Protocol
Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron en cumplimiento de la Universidad Johns Hopkins y el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos y los requisitos del Servicio de Salud Pública. Este protocolo sigue el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Johns Hopkins, junta de revisión institucional aprobó directrices (número de protocolo M013M490). Datos de supervivencia final se registró durante los procedimientos quirúrgicos se describen a continuación. Tanto los animales donantes y receptores reciben anestesia preventivos utilizando buprenorfina a 0,1 mg / kg sc una hora antes de la cirugía y en el buprenorfina animal receptor es re-administrado a la misma dosis después del trasplante y re-dosifica según sea necesario en las primeras 48 horas después de cirugía.
1. Donantes aloinjerto Recuperación
Nota: Comience la porción donante del trasplante de 40 minutos antes que el beneficiario del trasplante para minimizar el tiempo de anestesia destinatario y para facilitar una hora de finalización simultánea o ligeramente oídohora de finalización lier frente a la preparación destinatario.
- Utilice instrumentos de microcirugía estériles estándar y guantes estériles para el procedimiento. Nuestro laboratorio utiliza la esterilización en autoclave de los instrumentos de microcirugía.
- Anestesiar el ratón donante (masculina) con vaporizador inducción isoflurano en el 4%. Uso de las podadoras mecánicas atraumáticos eliminar el pelo de la cervical, torácica y región abdominal. Colocar el animal en posición supina y mantener isoflurano en 1-2% a través de un cono de nariz. Asegurar una anestesia adecuada durante todo el procedimiento, mediante la evaluación periódica del reflejo de retirada pizca dedo del pie.
- Antes de la incisión en la piel, ampliamente preparar el operativo mediante la aplicación de povidona yodada antiséptico seguida por el alcohol isopropílico con un hisopo de algodón estéril.
- Comience con una incisión en la piel transverso superficial con unas tijeras a través de la piel cervical y abdominal. Conecte los dos incisiones de forma bilateral a lo largo de las líneas medioaxilares.
- Con unas pinzas de microcirugíadiseccionar la región cervical bilateral para identificar, ligar y dividir las venas yugulares externas con sutura de seda 6-0 y tijeras. Luego, utilizando electrocauterio dividir los músculos esternocleidomastoideo para exponer las venas yugulares internas y las arterias carótidas comunes, de forma bilateral. Pasar una sutura de seda 6-0 bajo la del lado izquierdo y el lado derecho de la carótida común y venas yugulares internas en la moda al por mayor.
NOTA: Se les ataron y se dividen después en el paso 1.9. - Bruscamente dividir a los músculos de la correa y el tejido areolar laxo asociado, situado por delante de la tráquea, utilizando tijeras para liberar a los apegos restantes de la región cervical.
- El uso de electrocauterio bipolar y disección cortante, dividir los músculos principales y las clavículas pectorales para exponer los vasos subclavia y ligar (6-0 sutura de seda) y dividir proximal.
- Luego, suavemente, agarre y retirar el pene del animal. A lo largo del dorso del pene visualizar la vena dorsal del pene, y desinfectar elregión con alcohol isopropílico. Usando una aguja 30 G, inyectar 30.000 unidades de heparina por vía intravenosa a través de la vena dorsal del pene y permiten a retroceder de nuevo a su posición original. Pueden producirse fugas parcial de la solución de heparina en el tejido circundante.
- El uso de los lazos a granel previamente colocados alrededor de la arteria carótida común y la vena yugular interna, ligar y dividir las estructuras, de forma bilateral.
- Uso de las tijeras Siguiente para hacer una incisión transversal intraabdominal. Eviscerar los intestinos para exponer la vena cava inferior infrahepática e inyectar 2 ml de solución fría cardioplegia Euro-Collins en el infrahepática vena cava inferior. Asegúrese de inyección adecuada mediante la visualización de la decoloración del hígado y el cese de los latidos del corazón antes de avanzar a la siguiente etapa.
