Protocol
Toutes les procédures opérationnelles ont été réalisées en conformité avec l'Université Johns Hopkins et le ministère de l'Agriculture des États-Unis et les exigences de service de la santé publique. Ce protocole suit le Comité soin et l'utilisation des animaux de l'Université Johns Hopkins, comité d'examen institutionnel adopté des lignes directrices (numéro de protocole M013M490). Les données de survie final a été enregistrée pour les procédures chirurgicales décrites ci-dessous. Les deux animaux donateurs et bénéficiaires reçoivent une anesthésie de préemption à l'aide de la buprénorphine à 0,1 mg / kg sc une heure avant la chirurgie et de la buprénorphine animal receveur est ré-administré à la même dose après la transplantation et re-dosé en fonction des besoins dans les premières 48 heures après l'opération.
1. donateurs allogreffe Recovery
Remarque: Commencez la partie donneur de la greffe 40 min plus tôt que la greffe de destinataire pour minimiser le temps d'anesthésie bénéficiaire et pour faciliter un temps de fin simultanée ou légèrement oreilleheure de fin lier par rapport à la préparation de destinataire.
- Utilisez instruments de microchirurgie stériles standard et des gants stériles pour la procédure. Notre laboratoire utilise la stérilisation en autoclave des instruments de microchirurgie.
- Anesthésier la souris donneuse (mâle) en utilisant l'isoflurane induction vaporisateur à 4%. L'aide de tondeuses mécaniques atraumatiques supprimer les cheveux de la cervicale, thoracique et la région abdominale. Placez l'animal en décubitus dorsal et de maintenir l'isoflurane sur 1-2% à travers un cône de nez. Assurer une anesthésie adéquate tout au long de la procédure en évaluant périodiquement le réflexe pincement de l'orteil de retrait.
- Avant l'incision de la peau, largement préparer le dispositif en appliquant povidone iodée antiseptique suivi par l'alcool isopropylique l'aide d'un coton-tige stérile.
- Commencez par une incision cutanée transversale superficielle avec des ciseaux à travers la peau cervicale et abdominale. Reliez les deux incisions bilatéralement le long des lignes axillaire.
- En utilisant des pinces de microchirurgiedisséquer la région cervicale bilatérale pour identifier, ligaturer et diviser les veines jugulaires externes avec 6-0 suture de soie et des ciseaux. Ensuite, en utilisant l'électrocoagulation diviser les muscles sterno pour exposer les veines jugulaires internes et les artères carotides communes, bilatéralement. Passez un fil de suture 6-0 de soie sous le côté gauche et le côté droit de la carotide commune et veines jugulaires internes à la mode en vrac.
NOTE: Elles seront attachées et divisés tard dans l'étape 1.9. - Diviser fortement les muscles de la sangle et tissu cellulaire lâche associé, situé en avant de la trachée, l'aide de ciseaux pour libérer les pièces jointes restants de la région cervicale.
- Bistouri électrique bipolaire et dissection, diviser les grands muscles pectoraux et clavicules pour exposer les vaisseaux sous-claviers et ligaturer (6-0 de suture de soie) et diviser proximale.
- Ensuite, doucement, saisir et retirer le pénis de l'animal. Le long de la face dorsale du pénis visualiser la veine dorsale du pénis, et désinfecter larégion avec de l'alcool isopropylique. En utilisant une aiguille 30 G, injecter 30.000 unités d'héparine par voie intraveineuse à travers la veine dorsale et permettent le pénis pour reculent de retour à sa position initiale. Fuite partielle de la solution d'héparine dans le tissu environnant peut se produire.
- En utilisant les liens en vrac préalablement placés autour de l'artère carotide commune et la veine jugulaire interne, ligaturer et diviser les structures, au niveau bilatéral.
- Utilisation des ciseaux à côté de faire une incision transversale intrabdominal. Éviscérer les intestins pour exposer la infrahepatic la veine cave inférieure et injecter 2 ml de solution de cardioplégie Euro-Collins froid dans le infrahepatic la veine cave inférieure. Assurer injection appropriée en visualisant la décoloration du foie et de la cessation des battements du cœur avant d'avancer à l'étape suivante.
