द्वारा) एक micromembrane के साथ इन छोटे घटकों को दूर करने के लिए है। प्रकाश कटाई अणु FMN की एकाग्रता हाइड्रोजन पेरोक्साइड की एकाग्रता निर्धारित करता है। AFFINI पर निर्भर करता हैoxidoreductase की Ty, इस एकाग्रता एंजाइमी गतिविधि के लिए निर्णायक है। एक अन्य महत्वपूर्ण कारक बलि इलेक्ट्रॉन दाता EDTA की एकाग्रता है। सबसे महत्वपूर्ण पैरामीटर है, तथापि, परिचालन स्थिरता और एंजाइम की गतिविधि है।
फैटी एसिड की olefinization olefins कि रसायन उद्योग के लिए प्रमुख वस्तुओं के हैं में जैव आधारित फैटी एसिड के रूपांतरण के लिए एक सुंदर प्रतिक्रिया है। प्रकाश संचालित biocatalytic decarboxylation कमरे के तापमान पर और तटस्थ पीएच, जो स्थिरता के संदर्भ में स्पष्ट लाभ प्रदान करता है पर बाहर किया जा सकता है।
हमारे परिणाम बताते हैं हाइड्रोजन पेरोक्साइड के सीटू पीढ़ी में एक रणनीति एंजाइम स्थिरता आई बिना cofactor आपूर्ति करने के लिए एक उच्च रूपांतरण के लिए अग्रणी है। सहायक कारक के उत्थान के लिए वर्तमान तरीकों कृषि उत्पादों या पेट्रोल आधारित रसायन का उपयोग करें। प्रकाश संचालित प्रतिक्रियाओं अक्षय विकल्प के रूप में उभर रहे हैं। भविष्यअनुसंधान सस्ता अणुओं द्वारा बलि अभिकर्मक EDTA के प्रतिस्थापन के लिए तरीकों को समर्पित किया जाएगा और प्रकाश कटाई अणु FMN की मात्रा को कम करने के लिए।
The authors have nothing to disclose.
R.K. and F.H. are grateful for the EU-commision for financial support within the Marie-Sklodowska ITN Biocascades (Nr. 634200).
Chemicals | |||
Ampicillin | Sigma Aldrich | 69-52-3 | |
Bradford reagent | Roth | K015.1 | |
BSA | Sigma Aldrich | 90604-29-8 | |
DMSO | Sigma Aldrich | 67-68-5 | |
Ethyl acetate | Fisher Chemical | 141-78-6 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Roth | 8043.1 | |
Riboflavin 5-monophosphate sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | 130-40-5 | |
Hydrochlorid acid 37% | Sigma Aldrich | 7647-01-0 | |
Hydrogen peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | |
δ-Amino levulinic acid | Sigma Aldrich | 5451-09-2 | |
N-Methyl-N-(Trimethylsilyl)trifluoro acetamide (MSTFA) | Sigma Aldrich | 24589-78-4 | |
Myristic acid >99% | Sigma Aldrich | 208-875-2 | |
Imidazole | Sigma Aldrich | 288-32-4 | |
Sodium chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
Stearic acid >99% | Sigma Aldrich | 57-11-4 | |
Tetracycline | Sigma Aldrich | 60-54-8 | |
Tergitol | Sigma Aldrich | MFCD01779855 | |
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Sigma Aldrich | 77-86-1 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Device | |||
Incubator shaker | G-25CK | New Brunswick Scientific | |
Ecotron | Infors HT | ||
Centrifugation | Labofuge 400R | Heraeus | |
RC 5B Plus | Sorvall | ||
Fresco 17 | Thermo Scientific | ||
Centrifugation rotors | SS34 | Sorvall | |
SLA | Sorvall | ||
Clean bench | Envirco | Ceag Schirp Reinraum technik | |
Column GC-FID | CP-Sil 5CB (30 m x 0.25 mmx 0.25 µm) | Agilent Technologies | |
Column GC-MS | FactorFour Capillary Coloumn (VF-5 ms + 5 m EZ Guard) | Varian | |
GC-FID | GC-2010 plus | Shimadzu | |
GC-MS | IST-40 | Varian | |
Magnetic stirrer | RCT classic | IKA | |
pH meter | SevenEasy | Mettler toledo | |
Sonicator | Branson Sonifier 250 | Branson | |
Spectral photometer | FLUOstar Omega | BMG Labtech | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Affinity chromatography column | His Pur Ni-NTA spin column | Thermo Scientific | |
Centricon | Vivaspin turbo 15 | VWR International | |
Microtiter plates | 96 Well Multiply®PCR Plates | Sarstedt |