NOTA: la solución Euro-Collins es preparado en nuestro laboratorio, ver tabla de reactivos e instrumentos específicos. - Con una tijera acceder a la cavidad intratorácica a través de un diaph bilateralragmatic incisión del abdomen expuesto. Extienda la incisión cefálica través de los músculos intercostales y las costillas. Representativas de la pared torácica exponer el corazón, el timo, y los grandes vasos garantizando al mismo tiempo la conservación de los vasos torácicos internos a lo largo de la pared torácica.
- Inyectar el suprahepática vena cava inferior con 4 ml de solución fría cardioplegia Euro-Collins.
- Identificar la raíz de la aorta y rastrear de manera distal a la aorta descendente. Bruscamente cortar la aorta descendente (preservando longitud máxima).
- Identificar el tronco pulmonar y dividir justo proximal a su punto de ramificación (preservación de longitud máxima). Luego, utilizando 2 ml de solución fría cardioplegia Euro-Collins, lave el tronco pulmonar y el corazón mediante la colocación de un catéter de punta de plástico blando en el lumen del tronco pulmonar.
- Usando una sutura de seda 6-0, ligar y dividir la vena cava inferior, confluencia de las venas pulmonares, y las ramas accesorias de la vena cava superior bilateral. Luego elevary diseccionar el cefálica corazón de los apegos a lo largo de la principal bronquios y la tráquea, con cuidado de no entrar en la vía aérea. El uso de electrocauterio bipolar aguda y diseccionar la pared torácica, el timo, y el corazón liberar completamente del ratón donante.
- Por último, recortar la pared torácica aloinjerto ex vivo a un tamaño más pequeño, con unas tijeras, a lo largo del esternón y costillas laterales, con cuidado de no romper los vasos torácicos internos (Figura 1A). Para minimizar la hemorragia después de la revascularización, utilice electrocauterio bipolar a lo largo de las fronteras del esternón osteomusculocutaneous.
- Coloque el aloinjerto en 10 ml de frío (4 ° Celsius) solución Euro-Collins si el destinatario no está preparado para la inserción. Sin embargo, si el receptor está listo para inserción, transferir el aloinjerto directamente al campo operatorio destinatario.
2. Destinatario Preparación
Nota: Para minimizar el tiempo de anestesia destinatario,comenzar la preparación receptor en una estación operativa separada aproximadamente 40 min antes de la finalización de la cosecha del injerto donante.
- Utilice un conjunto separado de instrumentos de microcirugía estériles estándar y guantes estériles para el procedimiento.
- Anestesiar el ratón receptor (hombre o mujer) con vaporizador inducción isoflurano en el 4%. El uso de las podadoras mecánicas atraumáticos quitar el pelo de la región cervical y torácica derecha.
- Coloque el ratón en la posición supina y el ángulo de la extremidad superior derecha ligeramente por abajo formando un ángulo de 110 grados entre la cabeza y el miembro superior derecho. Mantener la anestesia en el 1-2% isoflurano a través de un cono de la nariz.
- Coloque petróleo ungüento oftálmico en los ojos de ratón utilizando un aplicador con punta de algodón. Antes de la incisión de la piel, ampliamente preparar el sitio de la operación usando povidona yodada antiséptico seguido por alcohol isopropílico.
- Con unas tijeras, hacer una incisión en la piel de la línea media a lo largo del bor inferior derechoder de la mandíbula y extender la incisión infero-lateral a la región torácica derecha. Utilizando disección roma con pinzas microvasculares, movilizar a la vena yugular externa circunferencialmente libre del vaso de tejidos blandos y adventicia. Divida todas las ramas utilizando electrocauterio, y quitar el lóbulo derecho de la glándula submandibular mediante disección cortante y electrocauterio para liberar espacio para el aloinjerto.