REMARQUE: solution Euro-Collins est préparé dans notre laboratoire, voir tableau de réactifs et d'instruments spécifiques. - Utilisation de ciseaux accéder à la cavité intra-thoracique via une diaph bilatéralincision de l'abdomen ragmatic exposée. Elargir l'incision céphalique à travers les muscles intercostaux et de côtes. Refléter la paroi thoracique exposer le cœur, le thymus, et de grands navires tout en assurant simultanément la préservation des vaisseaux thoraciques internes le long de la paroi thoracique.
- Injecter le sus-hépatique veine cave inférieure avec 4 ml de solution de cardioplégie Euro-Collins froid.
- Identifier la racine de l'aorte et de tracer de manière distale à l'aorte descendante. Réduire fortement l'aorte descendante (préservation de longueur maximale).
- Identifier le tronc pulmonaire et diviser juste en amont de son point de dérivation (préservation de longueur maximale). Ensuite, en utilisant 2 ml de solution de cardioplégie Euro-Collins froide, rincez le tronc pulmonaire et cardiaque en plaçant un cathéter à extrémité en plastique souple dans la lumière de l'artère pulmonaire.
- L'utilisation d'une suture de soie 6-0, et diviser ligaturer la veine cave inférieure, les veines pulmonaires de confluence, et les branches de l'accessoire veine cave supérieure bilatérale. Puis éleveret disséquer le céphalique coeur des pièces jointes le long de la principale bronches souches et de la trachée avec soin de ne pas entrer les voies respiratoires. Bistouri électrique forte et bipolaire disséquer la paroi thoracique, le thymus, et le cœur complètement libérer de la souris donneuse.
- Enfin, couper la paroi thoracique de l'allogreffe ex vivo à une taille plus petite, avec des ciseaux, le long du sternum et costae latéral, avec un soin de ne pas perturber les vaisseaux thoraciques internes (figure 1A). Pour minimiser l'hémorragie après la revascularisation, utiliser electrocauterization bipolaire le long des frontières du sternum osteomusculocutaneous.
- Placez l'allogreffe dans 10 ml de froid (4 o Celcius) solution Euro-Collins si le destinataire est pas préparé pour encart. Toutefois, si le bénéficiaire est prêt à encart, transférer l'allogreffe droite du champ opératoire bénéficiaire.
2. Bénéficiaire Préparation
Remarque: Pour réduire le temps d'anesthésie bénéficiaire,commencer la préparation du destinataire à une station opérationnelle séparée environ 40 min avant la fin de la récolte donneur d'allogreffe.
- Utilisez un ensemble distinct de instruments de microchirurgie stériles standard et des gants stériles pour la procédure.
- Anesthésier la souris receveuse (mâle ou femelle) en utilisant l'isoflurane induction vaporisateur à 4%. L'aide de tondeuses mécaniques atraumatiques enlever les poils de la région cervicale et thoracique droite.
- Placez la souris en position couchée et l'angle du membre supérieur droit légèrement en bas formant un angle de 110 degrés entre la tête et du membre supérieur droit. Maintenir une anesthésie sur 1-2% d'isoflurane à travers un cône de nez.
- Placez pétrole pommade ophtalmique sur les yeux de souris en utilisant un applicateur coton-tige. Avant l'incision de la peau, largement préparer le site opératoire en utilisant povidone iodée antiseptique suivi par l'alcool isopropylique.
- Avec des ciseaux, faire une incision de la peau de la ligne médiane le long de la bor inférieure droiteder de la mandibule et d'étendre l'incision inféro- latéralement à la région thoracique droite. Utilisation de dissection avec des pinces microvasculaires, mobiliser la veine jugulaire externe par la circonférence gratuitement le navire de tissus mous et adventice. Divisez toutes les branches à l'aide de l'électrocoagulation, et enlever le lobe droit de la glande sous-maxillaire utilisant dissection et l'électrocoagulation à l'espace libre pour l'allogreffe.
