Protocol
Todos os procedimentos cirúrgicos foram concluídos em conformidade com a Universidade Johns Hopkins e do Departamento de Agricultura dos Estados Unidos e os requisitos de Serviço de Saúde Pública. Este protocolo segue o Comité de Johns Hopkins University Animal Care e Use, conselho de revisão institucional aprovou orientações (número de protocolo M013M490). Dados de sobrevivência final foi registrada para os procedimentos cirúrgicos descritos abaixo. Dador e do receptor animais recebem anestesia de preferência usando a buprenorfina a 0,1 mg / kg sc uma hora antes da cirurgia e no buprenorfina animal receptor é re-administrado na mesma dose após o transplante e re-administrado como necessário, nas primeiras 48 horas depois da cirurgia.
1. Doadores Allograft Recovery
Nota: Comece a porção doador do transplante 40 min mais cedo do que o transplante de destinatário para minimizar o tempo de anestesia destinatário e para facilitar um tempo do fim simultânea ou ligeiramente ouvidotempo do fim Lier versus a preparação destinatário.
- Use instrumentos de microcirurgia estéreis padrão e luvas estéreis para o procedimento. Nosso laboratório utiliza esterilização autoclave de instrumentos de microcirurgia.
- Anestesiar o rato doador (masculino) usando isoflurano vaporizador indução em 4%. Usando cortadores mecânicos atraumáticas remover o cabelo da cervical, torácica, e na região abdominal. Colocar o animal na posição supina e manter isoflurano em 1-2% através de um cone do nariz. Certifique-se anestesia adequada em todo o processo por avaliar periodicamente o reflexo toe pitada retirada.
- Antes da incisão na pele, amplamente preparar o dispositivo através da aplicação de anti-séptico iodopovidona seguido de álcool isopropílico com um cotonete estéril.
- Comece com uma incisão cutânea transversal superficial com uma tesoura em toda a pele cervical e abdominal. Ligar as duas incisões bilateralmente ao longo das linhas axilar média.
- Utilizando uma pinça microcirúrgicadissecar a região cervical bilateral para identificar, ligar e dividir as veias jugulares externas com fio de seda 6-0 e tesoura. Em seguida, utilizando eletrocautério dividir os esternocleidomastoideo para expor as veias jugulares internas e artérias carótidas comuns, bilateralmente. Passe uma sutura de seda 6-0 sob o lado esquerdo eo lado direito da carótida comum e veias jugulares internas na forma a granel.
NOTA: Eles vão ser amarrado e dividida mais tarde no Passo 1.9. - Acentuadamente dividir os músculos cinta e tecido areolar frouxo associados, localizados anteriormente à traquéia, usando uma tesoura para libertar os restantes anexos da região cervical.
- Utilizando o eletrocautério bipolar e dissecção afiada, dividir os principais músculos peitorais e clavículas para expor os vasos subclávia e ligar (6-0 seda) e dividir proximal.
- Em seguida, delicadamente, agarrar e retirar o pênis do animal. Ao longo do dorso do pénis visualizar a veia dorsal do pénis, e o desinfectarregião com álcool isopropílico. Usando uma agulha de 30 G, injectar 30.000 unidades de heparina por via intravenosa através da veia dorsal do pénis e permitir que os a recuar para trás para a sua posição original. O vazamento parcial da solução de heparina para o tecido circundante pode ocorrer.
- Usando os laços granel previamente colocados ao redor da artéria carótida comum e veia jugular interna, ligar e dividir as estruturas, bilateralmente.
- Use a tesoura próximos para fazer uma incisão intrabdominal transversal. Eviscerar os intestinos para expor a veia cava inferior infrahepatic injectar e 2 ml de solução cardioplégica a frio de Euro-Collins na infrahepatic veia cava inferior. Certifique-se de injecção adequada, visualizando descoloração fígado e cessação do batimento cardíaco antes de avançar para o passo seguinte.
NOTA: solução de Euro-Collins é preparado em nosso laboratório, consulte a tabela de reagentes e instrumentos específicos. - Usando uma tesoura aceder à cavidade intratorácica através de um diaph bilateralincisão ragmatic do abdômen exposto. Estender a incisão cefálica através dos músculos intercostais e costelas. Reflita parede torácica expondo o coração, timo, e grandes vasos, assegurando simultaneamente a preservação dos vasos torácicos internos ao longo da parede torácica.
- Injectar a suprahepática veia cava inferior com 4 ml de solução de cardioplegia fria Euro-Collins.
- Identificar a raiz da aorta e traçar distal à aorta descendente. Cortou drasticamente a aorta descendente (preservando comprimento máximo).