- Asegurar suficientemente la longitud de la vena yugular externa para la eversión sobre un manguito, y se liga la vena yugular externa utilizando una sutura de seda 6-0. Inserte la vena a través del lumen de un manguito de poliimida de precorte y utilizar una pinza microvascular bulldog para fijar el complejo buque-manguito en su lugar. Luego, utilizando tijeras, proximal dividir la vena yugular externa, Evert sobre el brazalete, y fijar en su lugar con una sutura de nylon 10-0. (Figura 1B)
- Divida el músculo esternocleidomastoideo derecho con electrocauterio bipolar para exponer la arteria carótida común. Mafia circunferencialmenteilize la arteria cefálico al punto más distal dentro de la región cervical. Esto se logra utilizando disección roma del vaso con pinzas para eliminar el tejido blando y adventicia circundante.
- El uso de sutura de seda 6-0, ligar y dividir la arteria carótida común. Pase la arteria a través de la luz de un manguito de poliimida precortadas y fijarlo en su lugar con una pinza microvascular bulldog tan cerca de la entrada torácica posible. Divida el vaso distal, dilatar suavemente el recipiente usando un dilatador microquirúrgica, Evert sobre el brazalete, y fijar en su lugar con una sutura de nylon 10-0. (Figura 1B)
NOTA: El dilatador microquirúrgica específica se describe en la tabla de reactivos e instrumentos específicos.
3. aloinjerto Inserción
- Mantener la instrumentación estéril estándar y guantes estériles para colocar el injerto dentro de la región cervical destinatario en un revés y la posición oblicua.
- A continuación, coloque el aor descendente donantelumen de tics más de la construcción del manguito arterial del receptor y fijarlo en su lugar con una sutura de nylon 10-0 (Figura 1C y 1D).
- Moda mismo anastomosis como en el paso 3.2 entre la arteria pulmonar donante y la eversión constructo yugular venosa-manguito exterior del ratón receptor (Figura 1C y 1D).
- Primero quite pinza microvascular venosa (pinza vena yugular externa) y luego liberar la pinza arterial (abrazadera de la arteria carótida común). Durante la reperfusión arterial, inspeccionar la totalidad del aloinjerto para abordar cualquier hemorragia. Si se visualiza la hemorragia, vuelva a aplicar la pinza arterial para minimizar la pérdida de sangre y mitigar la fuente de la hemorragia mediante electrocauterio bipolar.
- Inspeccione el injerto y asegurar la hemostasia. Suelte y retire completamente la pinza microvascular arterial. Observar el corazón a mostrar signos de reperfusión, que serán instantáneamente evidente con la expansión de volumen rápida de las cámaras del corazón, y esperar a que bcomer para comenzar dentro de 0,5 a 1 min. Utilice solución salina tibia (35 ° Celsius) para humedecer el corazón.
- Coloque la pared del pecho en una posición anatómica a fin de no inducir a cualquier formación de cocas o tensiones en las anastomosis. Cierre de la piel de la herida quirúrgica está utilizando 6-0 suturas de nylon continuo (Figura 1E).
4. Cuidado posoperatorio
- Administrar un bolo intraperitoneal 0,3 ml de solución salina normal inmediatamente después de la operación para la reposición de líquidos.
- Entonces inyectar subcutáneamente buprenorfina (0,1 mg / kg) y enrofloxacina (5 mg / kg) para la profilaxis de dolor y la infección, respectivamente.
- Colocar el animal bajo una lámpara de calor hasta que se despierta de la anestesia y volver al decúbito esternal. Durante la recuperación, inspeccione el cuello para visualizar el latido fibrilación del aloinjerto asegurar una adecuada perfusión del injerto.
- Una vez despierto y en la posición reclinada, devuelva el ratón a una jaula separada (sin la compañía de otros ratones) Donde pueda recibir alimentos y agua ad libitum. Debido a cualquier movimiento restrictiva menor temporal de la extremidad superior derecha, deje una fuente de alimento de gelatina en el suelo de la jaula.
