Medicine

マウスにおける異所のための新しい顕微モデル、エン圏胸壁、胸腺、および心臓移植

Published: January 23, 2016 doi: 10.3791/53442

Byoungchol Oh*¹, Georg J. Furtmüller*¹, Michael Sosin*¹, Madeline L. Fryer¹, Lawrence J. Gottlieb^2,3, Michael R. Christy⁴, Gerald Brandacher^1,5,6, Amir H. Dorafshar^1,5,6

¹Johns Hopkins University School of Medicine, ²Burn and Complex Wound Center, ³Section of Plastic and Reconstructive Surgery, University of Chicago Medical Center, ⁴Division of Plastic, Reconstructive, and Maxillofacial Surgery, R Adams Cowley Shock Trauma Center, ⁵Department of Plastic and Reconstructive Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, ⁶Vascularized Composite Allotransplantation (VCA) Lab, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

Protocol

すべての手術の手順は、ジョンズ・ホプキンス大学と米国農務省および公衆衛生局の要件に準拠して完了しました。このプロトコルは、ジョンズ・ホプキンス大学動物実験委員会を以下の、施設内倫理委員会は、（プロトコル番号M013M490）のガイドラインを承認しました。最終的な生存データは、以下に記載の外科的処置のために記録しました。両方のドナーとレシピエント動物は0.1ミリグラムでブプレノルフィンを使用して先制麻酔を受ける/ kgの皮下1時間前に手術し、レシピエント動物のブプレノルフィンでは、移植後に同じ用量で再投与し、最初の48時間で、必要に応じて再投与されます手術後。

1.ドナー同種移植片回復

注：受信者の麻酔時間を最小限にするために、以前の受信者の移植よりも移植40分のドナー部分を開始し、同時に終了時間または少し耳を容易にするために受信者の準備対Lierの終了時間。

手順については、標準的な無菌顕微楽器や滅菌手袋を使用してください。私たちの研究室では、顕微楽器のオートクレーブ滅菌を使用しています。
4％でイソフルラン誘導気化器を使用して、ドナーマウス（雄）を麻酔。非外傷性の機械的なバリカンを使用すると、頸部、胸部、および腹部から毛を取り除きます。仰臥位で動物を置き、ノーズコーンを介して1〜2％のイソフルランを維持します。定期的につま先のピンチ引っ込め反射を評価することによって、作業中は適切な麻酔を確認してください。
皮膚切開の前に、広く滅菌綿棒を使用して、イソプロピルアルコールが続く防腐剤ポビドンヨードを適用することにより、手術を準備します。
子宮頸部と腹部の皮膚を横切るハサミで浅横皮膚切開を開始します。 midaxillary線に沿って、左右両方の切開を接続します。
顕微鉗子を使用して6-0絹縫合糸とはさみで外頚静脈を識別連結および分割するために、両側頸部を分析。その後、電気メスを使用して左右対称に、内頸静脈と総頸動脈を露出させるために胸鎖乳突筋筋肉を分割します。左側と右側総頸動脈およびバルクの方法で内頸静脈の下で6-0絹縫合糸を渡します。
注：彼らは縛られ、後にステップ1.9で分割されます。
はっきり頸部の残りの添付ファイルを解放するためにハサミを使用して、気管の前方に位置するストラップの筋肉と関連した緩い疎性結合組織を、分割します。
バイポーラ電気メスと鋭い解剖を使用して、鎖骨下血管を露出させ、連結する大胸筋や鎖骨（6-0絹縫合糸）を分割して近位に分割します。
次に、静かに、動物の陰茎を把握し、撤退。ペニスの背に沿って、陰茎の背静脈を視覚化し、消毒イソプロピルアルコールで地域。 30 G針を使用して、背静脈から静脈内にヘパリンの3万台を注入し、ペニスを元の位置に戻って反動することができます。周囲の組織へのヘパリン溶液の部分的な漏れが発生することがあります。
総頸動脈と頸静脈の周りに配置され、以前にバルクタイを使用して、左右対称に、連結と構造を分割します。
次に横intrabdominal切開を行うためにハサミを使用しています。肝臓下の下大静脈を露出させ、肝臓下の下大静脈に冷たいユーロコリンズ心停止溶液2mlを注入する腸を骨抜き。前次のステップに進むにハートビートの肝変色や停止を可視化することにより、適切な注入を確認してください。
注：ユーロ・コリンズ液を我々の研究室で用意され、特定の試薬および器具の表を参照してください。
使用はさみは、二国間diaph経由で胸腔内の空洞にアクセス露出した腹部からragmatic切開。肋間筋と肋骨を介して切開頭を拡張します。同時に胸の壁に沿って内胸船舶の保全性を確保しながら、心臓、胸腺、および大血管を露出し胸壁を反映しています。
冷たいユーロコリンズ心筋保護液4mlで肝上下大静脈を注入します。
大動脈のルートを特定し、下行大動脈に遠位にトレースします。急激に下行大動脈（最大長を保持）をカットします。
肺動脈幹を特定し、（最大長さを維持し）、その分岐点のすぐ近位分けます。そして、冷たいユーロコリンズ心停止溶液2mlを使用して、肺動脈幹の内腔に軟質プラスチックチップカテーテルを配置することによって、肺動脈幹と心を洗い流します。
6-0絹縫合糸を用いて、ライゲーションおよび下大静脈、肺静脈の合流、および両側上大静脈のアクセサリ枝を分割します。そして、昇格気道を入力させないように注意しながら主茎気管支や気管に沿って添付ファイルから心臓の頭を解剖。シャープとバイポーラ電気メスを使用すると、完全にドナーマウスからそれを解放胸壁、胸腺、および心臓を解剖します。
最後に、内胸の血管（ 図1A）を混乱させないように注意しながら、胸骨と横肋骨に沿って、はさみを使って、小さいサイズにex vivoでの同種移植片の胸壁をトリミング。血行再建以下の出血を最小限に抑えるために、osteomusculocutaneous胸骨の境界に沿って、バイポーラ電気焼灼を使用しています。
受信者は、インセットのために準備されていない場合、ユーロコリンズ液を冷（4 ^Oの摂氏）の10ml中の同種移植片を配置します。受信者がインセットの準備ができている場合は、まっすぐに受信者術野への同種移植片を移します。