- Identificar o tronco pulmonar e dividir apenas proximal ao seu ponto de ramificação (preservando comprimento máximo). Em seguida, usando 2 ml de solução de cardioplegia fria Euro-Collins, lave o tronco pulmonar e cardíaca, colocando uma ponta de cateter plástico macio para o lúmen do tronco pulmonar.
- Usando um fio de seda 6-0, ligadura e dividir a veia cava inferior, confluência das veias pulmonares, e ramos acessórios da veia cava superior bilateral. Em seguida, elevee dissecar o cefálica coração dos apegos ao longo da dos brônquios fonte e traquéia, com cuidado para não entrar as vias aéreas. Utilizando o eletrocautério bipolar agudo e dissecar a parede torácica, timo, coração e liberando-lo completamente do camundongo doador.
- Finalmente, a guarnição da parede torácica processo de rejeição ao ex vivo para um tamanho menor, com uma tesoura, ao longo do esterno e costelas lateral, com o cuidado de não perturbar os vasos torácicos internos (Figura 1A). Para minimizar hemorragia após a revascularização, usar eletrocautério bipolar ao longo das fronteiras do esterno osteomusculocutaneous.
- Coloque o allograft em 10 ml de frio (4 ° Celsius) solução Euro-Collins se o destinatário não está preparado para inserção. No entanto, se o destinatário está pronto para inserir, transferir o allograft direto para o campo operatório destinatário.
2. Destinatário Preparação
Nota: Para minimizar o tempo de anestesia destinatário,começar a preparação destinatário em um posto operativo separado cerca de 40 min antes do término da colheita doador do enxerto.
- Use um conjunto separado de instrumentos de microcirurgia estéreis padrão e luvas estéreis para o procedimento.
- Anestesiar o mouse destinatário (masculino ou feminino) usando isoflurano vaporizador indução em 4%. Usando cortadores mecânicos atraumáticas remover os pêlos da região cervical e torácica direita.
- Posicione o mouse na posição supina e ângulo do membro superior direito ligeiramente inferiormente formando um ângulo de 110 graus entre a cabeça e membro superior direito. Manter a anestesia em 1-2% de isoflurano através de um cone do nariz.
- Coloque petróleo pomada oftálmica nos olhos de ratinhos usando um aplicador de ponta de algodão. Antes da incisão na pele, amplamente preparar o local da cirurgia usando anti-séptico iodopovidona seguido de álcool isopropílico.
- Com uma tesoura, faça uma incisão na pele da linha média ao longo da bor inferior direitoder da mandíbula e estender a incisão ínfero-lateralmente à região torácica direita. Usando dissecção romba com pinças microvasculares, mobilizar a veia jugular externa por circunferencial livre do navio do tecido mole e adventícia. Divida todos os ramos usando bisturi elétrico, e remover o lobo direito da glândula submandibular com dissecção aguda e eletrocautério para espaço livre para o processo de rejeição.
- Assegurar comprimento suficiente da veia jugular externa para everter ao longo de um punho, e ligar a veia jugular externa utilizando uma sutura de seda 6-0. Inserir a veia através do lúmen de um manguito pré-cortada poliimida e usar um grampo microvascular buldogue para fixar a bainha-conduta complexo navio no lugar. Em seguida, usando uma tesoura, proximal dividir a veia jugular externa, Evert sobre o punho, e fixar no lugar com uma sutura de nylon 10-0. (Figura 1B)
- Divida o músculo esternocleidomastóideo direito com bisturi elétrico bipolar para expor a artéria carótida comum. Mob circunferencialilize artéria cefálica ao ponto mais distal na região cervical. Isto é conseguido utilizando uma dissecção romba do recipiente com fórceps para remover o tecido mole circundante e adventícia.
- Usando 6-0 sutura de seda, ligadura e dividir a artéria carótida comum. Passe a artéria através do lúmen de um manguito precut poliimida e corrigi-lo no lugar com um bulldog microvascular braçadeira tão perto da entrada torácica possível. Divida o vaso distalmente, dilatar suavemente a embarcação usando um dilatador microcirúrgica, Evert sobre o punho, e fixar no lugar com uma sutura de nylon 10-0. (Figura 1B)
NOTA: O dilatador microcirúrgico específico é descrito na tabela de reagentes e instrumentos específicos.
3. Allograft Inset
- Manter instrumentação estéril padrão e luvas estéreis para colocar enxerto na região cervical do destinatário em um de cabeça para baixo e posição oblíqua.