- Observe el ratón receptor durante 1 hora después de la operación y luego regresar a su centro de la jaula donde pueda recibir alimentos y agua ad libitum y se inspeccionados tres veces al día durante las primeras 24 horas para la actividad y la ingesta nutricional. Monitorear los ratones para detectar signos de dolor y angustia y re-dosis con buprenorfina (0,1 mg / kg) por vía subcutánea dos veces al día según sea necesario para las primeras 72 horas. Examine los animales todos los días a partir de entonces y les pesan cada semana.
- Consulte con un miembro del personal veterinario, si alguna ratones muestran signos de dolor, angustia, o disminución de la ingesta de alimento. Considere la eutanasia precoz (en nuestro protocolo de la técnica de la eutanasia emplea CO 2 sobredosis de 7 min, seguido por dislocación cervical).
- El cese de los latidos del corazón del aloinjerto se define como un parámetro específico que provocó el ratón para ser sacrificed.
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Representative Results
Singénica C57BL / 6 trasplantes logra la supervivencia a largo plazo. El diseño del aloinjerto (Figura 1) demostró ser un éxito desde una perspectiva supervivencia de los animales y la capacidad de evaluar la supervivencia del aloinjerto en curso. Esto fue demostrado a través de la piel suprayacente seguir siendo viable, crecimiento activo aloinjerto permanente del cabello, y los latidos del corazón pudieron ser evaluados con la visualización y palpación del dedo. Los datos de supervivencia se representa en la figura 2 para los ratones singénicos trasplantados. El tiempo medio de supervivencia fue superior a 109 días. Sobre la base de los datos de supervivencia, es razonable deducir que el aspecto técnico del aloinjerto trasplantado está diseñado para perfundir la totalidad de la pared torácica, el timo, y el corazón. Además, la capacidad de los animales singénicos para sobrevivir a largo plazo apoya, además, que este modelo de ratón no sólo es factible, pero puede ser replicado. Esta prueba de concepto en la pared torácica bloque, el timo y trasplante de corazón valida ªe modelo murino de estudio combinado de órganos sólidos y alotrasplante compuesto vascularizado.
Figura 1. fotos intraoperatorias. (A) La pared torácica, el timo, y aloinjerto de corazón se recupera con éxito, recortado, y se visualizó ex vivo a partir de la cara posterior. Los vasos torácicos internos bilaterales se conservan. (B) El destinatario externo vena yugular (flecha) y la arteria carótida común (punta de flecha) son evertido fijo durante puños poliimida en preparación para la anastomosis vascular. (C) aloinjertos anastomosis vasculares se han completado. La flecha muestra la anastomosis entre la arteria pulmonar donante y el receptor vena yugular externa. La punta de flecha muestra la anastomosis entre la aorta descendente donante y la arteria carótida común destinatario. El asterisco identifica el timo y la pared torácica reflejada se visualizó overlying el timo. (d) Un aumento mayor muestra las anastomosis microvascular-del manguito. (e) la inserción completa del aloinjerto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. en bloque de la pared torácica, el timo, y la supervivencia del injerto cardíaco Kaplan-Meier curvas de supervivencia de la linea de la pared torácica bloque, el timo y alotrasplante corazón en singénica C57BL / 6 ratones (n = 3;. Tiempo medio de supervivencia fue mayor que 109 día). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Hay una multitud de fenómenos que un factor en la investigación inmunológica de alotrasplante, que incluyen pero no se limitan a los mecanismos de rechazo agudo y crónico, la presentación directa e indirecta antígeno, la sensibilización destinatario, o la inducción de quimerismo mixto. 19 Los modelos animales se han convertido el estándar de oro para el estudio de la inmunología del trasplante y modelos de ratón se implementan popularmente debido a su bajo costo, la disponibilidad de ratones transgénicos y knockout de genes, los anticuerpos monoclonales disponibles comercialmente, relativa disminuyó veterinarios y de vivienda demandas, y la facilidad de replicación. Hasta la fecha, varios modelos de trasplante de corazón se han diseñado para estudiar trasplante de órganos sólidos. 19,22-27 Del mismo modo, una gran cantidad de modelos de ratón han sido desarrollados para estudiar allotransplantation compuesto vascularizado. 28 Sin embargo, el estudio de órgano sólido combinado y alotrasplante compuesto vascularizado es limitado,y técnicas aún no se han establecido en los ratones. La pared torácica bloque, el timo y trasplante de corazón en modelo murino que aquí se presenta es una herramienta fiable y reproducible para estudiar los efectos y los mecanismos inmunológicos de órgano sólido combinado y alotrasplante compuesto vascularizado.