- Assurer suffisamment de longueur de la veine jugulaire externe à se retourner sur un brassard, et ligaturer la veine jugulaire externe utilisant une suture de soie 6-0. Insérez la veine à travers la lumière d'un brassard prédécoupée de polyimide et d'utiliser une pince bulldog microvasculaire de fixer le complexe navire-manchette en place. Ensuite, en utilisant des ciseaux, proximale diviser la veine jugulaire externe, Evert sur le brassard, et fixer en place avec une suture de nylon 10-0. (Figure 1B)
- Diviser le muscle sterno droite avec électrocoagulation bipolaire pour exposer l'artère carotide commune. Mob circonférenceilize l'artère céphalique au point le plus distal dans la région cervicale. Ceci est accompli en utilisant dissection du navire avec une pince pour enlever les tissus mous et adventice environnante.
- Utilisation 6-0 suture de soie, ligaturer et de diviser l'artère carotide commune. Passez l'artère à travers la lumière d'un brassard prédécoupée polyimide et le fixer en place avec une pince microvasculaire bulldog aussi près de l'entrée thoracique que possible. Diviser le navire distale, dilater doucement le récipient à l'aide d'un dilatateur microchirurgicale, Evert sur le brassard, et fixer en place avec une suture de nylon 10-0. (Figure 1B)
NOTE: Le dilatateur microchirurgicale spécifique est décrite dans le tableau de réactifs et d'instruments spécifiques.
3. allogreffe Inset
- Maintenir l'instrumentation stérile standard et des gants stériles pour placer l'allogreffe dans le destinataire région cervicale à l'envers et la position oblique.
- Ensuite, placez l'AOR donateurs descendantelumière tic plus de la construction de manchette artérielle du destinataire et le fixer en place avec une suture de nylon 10-0 (figure 1C et 1D).
- Façonner la même anastomose comme dans l'étape 3.2 entre l'artère pulmonaire du donneur et l'éversé construction veine jugulaire-brassard externe de la souris receveuse (figure 1C et 1D).
- Commencez par retirer pince microvasculaire veineuse (de serrage de la veine jugulaire externe), puis relâchez la pince artérielle (carotide commune de serrage de l'artère). Au cours de la reperfusion artériel, inspecter la totalité de l'allogreffe de traiter toute hémorragie. Si l'hémorragie est visualisé, réappliquer la pince artérielle pour minimiser la perte de sang et d'atténuer la source d'une hémorragie par électrocoagulation bipolaire.
- Inspectez la greffe et d'assurer l'hémostase. Libérer et retirer complètement la pince artérielle microvasculaire. Observez le cœur à montrer des signes de reperfusion, qui seront instantanément apparente avec l'expansion du volume rapide des cavités cardiaques, et d'attendre que bmanger pour commencer dans les 0,5-1 min. Utilisez saline chaude (35 ° Celsius) pour humidifier le cœur.
- Drapé de la paroi thoracique dans une position anatomique afin de ne pas induire de vrillage ou de tensions sur les anastomoses. Fermez la peau de la plaie chirurgicale est en utilisant 6-0 sutures continues de nylon (figure 1E).
4. Soins postopératoires
- Administrer un fluide intrapéritonéale bolus de solution saline 0,3 ml normale immédiatement après l'opération pour le remplacement des liquides.
- Puis injecter en sous-cutané de la buprénorphine (0,1 mg / kg) et de l'enrofloxacine (5 mg / kg) pour la prophylaxie de la douleur et de l'infection, respectivement.
- Placez l'animal sous une lampe de chaleur jusqu'à ce que le réveil de l'anesthésie et de revenir à décubitus sternal. Lors de la récupération, inspecter le col de visualiser le battement de coeur en fibrillation de l'allogreffe assurer perfusion d'allogreffe adéquate.