- Em seguida, coloque o aor doador descendentelúmen tic sobre a construção manguito arterial do destinatário e corrigi-lo no lugar com uma sutura de nylon 10-0 (Figura 1C e 1D).
- Moldar o mesmo anastomose como no passo 3.2 entre a artéria pulmonar doador eo evertida construção veia jugular-cuff externo do mouse destinatário (Figura 1C e 1D).
- Primeiro remova grampo microvascular venoso (veia jugular externa braçadeira) e em seguida, solte o grampo arterial (braçadeira artéria carótida comum). Durante reperfusão arterial, inspecionar a totalidade do enxerto para resolver qualquer hemorragia. Se a hemorragia é visualizado, reaplique o grampo arterial para minimizar a perda de sangue e mitigar a fonte da hemorragia utilizando o eletrocautério bipolar.
- Inspecione o enxerto e garantir a hemostasia. Solte e remova completamente o grampo microvascular arterial. Observe o coração a mostrar sinais de reperfusão, que serão instantaneamente aparente com a expansão rápida de volume das câmaras cardíacas, e esperar por bcomer para começar dentro de 0,5-1 min. Use soro fisiológico morno (35 ° Celsius) para umedecer o coração.
- Armar a parede torácica em uma posição anatômica de modo a não induzir qualquer acotovelamento ou tensões nas anastomoses. Fechar a pele da ferida cirúrgica é utilizando 6-0 suturas de nylon contínua (Figura 1E).
4. Cuidados Pós-Operatórios
- Administrar um bolus fluido intraperitoneal de solução salina 0,3 ml normais imediatamente no pós-operatório para a reposição de líquidos.
- Em seguida, por via subcutânea injetar buprenorfina (0,1 mg / kg) e enrofloxacina (5mg / kg) para dor e infecção profilaxia, respectivamente.
- Colocar o animal sob uma lâmpada de calor até que acordar da anestesia e voltar ao decúbito esternal. Durante a recuperação, inspecionar o pescoço para visualizar os batimentos cardíacos fibrillating do enxerto assegurando a perfusão do enxerto adequado.
- Uma vez acordado e na posição de decúbito, devolver o mouse para uma gaiola separado (sem a companhia de outros ratos) Onde ele pode receber comida e água ad libitum. Devido a qualquer movimento restritiva menor temporária do membro superior direito, deixar uma fonte de alimento de gelatina no chão da gaiola.
- Observe o mouse destinatário durante 1 h de pós-operatório e, em seguida, devolvê-lo à facilidade gaiola onde ele pode receber comida e água ad libitum e é inspecionada três vezes por dia durante as primeiras 24 horas de atividade e ingestão nutricional. Monitorar ratinhos relativamente a sinais de dor e sofrimento e re-doses com buprenorfina (0,1 mg / kg) por via subcutânea duas vezes por dia, conforme necessário para a primeira 72 h. Examine os animais diariamente a partir daí e pesá-los a cada semana.
- Consultar com um membro do pessoal veterinário se houver ratos mostrar sinais de dor, angústia, ou a diminuição da ingestão de alimentos para animais. Considere eutanásia no início (no nosso protocolo emprega a técnica eutanásia CO 2 sobredosagem durante 7 min, seguido por deslocação cervical).
- Cessação do batimento cardíaco do enxerto é definido como um parâmetro específico levando o mouse para ser sacrificed.
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Representative Results
Singênico C57BL / 6 transplantes alcançada a sobrevivência a longo prazo. O design do enxerto (Figura 1) provou ser bem sucedida a partir de uma perspectiva de sobrevivência do animal e a capacidade para avaliar a sobrevivência de aloenxertos em curso. Isso foi demonstrado através da pele sobrejacente permanecer viável, ativa o crescimento do cabelo do enxerto em curso, e os batimentos cardíacos foram capazes de ser avaliada com visualização e palpação do dedo. Dados de sobrevivência é representada na Figura 2 para ratinhos singeneicos transplantado. O tempo médio de sobrevivência era superior a 109 dias. Com base nos dados de sobrevivência, é razoável inferir que o aspecto técnico do enxerto transplantado é concebida para perfundir a totalidade da parede torácica, timo, coração e. Além disso, a capacidade dos animais singeneicos para sobreviver a longo prazo, ainda, que suporta este modelo de ratinho não é só possível, mas pode ser replicado. Esta prova-de-conceito en bloc parede torácica, timo e transplante de coração valida the modelo murino de estudo combinado de órgãos sólidos e alotransplante composto vascularizado.