2.受信者の準備

注：受信者の麻酔時間を最小限にするために、別々の手術駅で前にドナー同種移植片の収穫が完了するまでの約40分を受信者の準備を開始します。

手順については、標準的な無菌の顕微機器の別個のセットと滅菌手袋を使用してください。
4％でイソフルラン誘導気化器を使用して、（男性または女性）、レシピエントマウスを麻酔。非外傷性の機械的なバリカンを使用すると、右の子宮頸部と胸部の毛を削除します。
仰臥位と角度右上肢が若干下方に頭と右上肢の間に110度の角度を形成する際にマウスを置きます。ノーズコーンを介して1〜2％イソフルランの麻酔を維持します。
綿の先端のアプリケーターを用いてマウスの眼に石油眼軟膏を置きます。皮膚切開の前に、広くイソプロピルアルコールが続く防腐剤ポビドンヨードを使用して、手術部位を準備します。
はさみを使用して、右下BORに沿って正中線から皮膚切開を作ります下顎のデルと右胸部にinfero-横方向に切開を拡張します。微小血管鉗子で鈍的切開を使用して、軟組織および外から円周方向に自由に船舶により外頸静脈を動員。電気メスを使用して、すべてのブランチを分割し、同種移植のための空き領域に鋭い解剖し、電気メスを使用して、顎下腺の右葉を削除します。
カフの上に裏返すために外頸静脈のに十分な長さを確認し、6-0絹縫合糸を用いて、静脈外頚を結紮。プレカットポリイミドカフの内腔を通って静脈に挿入し、所定の位置に血管カフ複合体を固定するためのブルドッグ微小血管クランプを使用しています。そして、近位エバートカフの上に、外頸静脈を分割し、10-0ナイロン縫合糸で所定の位置に固定し、はさみを使って。（ 図1B）
総頸動脈を露出するようにバイポーラ電気メスと右胸鎖乳突筋を分割します。円周方向に暴徒頸部内の最遠位点に動脈頭をilize。これは、軟組織と周囲の外膜を除去するために、鉗子で血管の鈍的切開を用いて達成されます。
6-0絹縫合糸を用いて、ライゲーションおよび総頸動脈を分割。プレカットポリイミドカフの内腔を通って動脈をパスし、可能な限り胸郭入口に近いブルドッグ微小血管クランプで所定の位置に固定します。優しくエバートカフの上に、顕微拡張器を使用して血管を拡張、遠位血管を分割し、10-0ナイロン縫合糸で所定の位置に固定します。（ 図1B）
注：特定の顕微拡張器は、特定の試薬および器具の表に記載されています。