- Une fois éveillé et dans la position couchée, retourner la souris dans une cage séparée (sans la compagnie d'autres souris) Où il peut recevoir de la nourriture et l'eau ad libitum. En raison de tout mouvement mineur restrictive temporaire du membre supérieur droit, laisser une source de nourriture de gélatine sur le plancher de la cage.
- Observez la souris receveuse pour 1 h après l'opération, puis le retourner à l'établissement de la cage où il peut recevoir de la nourriture et de l'eau ad libitum et est inspecté trois fois par jour pendant les 24 premières heures pour l'activité et l'apport nutritionnel. Surveiller les souris des signes de douleur et de détresse et de re-dose avec la buprénorphine (0,1 mg / kg) sous-cutanée deux fois par jour au besoin pendant les 72 premières heures. Examiner les animaux tous les jours par la suite et les peser chaque semaine.
- Consultez un membre du personnel vétérinaire si des souris montrent des signes de douleur, la détresse, ou diminution de la consommation d'alimentation. Envisager l'euthanasie précoce (dans notre protocole de la technique de l'euthanasie emploie CO 2 surdosage pendant 7 min, suivie par dislocation cervicale).
- Cessation des battements du cœur de l'allogreffe est définie comme un effet spécifique incitant la souris pour être sacrificed.
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Representative Results
Syngéniques C57BL / 6 greffes atteint survie à long terme. La conception de l'allogreffe (Figure 1) est avérée réussie du point de vue de la survie des animaux et la capacité à évaluer la survie d'allogreffe en cours. Cela a été démontré par la peau sus-jacente reste la croissance viables, actifs allogreffe continue cheveux, et battements de coeur ont pu être évalués avec la visualisation et la palpation. Données de survie est représenté sur la figure 2 pour les souris syngéniques transplantées. Le temps de survie moyen était supérieure à 109 jours. Sur la base des données de survie, il est raisonnable d'en déduire que l'aspect technique de la transplantation d'allogreffe est conçu pour perfuser la totalité de la paroi thoracique, le thymus, et le cœur. En outre, la capacité des animaux syngéniques pour survivre à long terme qui prend en charge plus ce modèle de souris est non seulement possible, mais peut être répliquée. Cette preuve de concept en bloc paroi thoracique, le thymus, et transplantation cardiaque valide èmee modèle murin d'étude combinée organe solide et allotransplantation composite vascularisée.
Figure 1. Photos peropératoires. (A) de la paroi thoracique, le thymus, et le cœur allogreffe est récupéré avec succès, coupé, et visualisé ex vivo à partir de la face postérieure. Les vaisseaux thoraciques internes bilatérales sont préservés. (B) Le destinataire externe veine jugulaire (flèche) et l'artère carotide commune (pointe de flèche) sont éversé fixe sur les poignets de polyimide en préparation pour l'anastomose vasculaire. (C) allogreffes anastomoses vasculaires sont terminées. La flèche indique l'anastomose entre l'artère pulmonaire de donneur et le receveur veine jugulaire externe. La flèche montre l'anastomose entre l'aorte descendante donneur et le receveur artère carotide commune. L'astérisque identifie le thymus et la paroi thoracique réfléchie est visualisé Surpressionying le thymus. (d) Un plus fort grossissement montre les anastomoses microvasculaires-manchette. (e) allogreffe complète encart. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. En bloc paroi thoracique, le thymus, et le cœur allogreffe survie de Kaplan-Meier courbes de survie de la salle de la paroi thoracique de bloc, le thymus, et le cœur allogreffe dans syngénéique C57BL / 6 (n = 3;. Durée moyenne de survie était supérieur à 109 jours). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Il existe une multitude de phénomènes qui tenir compte dans l'enquête immunologique de l'allotransplantation, qui comprennent, mais ne sont pas limités à des mécanismes de rejet aigu et chronique, la présentation directe et indirecte antigène, une sensibilisation de la destinataire, ou l'induction de chimérisme mixte. 19 modèles animaux sont devenus l'étalon-or pour l'étude de l'immunologie de transplantation, et des modèles de souris sont populairement mises en œuvre en raison de leur faible coût, la disponibilité des souris transgéniques et knock-out du gène, les anticorps monoclonaux disponibles dans le commerce, par rapport a diminué la demande de vétérinaires et de logement, et la facilité de réplication. À ce jour, les modèles de transplantation cardiaque multiples ont été conçus pour étudier la transplantation d'organes solides. 19,22-27 De même, une pléthore de modèles de souris ont été développés pour étudier allotransplantation composite vascularisée. 28 Cependant, l'étude de l'organe solide combiné et allotransplantation composite vascularisée est limité,et techniques doivent encore être mis en place chez la souris. La paroi thoracique de bloc, le thymus, et la transplantation cardiaque en modèle murin présenté ici est un outil fiable et reproductible pour étudier les effets et les mécanismes immunologiques de organe solide combiné et allotransplantation composite vascularisée.