Para seguir avanzando en el campo del trasplante, debe llevarse a cabo la promesa de prolongar la supervivencia del injerto y la minimización de la inmunosupresión a través de las modalidades de tratamiento novedosos. Uno de estos métodos es a través de la inducción de quimerismo mixto (injerto parcial de células hematopoyéticas del donante en el receptor), que puede conducir a tolerancia específica del donante sin inmunosupresión, incluso si en algunos casos no se mantiene quimerismo. 29,30 hueso transfusión ósea / El trasplante de órganos sólidos se combina con 31 o vascularizado 32,33 allotransplanation composite requiere una amplia preacondicionamiento planteando un reto importante. Médula ósea vascularizado, unas parte de una construcción aloinjerto compuesto vascularizado, puede evitar este problema. Trasplante de médula ósea vascularizado permite la transferencia ininterrumpida de células de médula ósea del donante dentro del microentorno donante conservado, y se considera que es superior a trasplante de médula ósea celular solo en la inducción de la tolerancia y la reducción de los requisitos de inmunosupresión 34-36. Por otra parte, la incorporación de tejido de timo con el trasplante de la médula ósea vascularizada ha demostrado que aumenta el quimerismo de células T de origen donante en última instancia, jugando un papel de apoyo en la inducción y mantenimiento de quimerismo. 2,9 Las estrategias mencionadas de la prolongación de la supervivencia del injerto y la minimización de la inmunosupresión fue la fundación de conceptualizar un órgano combinado sólido, el timo, y vascularizada modelo de ratón aloinjerto compuesto.
El heterotópico en la pared torácica bloque, el timo y el trasplante de corazón es una amalgama de múltiples sumodelos animales tóricos. Heterotópico trasplante de corazón cervical usando un manguito de sutura no en ratones ha sido bien establecida y considerado técnicamente menos exigente que un heterotópico abdominal trasplante de corazón microvascular. 19 De hecho, la técnica del manguito se ha aplicado en varios otros modelos de trasplante animal. 37-44 heterotópica trasplante esternal en ratas fue introducido en 1999 por Santiago et al. como un método alternativo para estudiar el trasplante de médula ósea vascularizada. 1 Ellos fueron capaces de mostrar quimerismo largo plazo periférica, la tolerancia, y la supervivencia tras el cese de la inmunosupresión en día postoperatorio 30. 1 Bozkurt et al., posteriormente, desarrolló un modelo de rata en 2013 para incorporar el timo y el alcance total de la porción osteomiocutáneo de la pared torácica. Cabe señalar, sin embargo, que este modelo difiere de nuestro modelo en múltiples aspectos. Esto incluye: (1) su modelo de estar desprovisto de cualquier sólidoórganos, (2) se completó en ratas utilizando técnicas de microcirugía tradicionales, (3) la ligadura de los vasos torácicos internos durante la cosecha de donantes, (4) la aplicación de un unilateral, pedículo único a través de una arteria carótida común y la vena yugular externa, y (5 ) el trasplante de aloinjerto en la región inguinal. 2 Sin embargo, su modelo fue capaz de demostrar que el timo del donante origen juega un papel importante no sólo para el aumento de quimerismo sino también para el mantenimiento de quimerismo en comparación con el trasplante de médula ósea vascularizado solo. 2 modelos porcinos posteriores de co-trasplante del timo y corazón han demostrado un efecto superior sobre la supervivencia del aloinjerto de corazón. 10,11 Las ventajas de cada uno de los modelos animales, pero la falta de estudios in vivo mecanicista perteneciente a órgano combinado sólido, el timo, y vascularizada alotrasplante compuesta llevó nuestro grupo para diseñar este modelo.