Figura 1. fotos intra-operatórias. (A) A parede torácica, timo, e aloenxerto cardíaco é recuperado com sucesso, aparado, e visualizada ex vivo a partir do aspecto posterior. Os vasos torácicos internos bilaterais são preservados. (B) O destinatário externo veia jugular (seta) e da artéria carótida comum (seta) são evertida fixo durante punhos poliimida em preparação para a anastomose vascular. (C) allograft anastomoses vasculares estão concluídas. A seta indica a anastomose entre a artéria pulmonar dador eo receptor veia jugular externa. A seta mostra a anastomose entre a aorta descendente doador e da artéria carótida comum destinatário. O asterisco identifica o timo e da parede torácica refletida é visualizado overlying do timo. (d) A maior ampliação mostra a anastomose microvascular-manguito. (e) completa inserção do enxerto. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. em bloco da parede torácica, timo, coração e a sobrevivência do aloenxerto curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier da parede torácica bloco, timo, coração e alotransplante em singeneicos C57BL / 6 ratos PT (n = 3;. O tempo médio de sobrevivência era superior a 109 dias). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Há uma infinidade de fenómenos que factor para a investigação imunológica de alotransplante, que incluem mas não estão limitados a mecanismos de rejeição aguda e crónica, apresentação directa e indirecta antigénio, sensibilização destinatário, ou a indução de quimerismo misto. 19 Modelos animais se tornaram o padrão-ouro para o estudo da imunologia do transplante, e mouse modelos são popularmente implementada devido ao seu baixo custo, disponibilidade de camundongos transgênicos e knockout gene, os anticorpos monoclonais comercialmente disponíveis, relativa diminuiu veterinários e habitação demandas, ea facilidade de replicação. Até à data, modelos de transplante de coração múltiplas foram concebidos para estudar o transplante de órgãos sólidos. 19,22-27 Do mesmo modo, uma multiplicidade de modelos de rato foram desenvolvidos para estudar alotransplante compósito vascularizado. 28 No entanto, o estudo de órgão sólido combinado e alotransplante compósito vascularizado é limitado,e técnicas têm ainda a ser estabelecida em camundongos. A parede torácica en bloc, timo e transplante de coração modelo murino aqui apresentada é uma ferramenta confiável e replicável para estudar os efeitos e mecanismos imunológicos de órgão sólido combinado e alotransplante composto vascularizado.
Para avançar ainda mais a área de transplante, a promessa de prolongar a sobrevida do enxerto e minimização da imunossupressão através de novas modalidades de tratamento deve ser prosseguido. Uma tal abordagem é através da indução de quimerismo misto (enxerto parcial de células hematopoiéticas do doador no receptor), o que pode levar a tolerância específica do doador livre de imunossupressão, mesmo se em alguns casos quimerismo não é sustentado. Transfusão de medula óssea 29,30 / transplante de órgãos sólidos emparelhado com 31 ou vascularizado 32,33 allotransplanation compósito requer extensa pré-condicionamento que representa um desafio significativo. Medula óssea vascularizada, umas parte de uma construção do enxerto composto vascularizado, pode contornar este problema. O transplante de medula óssea vascularizada permite a transferência sem interrupções de células da medula óssea de doadores dentro do microambiente do doador preservada, e é considerada como sendo superior ao transplante de medula óssea celular sozinha na indução da tolerância e redução dos requisitos de imunossupressão. 34-36 Além disso, a incorporação de tecido do timo com transplante de medula óssea vascularizada tem mostrado aumentar quimerismo de células T de origem doador em última análise, desempenhando um papel de apoio na indução e manutenção de quimerismo. 2,9 As estratégias de prolongar a sobrevida do enxerto e minimizando imunossupressão foi a fundação para conceituar acima mencionados um órgão sólido combinado, timo, e modelo de rato compósito aloenxerto vascularizado.