Pour faire progresser le domaine de la transplantation, la promesse de prolonger la survie des allogreffes et la minimisation de l'immunosuppression par le biais de nouvelles modalités de traitement doit être poursuivi. Une telle approche est par l'induction de chimérisme mixte (de la prise de greffe partielle de cellules hématopoïétiques du donneur chez le receveur), qui peut conduire à une tolérance spécifique donateurs gratuitement immunosuppression, même si, dans certains cas chimérisme est pas soutenue. 29,30 Os transfusion de moelle / jumelé avec la transplantation d'organes solides 31 ou composite vascularisée allotransplanation 32,33 nécessite une préconditionnement posant un défi important. Vascularisée moelle osseuse, unes le cadre d'une allogreffe composite vascularisée construction, peut contourner ce problème. Transplantation de moelle osseuse vascularisée permet le transfert sans interruption de cellules de moelle osseuse du donneur à l'intérieur de la micro-donneur conservé, et est considéré comme supérieur à cellules de moelle osseuse seul dans l'induction de la tolérance et de la réduction des exigences en matière d'immunosuppression. 34-36 outre, l'incorporation de tissu thymus avec greffe de moelle osseuse vascularisée a montré pour augmenter chimérisme T-cellule d'origine des donateurs jouer finalement un rôle de soutien dans l'induction et le maintien de chimérisme. 2,9 Les stratégies précitées de prolonger la survie des allogreffes et de minimiser l'immunosuppression a été le fondement de conceptualiser un organe solide combinée, le thymus, et le modèle de la souris vascularisée d'allogreffe composite.
Le mur hétérotopique en bloc de la poitrine, le thymus, et la transplantation cardiaque est un amalgame de multiples sondes modèles animaux torique. Transplantation cardiaque hétérotopique col de l'utérus à l'aide d'un brassard non-suture chez la souris a été bien établie et jugée techniquement moins exigeante qu'une hétérotopique abdominale transplantation cardiaque microvasculaire. 19 En fait, la technique du brassard a été mis en œuvre dans plusieurs autres modèles animaux de transplantation. 37-44 Heterotopic transplantation sternale chez les rats a été introduit en 1999 par Santiago et al. comme une méthode alternative pour étudier la transplantation de moelle osseuse vascularisée. 1 Ils ont pu montrer chimérisme à long terme périphérique, la tolérance, et la survie après l'arrêt de l'immunosuppression le jour postopératoire 30. 1 Bozkurt et al. a ensuite développé un modèle de rat en 2013 pour intégrer le thymus et la pleine mesure de la partie ostéomyocutané de la paroi thoracique. Il convient de noter, toutefois, que ce modèle diffère du modèle à plusieurs aspects. Cela comprend: (1) leur modèle étant dépourvu de tout solideorganes, (2) en cours d'achèvement chez les rats en utilisant des techniques de microchirurgie traditionnels, (3) la ligature des vaisseaux thoraciques internes lors de la récolte des bailleurs de fonds, (4) la mise en œuvre d'un unilatérale, seul pédicule via une artère carotide commune et la veine jugulaire externe, et (5 ) la transplantation de l'allogreffe dans la région inguinale 2. Néanmoins, leur modèle a été en mesure de démontrer que le thymus des donateurs d'origine joue un rôle important non seulement pour le chimérisme augmentation mais aussi pour l'entretien de chimérisme par rapport à la greffe de moelle osseuse vascularisée seul. 2 modèles porcine ultérieures de co-greffe du thymus et le coeur ont montré un effet supérieur sur la survie coeur d'allogreffe. 10,11 les avantages de chacun des modèles animaux, mais le manque de mécanique des études in vivo concernant organe combinée solide, le thymus, et vascularisée allotransplantation composite a incité notre groupe pour concevoir ce modèle.
