A Novel Mikro modell för Heterotopisk, En Bloc Chest Wall, Thymus och hjärttransplantation i möss

Protocol

Alla operativa ingrepp genomfördes i enlighet med Johns Hopkins University och USA: s jordbruksdepartement och folkhälsa i tjänster. Detta protokoll följer Johns Hopkins University Djurvård och användning kommittén godkände Institutional Review Board riktlinjer (protokollnummer M013M490). Final överlevnads data registrerades för de kirurgiska ingrepp som beskrivs nedan. Både givare och mottagare djuren får företrädesrätt anestesi använder buprenorfin vid 0,1 mg / kg sc en timme före operationen och i mottagarens djur buprenorfin åter administreras i samma dos efter transplantation och åter doserat som behövs under de första 48 timmarna efter kirurgi.

1. Donator Allograft Återhämtning

Obs: Börja donatordelen av transplantatet 40 min tidigare än mottagaren transplantationen för att minimera mottagare anestesi tid och för att underlätta en samtidig sluttid eller något öralier sluttid kontra mottagande beredningen.

1. Använda vanliga sterila mikro instrument och sterila handskar för förfarandet. Vårt laboratorium använder autoklav sterilisering av mikro instrument.
2. Söva donator mus (manliga) användning av isofluran induktions förångaren vid 4%. Använda atraumatiska mekaniska hårklippnings bort hår från hals-, bröst- och bukhålan. Placera djuret i ryggläge och bibehålla isofluran på 1-2% genom en noskon. Säkerställa tillräcklig anestesi under hela förfarandet genom att regelbundet utvärdera tå nypa tillbakadragande reflex.
3. Före hudsnittet, allmänt förbereda den operativa genom att tillämpa povidonjod antiseptisk följt av isopropylalkohol med en steril bomullspinne.
4. Börja med en ytlig tvär hudincision med en sax över livmoderhalscancer och bukhuden. Anslut båda snitt bilateralt längs midaxillary linjer.
5. Använda mikrokirurgiska pincettdissekera halsregionen bilateralt för att identifiera, ligera och dela de externa jugularvenerna med 6-0 silke sutur och sax. Sedan använda diatermi dela sternocleidomastoideus musklerna att exponera interna jugularvenerna och gemensamma halspulsåder, bilateralt. Passera en 6-0 silke sutur under vänstersidig och högersidig gemensamma hals och interna jugularvenerna i bulk sätt.
   OBS: De kommer att knytas och delas senare i steg 1.9.
6. Kraftigt dela bandet muskler och tillhörande lös areolar vävnad, som ligger anterior till luftstrupen, med sax för att frigöra de återstående bilagor i halsregionen.
7. Med hjälp av bipolär diatermi och skarp dissektion, dela pectoralis major muskler och nyckelben att exponera subclavia fartyg och ligatet (6-0 silke sutur) och dela proximalt.
8. Nästa försiktigt, förstå och dra djurets penis. Längs dorsum av penis visualisera dorsala venen i penis, och desinficeraregion med isopropylalkohol. Med användning av en 30 G nål, injicera 30.000 enheter heparin intravenöst via dorsala venen och medge att penisen rekyl tillbaka till sitt ursprungliga läge. Partiell läckage av heparinlösningen i den omgivande vävnaden kan uppträda.
9. Med hjälp av tidigare placerade bulk band kring gemensamma halspulsådern och inre halsvenen, ligera och dela strukturer, bilateralt.
10. Nästa använda sax för att göra en tvärgående intrabdominal snitt. Rensning tarmarna att exponera infrahepatic sämre hålvenen och injicera 2 ml kall Euro-Collins kardioplegilösning i infrahepatic sämre hålvenen. Säkerställ korrekt injektion genom att visualisera lever missfärgning och upphörande av hjärtslag innan vidare till nästa steg.
    OBS: Euro-Collins lösning bereds i vårt laboratorium, se tabell av specifika reagens och instrument.
11. Använda sax åt intratorakala kaviteten via en bilateral diaphragmatic snitt från den exponerade buken. Förläng snittet cephalad genom interkostaler muskler och revben. Reflektera bröstkorgen att exponera hjärtat, bräss, och de stora kärlen samtidigt säkerställa bevarandet av de interna bröstkorg fartyg längs bröstkorgen.
12. Injicera suprahepatic sämre hålvenen med 4 ml kall Euro-Collins kardioplegilösning.
13. Identifiera roten av aorta och spåra distalt till aorta descendens. Kraftigt klippa fallande aorta (bevara maximal längd).
14. Identifiera lung stammen och dela bara proximal dess förgreningspunkten (bevara maximal längd). Sedan använda 2 ml kall Euro Collins kardioplegilösning, spola pulmonell stammen och hjärta genom att placera en mjuk plastspets kateter i lumen av pulmonell stammen.
15. Med användning av en 6-0 silkesutur, ligat och dividera den nedre hålvenen, sammanflödet av pulmonella vener, och tillbehörs grenar av det bilaterala övre hålvenen. Sedan elevateoch dissekera hjärtat kraniella från fästena längs huvudstammen bronkerna och luftstrupe med noga med att inte komma in i luftvägarna. Med hjälp av vass och bipolär diatermi dissekera bröstkorgen, bräss, och hjärta helt befria den från donator musen.
16. Slutligen, trimma allograft bröstkorgen ex vivo till en mindre storlek, med sax, längs bröstbenet och laterala costae, med noga med att inte störa den inre bröstkorg fartyg (Figur 1A). Att följa revaskularisering minimera blödning, använder bipolär diatermi längs gränser osteomusculocutaneous bröstbenet.
17. Placera allograftet i 10 ml kall ⁽⁴ ° Celsius) Euro-Collins lösning om mottagaren inte är förberedd för nedfällning. Men om mottagaren är klar för nedfällning, överföra allograften direkt till mottagaren operationsområdet.