3.同種移植片挿入図

逆さまや斜めの位置に受信者の子宮頸部領域内の同種移植片を配置するための標準的な滅菌機器および滅菌手袋を維持します。
次に、AOR降順ドナーを配置受信者の動脈カフ構造体の上にチックルーメンと10-0ナイロン縫合糸（ 図1Cおよび1D）と所定の位置に固定します。
ドナー肺動脈とレシピエントマウス（ 図1Cおよび1D）の裏返し外頸静脈カフ構造体との間の段差3.2とファッション同じ吻合を。
まず静脈微小血管クランプ（外頸静脈クランプ）を削除し、動脈クランプ（総頸動脈クランプ）をリリース。動脈再灌流の間に、任意の出血に対処するための同種移植片の全体を検査します。出血が可視化される場合、血液の損失を最小限に抑え、バイポーラ電気メスを使用して、出血の原因を軽減するために、動脈クランプを再適用します。
グラフトを点検し、止血を確認してください。リリースと完全に動脈微小血管クランプを取り外します。心腔の急激な体積膨張と瞬時に明らかになるであろう、再灌流の徴候を示し、aとbを待つために心を守って0.5から1分以内に開始するために食べます。心を潤すために温かい生理食塩水（35度摂氏）を使用します。
吻合上のねじれや張力を誘発しないように、解剖学的位置に胸壁ドレープ。 6-0連続ナイロン縫合糸（ 図1E）を使用している手術創の皮膚を閉じます。

4.術後ケア

水分補給のためにすぐに手術後に0.3ミリリットルの生理食塩水を腹腔内の流体ボーラスを管理します。
そして皮下にそれぞれ、痛みや感染症予防のためにブプレノルフィン（0.1mg / kg）およびエンロフロキサシン（5mgの/キログラム）を注入します。
麻酔から覚めるまで加熱ランプの下で動物を置き、胸骨横臥に戻ります。リカバリ時には、適切な同種移植灌流を確保する同種移植のフィブリル化ハートビートを視覚化するために、首を点検。
目を覚ましや臥位で一度、他のマウスの会社なし（別のケージにマウスを返します）それは、食物および水を自由に受け取ることができる場所。、右上肢の一時的なマイナー限定的運動に、ケージの床の上にゼラチン食料源を残します。
術後1時間レシピエントマウスを観察し、それが食物と水を自由に摂取を受け取ることができますし、活動や栄養摂取のための最初の24時間1日3回検査してケージ施設にそれを返します。最初の72時間の必要に応じて、一日2回皮下痛みと苦痛とブプレノルフィン（0.1mg / kg）で再用量の兆候がマウスを監視します。その後毎日動物を調べ、毎週、それらの重量を量ります。
任意のマウスは、痛み、苦痛の徴候を表示したり、飼料摂取量を減少させた場合には獣医スタッフに相談してください。早期の安楽死を考えてみましょう（私たちのプロトコルで安楽死法は、頸椎脱臼に続いて、7分間のCO ₂過剰摂取を採用）。
同種移植心拍の停止はsにマウスを促す特定のエンドポイントとして定義されていますacrificed。

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Representative Results

長期生存を達成した同系のC57BL / 6移植。同種移植片の設計（ 図1）は、動物の生存の観点および進行中の同種移植片の生存を評価する能力の成功であることが判明しました。これは、実行可能な、アクティブな継続的な同種移植毛の成長を残りの上を覆う皮膚を介して実証された、およびハートビートは、視覚化と指触診で評価することができました。生存データは、同系移植されたマウスについては、図2に示されています。平均生存時間を超える109日でした。生存データに基づいて、同種移植片移植の技術的側面は、胸壁、胸腺、心臓の全体を灌流するために設計されていることを推測することは合理的です。また、長期的に生き残るために同系の動物の能力は、さらに、このマウスモデルだけでなく、実現可能であるが、複製することができることをサポートしています。この概念実証圏の胸壁、胸腺、および心臓移植アンは目を検証組み合わせ固形臓器や血管新生した複合同種移植を研究するための電子マウスモデル。