L'expérience executing ce nouveau modèle exposé certaines leçons nécessitant notre équipe d'instituer des modifications afin de parvenir à une meilleure survie des animaux. Ce modèle a été tentée avec un opérateur, qui a finalement prolongé le temps opératoire et de l'anesthésie à plus de 3-4 h et également prolongé le temps d'ischémie froide. Animaux ne seraient pas réveiller après la fin de la procédure. La mise en œuvre d'une approche de deux équipes a coupé le temps opératoire et de l'anesthésie totale à 90 min. Cela reflète en 60 min le temps de l'anesthésie de la souris receveuse, et 0-10 min allogreffe temps d'ischémie froide. Pendant allogreffe reperfusion, la souris est sensible à l'hémorragie, ce qui peut limiter sa survie dans l'immédiat péri-opératoire. Nous préconisons inspection minutieuse de l'allogreffe ex vivo pour les sources potentielles de l'hémorragie, ainsi que la libération douce de la pince bulldog microvasculaire lors de allogreffe reperfusion. En plaçant l'allogreffe dans une position réfléchie il est plus facile d'identifier des sites spécifiques desaignement. En outre, cette position greffe encart favorise la mise la plus ergonomique de navires minimise le risque de vrillage navire. Enfin, avec les 48 premières heures de la reprise, droit de gamme extrémité supérieure de la souris receveuse de mouvement peut être entravé à l'égard de l'escalade de la cage pour obtenir de la nourriture et de l'eau. Par conséquent, nous recommandons de placement de gélatine sources alimentaires le long de la cage afin de faciliter l'apport nutritionnel. Typiquement par jour postopératoire 3, gamme complète de mouvement est retourné dans l'extrémité supérieure droite.
Bien qu'il existe des limites à ce modèle, qui comprennent la nécessité de compétences techniques en microchirurgie, la disponibilité de deux microscopes simultanés, et l'exigence d'une approche de deux équipes, il a néanmoins montré pour être une approche efficace pour réaliser des études immunologiques mécanistes liés à organe solide combiné et allotransplantation composite vascularisée. Son application plus large peut en outre contribuer à développer de nouveaux immunprotocoles osuppressive, mécaniciens étudient de rejet aigu et chronique, et la mise en œuvre des stratégies potentielles pour induire et maintenir chimérisme, et prolongent la survie de l'allogreffe.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euro-Collins Solution | The solution is not commercially purchased but rather prepared in the laboratory. To make a 500 ml solution add the ingredient listed below to a 330 ml of double distilled water. Mix well, and then fill in the rest of the 170 ml of double distilled water into the solution to a final volume of 500 ml. Ingredients: 1.02 g KH2PO4, 3.66 g K2HPO4, 0.56 g KCl, 0.42 g NaHCO3, and 17.52 g of glucose. |
||
| Suture | Ethilon | MWI 72667 | 6-0 Ethilon https://www.mwivet.com (MWI - Veterinary Supplies) |
| Polyimide Cuff Vein (21G) | Vention Medical | 141-0043 | http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/ |
| Polyimide Cuff Artery (24G) | Vention Medical | 141-0027 | http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/ |
| Soft plastic tip catheter | Terumo | SR*OX2419CA | 24G x 3/4" |
| Microsurgical dilator | S&T | D-5a.1 | Dilator, 11 cm, FH, 0.1 mm AT10d |
References
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