2. Mottagare Framställning

Obs! För att minimera mottagare anestesi tid,börja mottagande preparatet i en separat operativ station ca 40 min innan slutförandet av givar allograft skörden.

1. Använd en separat uppsättning standard sterila mikro instrument och sterila handskar för förfarandet.
2. Söva mottagaren musen (manlig eller kvinnlig) med hjälp av isofluran induktions förångaren vid 4%. Använda atraumatiska mekaniska hårklippnings ta bort hår från höger livmoderhalscancer och bröstkorg region.
3. Placera musen i ryggläge och vinkel högra övre extremiteten något inferiorly bildar en 110 graders vinkel mellan huvudet och högra övre extremiteten. Upprätthålla anestesi på 1-2% isofluran genom en noskon.
4. Placera petroleum oftalmologiska salva på musen ögonen med en bomullsspets applikator. Före hudsnittet, allmänt förbereda operationsområdet med hjälp av povidonjod antiseptisk följt av isopropylalkohol.
5. Med sax, göra en hud snitt från mittlinjen längs den högra sämre border av underkäken och förlänga snittet infero-sidled till höger bröstregionen. Använda dissektion med mikrovaskulära pincett, mobilisera externa halsvenen genom perifer gratis fartyget från mjuk vävnad och adventitia. Dela alla grenar som använder diatermi, och ta bort den högra loben av submandibular körteln använder skarp dissekering och diatermi att frigöra utrymme för allograft.
6. Säkerställa tillräckligt med längd av den yttre halsvenen att vränga över en manschett, och ligera den yttre halsvenen att använda en 6-0 silkessutur. Sätt venen genom lumen av en förskuren polyimid manschetten och använd en bulldog mikrovaskulära klämma för att fixera fartygs manschetten komplex på plats. Sedan använda sax, proximalt dela den yttre halsvenen Evert över manschetten och fixera på plats med en 10-0 nylonsutur. (Figur 1B)
7. Dela upp höger sternocleidomastoideus med bipolär diatermi för att exponera den gemensamma halspulsådern. Perifer mobilize artären cephalad till den mest distala punkten i den cervikala regionen. Detta sker med hjälp av dissektion av kärlet med pincett för att avlägsna mjukvävnad och omgivande adventitia.
8. Med användning av 6-0 silkesutur, ligat och dividera den gemensamma halsartären. Passera pulsåder genom lumen av en förskuren polyimid manschetten och fixa det på plats med en bulldog mikrovaskulära klämma så nära bröstinloppet som möjligt. Dela upp fartyget distalt försiktigt vidga kärlet med hjälp av en mikro dilator Evert över manschetten och fixera på plats med en 10-0 nylonsutur. (Figur 1B)
   OBS: Den specifika mikro dilator beskrivs i tabellen över specifika reagenser och instrument.