1.術中写真図。（A）胸壁、胸腺、心臓同種移植片が首尾よく回収トリミング、および後面からex vivoで可視化されます。二国間の内胸血管が保存されている。（B）、レシピエント外頚静脈（矢印）および総頸動脈（矢じり）が血管吻合の準備のためにポリイミド袖口の上に裏返しに固定されている。（C）同種移植血管吻合が完了しています。矢印は、ドナー肺動脈とレシピエント外頚静脈との間に吻合を示しています。矢じりは、ドナー下行大動脈とレシピエント総頸動脈の間に吻合を示しています。アスタリスクは、胸腺を識別し、その反射胸壁が可視化されるoverl胸腺をYING。（d）の高倍率は、微小血管カフ吻合を示しています。（e）完全同種移植片挿入図。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2アンブロック胸壁、胸腺、心臓同種移植片の生存アン同系C57BL / 6マウスにおけるブロックの胸壁、胸腺、心臓同種移植のカプラン・マイヤー生存曲線（N = 3;平均生存時間であったよりも大きい109日）。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

含まれる同種移植の免疫学的調査に要因が、急性および慢性拒絶反応、直接的および間接的な抗原提示、受信者の感作、または混合キメラの誘導のメカニズムに限定されるものではない現象の多くがあります^。19動物モデルはなってきました移植免疫学の研究のためのゴールドスタンダード、およびマウスモデルは、一般に、その低い相対獣医や住宅需要の減少、コスト、トランスジェニックおよび遺伝子ノックアウトマウスの可用性、市販のモノクローナル抗体、および複製の容易に実装されています。これまでに、複数の心臓移植モデルは、固形臓器移植を研究するために設計されています^{。19,22-27。同様に} 、マウスモデルの過多が血管新生化複合同種移植を研究するために開発されてきた^。28しかし、組み合わせた固形臓器や血管新生した複合同種の研究を、限られていますおよび技術は、マウスにおいて確立されていません。ここで提示アン圏の胸壁、胸腺、および心臓移植マウスモデルは、効果と組み合わせた固形臓器や血管新生した複合同種移植の免疫学的メカニズムを研究するための信頼性が高く、複製可能なツールです。

さらに移植の分野を進めるため、新たな治療法を介して同種移植片の生存および免疫抑制の最小化を延長の約束を追求する必要があります。そのようなアプローチは、いくつかの場合においてキメラ現象が持続されていなくても、免疫抑制を含まないドナー特異的寛容をもたらすことができる混合キメラ（レシピエントにおけるドナー造血細胞の部分的移植）の誘導によるものである^。29,30骨髄輸血/移植は、固形臓器³¹または血管新生した複合allotransplanation ^32,33が重要な課題を装っ豊富な前処理を必要とペアに。血管が新生骨髄、同種移植片血管新生複合構造体の一部が、この問題を回避することができます。血管新生骨髄移植は保存ドナー微小環境内でのドナー骨髄細胞の中断のない転送を可能にし、免疫抑制の必要の耐性及び減少の誘導における単独の細胞の骨髄移植よりも優れていることが考えられる^。34-36さらに、組み込み血管新生骨髄移植での胸腺組織の最終的キメラ化の誘導および維持に支持する役割を果たし、ドナー由来のT細胞キメラ現象を増加させることが示されている。同種移植片の生存を延長し、免疫抑制を最小限に抑える^2.9上記の戦略が概念化するための基礎でした組み合わせ固形臓器、胸腺、および血管新生化複合同種移植マウスモデル。