O heterotópico en bloc parede torácica, timo e transplante cardíaco é uma amálgama de múltipla seumodelos animais tóricos. Transplante cardíaco heterotópico cervical usando um manguito não-sutura em ratos tem sido bem estabelecida e considerada tecnicamente menos exigente do que um transplante cardíaco heterotópico abdominal microvascular. 19 De fato, a técnica manguito foi implementado em vários outros modelos de transplante animal. 37-44 Heterotopic esternal transplante em ratos foi introduzido em 1999 por Santiago et al., como um método alternativo para estudar o transplante de medula óssea vascularizada. 1 Eles foram capazes de mostrar quimerismo longo prazo periférica, tolerância e sobrevivência após a cessação da imunossupressão no dia de pós-operatório 30. 1 Bozkurt et al., posteriormente, desenvolveu um modelo de rato em 2013 para incorporar o timo e toda a extensão da parte osteomyocutaneous da parede torácica. Deve notar-se, no entanto, que este modelo difere do nosso modelo em múltiplos aspectos. Isto inclui: (1) o seu modelo, sendo desprovida de qualquer sólidoórgãos, (2) a ser completada em ratos utilizando técnicas microcirúrgicas tradicionais, (3) ligação dos vasos torácicas internas durante a colheita dador, (4) aplicação de uma unilateral, único pedículo através de uma artéria carótida comum e a veia jugular externa, e (5 ) transplante de aloenxerto para a região inguinal 2. No entanto, o modelo foi capaz de demonstrar que o timo de doador-origem desempenha um papel importante não só para quimerismo de reposição, mas também para a manutenção quimerismo em comparação com o transplante de medula óssea vascularizado sozinho. 2 modelos suínos subsequentes de co-transplantação do timo e do coração têm demonstrado um efeito superior no sobrevivência do aloenxerto do coração. 10,11 As vantagens de cada um dos modelos animais, mas a falta de mecanicista estudos in vivo pertencente ao órgão sólido combinado, timo, e vascularizado alotransplante composto solicitado o nosso grupo para a concepção deste modelo.
A experiência executing este romance modelo exibiu certas lições que requerem a nossa equipe de instituir modificações, a fim de conseguir uma melhor sobrevivência animal. Este modelo foi tentada com um operador, que em última análise prolongou o tempo de cirurgia e anestesia para mais de 3-4 horas e também o tempo de isquemia fria prolongada. Animais não iria acordar após o término do procedimento. Implementação de uma abordagem de duas equipes cortar o tempo de cirurgia e anestesia total a 90 min. Isto reflecte-se 60 min tempo de anestesia do mouse destinatário e 0-10 min allograft tempo de isquemia fria. Durante reperfusão do enxerto, o rato é suscetível a hemorragia, o que pode limitar a sua capacidade de sobrevivência no imediato peri-operatória. Defendemos exame minucioso processo de rejeição ao ex vivo para potenciais fontes de hemorragia, assim como a liberação suave do grampo bulldog microvascular durante allograft reperfusão. Ao colocar o aloenxerto reflectida numa posição que é mais fácil para identificar sítios específicos desangramento. Além disso, nesta posição de inserção do enxerto promove a disposição mais ergonómica de vasos minimiza o risco de torção navio. Por último, com a primeira 48 horas de recuperação, intervalo superior direito do rato destinatário extremidade do movimento pode ser prejudicada com relação à escalada da gaiola para obter alimentos e água. Portanto, recomendamos a colocação de fontes nutricionais de gelatina ao longo da gaiola para facilitar a ingestão nutricional. Normalmente a dia de pós-operatório 3, gama completa de movimento é devolvido dentro do membro superior direito.
Embora existam limitações a este modelo, que incluem a necessidade de habilidade técnica em microcirurgia, a disponibilidade de dois microscópios simultâneas, ea exigência de uma abordagem em duas equipe, tem, no entanto, demonstrou ser uma abordagem bem sucedida para realizar estudos imunológicos mecanicistas relacionados com órgão sólido combinado e alotransplante composto vascularizado. Sua aplicação mais ampla pode contribuir ainda mais para desenvolver novos immunprotocolos osuppressive, estudar mecânica de rejeição aguda e crônica, e implementação de estratégias potenciais para induzir e sustentar quimerismo, e prolongar a sobrevida do enxerto.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Euro-Collins Solution | The solution is not commercially purchased but rather prepared in the laboratory. To make a 500 ml solution add the ingredient listed below to a 330 ml of double distilled water. Mix well, and then fill in the rest of the 170 ml of double distilled water into the solution to a final volume of 500 ml. Ingredients: 1.02 g KH2PO4, 3.66 g K2HPO4, 0.56 g KCl, 0.42 g NaHCO3, and 17.52 g of glucose. |
||
| Suture | Ethilon | MWI 72667 | 6-0 Ethilon https://www.mwivet.com (MWI - Veterinary Supplies) |
| Polyimide Cuff Vein (21G) | Vention Medical | 141-0043 | http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/ |
| Polyimide Cuff Artery (24G) | Vention Medical | 141-0027 | http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/ |
| Soft plastic tip catheter | Terumo | SR*OX2419CA | 24G x 3/4" |
| Microsurgical dilator | S&T | D-5a.1 | Dilator, 11 cm, FH, 0.1 mm AT10d |
References
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