La experiencia de exejecutora de este novedoso modelo exhibido ciertas lecciones que requieren nuestro equipo para instituir modificaciones con el fin de lograr una mejor supervivencia de los animales. Este modelo se intentó con un operador, que en última instancia, prolongó el tiempo operatorio y anestesia a más de 3-4 horas y prolongado tiempo de isquemia fría. Animales no despertar después de la terminación del procedimiento. La implementación de un enfoque de dos equipo de cortar el tiempo operatorio y anestesia total 90 min. Esto se refleja en 60 minutos el tiempo de anestesia del ratón receptor, y 0-10 min aloinjerto tiempo de isquemia fría. Durante la reperfusión de aloinjertos, el ratón es susceptible a la hemorragia, lo que puede limitar su capacidad de supervivencia en la inmediata peri-operatoria. Abogamos por la inspección minuciosa del aloinjerto ex vivo para posibles fuentes de hemorragia, así como la liberación suave de la pinza microvascular bulldog durante la reperfusión del injerto. Al colocar el aloinjerto en una posición reflejada es más fácil para identificar sitios específicos desangría. Por otra parte, esta posición la inserción de injerto fomenta la disposición más ergonómica de los vasos minimiza el riesgo de torceduras buque. Por último, con el primero 48 h de recuperación, rango superior derecha del ratón receptor extremidad de movimiento puede ser obstaculizada con respecto a subir la jaula para obtener alimento y agua. Por lo tanto, se recomienda la colocación de las fuentes nutricionales de gelatina lo largo de la jaula para facilitar la ingesta nutricional. Normalmente por día postoperatorio 3, rango de movimiento es devuelto dentro de la extremidad superior derecha.
Aunque hay limitaciones a este modelo, que incluyen la necesidad de habilidades técnicas en microcirugía, la disponibilidad de dos microscopios simultáneas, y la exigencia de un enfoque de dos equipos, se ha mostrado, sin embargo, ser un enfoque exitoso para llevar a cabo estudios inmunológicos mecanicistas relacionados con órgano sólido combinado y alotrasplante compuesto vascularizado. Su aplicación más amplia puede contribuir aún más al desarrollo de la novela immunprotocolos osuppressive, estudiando mecánica de rechazo agudo y crónico, y la aplicación de estrategias potenciales para inducir y mantener quimerismo, y prolongan la supervivencia del injerto.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euro-Collins Solution | The solution is not commercially purchased but rather prepared in the laboratory. To make a 500 ml solution add the ingredient listed below to a 330 ml of double distilled water. Mix well, and then fill in the rest of the 170 ml of double distilled water into the solution to a final volume of 500 ml. Ingredients: 1.02 g KH2PO4, 3.66 g K2HPO4, 0.56 g KCl, 0.42 g NaHCO3, and 17.52 g of glucose. |
||
| Suture | Ethilon | MWI 72667 | 6-0 Ethilon https://www.mwivet.com (MWI - Veterinary Supplies) |
| Polyimide Cuff Vein (21G) | Vention Medical | 141-0043 | http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/ |
| Polyimide Cuff Artery (24G) | Vention Medical | 141-0027 | http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/ |
| Soft plastic tip catheter | Terumo | SR*OX2419CA | 24G x 3/4" |
| Microsurgical dilator | S&T | D-5a.1 | Dilator, 11 cm, FH, 0.1 mm AT10d |
References
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