圏の胸壁、胸腺、および心臓移植アン異は、複数の融合であり、彼のトーリック動物モデル。マウスでは非縫合カフを使用して異子宮頸心臓移植は、十分に確立されており、異腹部微小血管心臓移植未満技術的に厳しいと考えられてきた。実際には^19、カフ技術は、複数の他の動物移植モデルで実装されています^。37〜44異ラットにおける胸骨の移植はサンティアゴらによって 1999年に導入された。血管が新生骨髄移植を研究するための代替方法として^。1彼らは術後日に免疫抑制の中止後長期周辺キメラ、寛容、および生存を示すことができた30 ¹ Bozkurt らはその後、胸腺及び胸壁のosteomyocutaneous部分の全範囲を組み込むために2013年にラットモデルを開発しました。これは、このモデルは、複数の面で我々のモデルとは異なることに留意すべきです。これには、（1）それらのモデルは、任意の固体を欠いています臓器、（2）従来の顕微技術を使用して、ラットに完成され、ドナーの収穫時の内胸の血管（3）連結、（4）総頸動脈と外頚静脈からの一方的な、単一の椎弓根の実施、（5鼠径部への同種移植片の）移植^。2それにもかかわらず、彼らのモデルだけでは血管新生し、骨髄移植と比較して、ドナー由来の胸腺は、キメラ増強のためだけでなく、キメラ維持のためだけでなく、重要な役割を果たしていることを実証することができました^。2その後の胸腺、心臓の同時移植のブタモデルは、心臓同種移植片の生存に優れた効果を示している^。10,11それぞれの利点の動物モデルが、組み合わさ固形臓器、胸腺、および血管新生に関連するインビボ研究におけるメカニズムの欠如複合同種移植は、このモデルを設計するために私たちのグループを促しました。

経験EXこの新規モデルをecutingより良い動物の生存を達成するために修正を提起するために我々のチームを必要とする特定のレッスンを示しました。このモデルは、最終的には3-4時間以上も長時間の冷虚血時間に手術や麻酔時間を延長し一人のオペレータ、と試みました。動物は、手続きの終了後目覚めないだろう。二チームアプローチの実施は、90分に総手術や麻酔時間を切りました。これは、レシピエントマウスの60分の麻酔時間、0〜10分の同種移植冷たい虚血時間に反映。同種移植再灌流の間、マウスは即時周術期での生存性を制限することができます出血、影響を受けやすいです。私たちは、出血源となる可能性のための同種移植片の細心の検査ex vivoで 、だけでなく、同種移植再灌流時のブルドッグの微小血管クランプの緩やかな解放を提唱しています。反射された位置に同種移植片を配置することによって、特定の部位を同定するために容易です出血。さらに、このグラフトはめ込み位置は、船の中で最も人間工学的なレイアウトが血管ねじれの危険性を最小限に促進します。最後に、回復の最初の48時間で、動きのレシピエントマウスの右上肢の範囲は、食料や水を得るためにケージを登山に関して妨げてもよいです。したがって、我々は栄養摂取を容易にするために、ケージに沿ってゼラチン栄養源の配置をお勧めします。通常、術後3日目までに、動きの完全な範囲は、右上肢の中に返されます。

顕微での技術的なスキルの必要性、2つの同時顕微鏡の可用性、および二チームアプローチの必要性を含め、このモデルには限界があるが、それにもかかわらずに関連する機械的な免疫学的研究を行うための成功的なアプローチであることが示されています組み合わせ固形臓器や血管新生化複合同種移植。その広いアプリケーションは、さらに新たなIMMUNの開発に寄与し得ますosuppressiveプロトコル、急性および慢性拒絶反応の研究力学、および潜在的な戦略の実施を誘導し、キメラを維持し、同種移植片の生存を延長します。

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Euro-Collins Solution			The solution is not commercially purchased but rather prepared in the laboratory. To make a 500 ml solution add the ingredient listed below to a 330 ml of double distilled water. Mix well, and then fill in the rest of the 170 ml of double distilled water into the solution to a final volume of 500 ml. Ingredients: 1.02 g KH₂PO₄, 3.66 g K₂HPO₄, 0.56 g KCl, 0.42 g NaHCO₃, and 17.52 g of glucose.
Suture	Ethilon	MWI 72667	6-0 Ethilon https://www.mwivet.com (MWI - Veterinary Supplies)
Polyimide Cuff Vein (21G)	Vention Medical	141-0043	http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Polyimide Cuff Artery (24G)	Vention Medical	141-0027	http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Soft plastic tip catheter	Terumo	SR*OX2419CA	24G x 3/4"
Microsurgical dilator	S&T	D-5a.1	Dilator, 11 cm, FH, 0.1 mm AT10d