3. Allograft Inset

1. Behåll standard sterila instrument och sterila handskar för att placera allograften inom mottagaren hals-regionen i en upp och ned och snedställning.
2. Därefter placerar givaren fallande aortic lumen över arteriella manschetten konstruktionen hos mottagaren och fixa det på plats med en 10-0 nylonsutur (Figur 1C och 1D).
3. Fashion samma anastomos som i steg 3.2 mellan donatorn lungartären och vrängda externa halsvenen-manschett konstruktionen hos mottagaren musen (Figur 1C och 1D).
4. Ta först bort venös mikrovaskulära klämman (extern halsvenen klämma) och släpp sedan arteriella klämman (gemensamma halspulsådern klämma). Under arteriell reperfusion, inspektera hela den allograften att ta itu med någon blödning. Om blödning visualiseras, återanvända artärklämman för att minimera blodförlust och minska källan till blödning med hjälp av bipolär diatermi.
5. Inspektera transplantatet och se till hemostas. Släpp och helt ta bort den arteriella mikrovaskulära klämman. Beakta hjärtat att visa tecken på reperfusion, som kommer att vara momentant uppenbara med snabb volymexpansion av hjärtkamrama, och vänta på bäta för att börja inom 0,5-1 min. Använd varm koksaltlösning (35 ° C) för att fukta hjärtat.
6. Drape bröstväggen i en anatomisk läge för att inte inducera någon kinkning eller spänningar på anastomoser. Stäng huden på operationssåret använder 6-0 kontinuerliga nylonsuturer (Figur 1E).

4. postoperativ vård

1. Administrera en 0,3 ml normal saltlösning intraperitoneal vätska bolus omedelbart postoperativt för vätskeersättning.
2. Sedan subkutant injicera buprenorfin (0,1 mg / kg) och enrofloxacin (5 mg / kg) för smärta och infektionsprofylax, respektive.
3. Placera djuret under en värmelampa tills vaknat från anestesi och återgå till sternala VILA. Under återhämtning, inspektera halsen att visualisera fibrilleringszonen hjärtslag allograftet säkerställa tillräcklig allograft perfusion.
4. När vaken och i liggande läge, återgår musen till en separat bur (utan sällskap av andra möss) Där den kan ta emot mat och vatten ad libitum. På grund av eventuella tillfälliga mindre restriktiv rörelse högra övre extremiteten, lämnar en gelatin födokälla på golvet i buren.
5. Observera mottagande musen för 1 timme postoperativt och sedan tillbaka till buren anläggning där den kan ta emot mat och vatten efter behag och inspekteras tre gånger per dag för de första 24 h för aktivitet och näringsintag. Övervaka möss tecken på smärta och ångest och åter dosen med buprenorfin (0,1 mg / kg) subkutant två gånger per dag som behövs för första 72 timmar. Undersöka djuren dagligen därefter och väga dem varje vecka.
6. Rådgör med en veterinär anställd om några möss visar tecken på smärta, ångest, eller minskad foderintag. Överväg tidig eutanasi (i våra protokoll eutanasi teknik använder CO ₂ överdos för 7 min, följt av cervikal dislokation).
7. Upphörande av allograft hjärtrytm definieras som en specifik endpoint meddelar musen för att vara sacrificed.

Representative Results

Syngena C57BL / 6 transplantationer uppnått långsiktig överlevnad. Utformningen av allograft (Figur 1) har visat sig vara framgångsrik från ett djur överlevnadsperspektiv och förmågan att utvärdera pågående allograftöverlevnad. Detta visades genom liggande hud kvar livskraftig, aktiv pågående allograft hårväxt, och hjärtslag kunde utvärderas med visualisering och finger palpation. Överlevnad data är representerad i fig 2 för syngena transplanterade möss. Den genomsnittliga överlevnadstiden var större än 109 dagar. Baserat på överlevnadsdata, är det rimligt att dra slutsatsen att den tekniska aspekten av det transplanterade allograft är utformad för att BEGJUTA helheten av bröstkorgen, bräss, och hjärta. Dessutom stöder förmåga syngena djur att överleva på lång sikt vidare att denna musmodell är inte bara möjligt utan kan replikeras. Detta proof-of-concept i klump bröstkorgen, bräss, och hjärttransplantation validerar the musmodell för att studera kombinerad fast organ och vaskulariserad kompositallotransplantation.

Figur 1. Intraoperativa bilder. (A) bröstkorgen, bräss, och hjärttransplantations framgångsrikt återvinns, trimmas, och visualiseras ex vivo från bakre delen. De bilaterala interna bröstkorg fartyg bevaras. (B) Mottagaren externa halsvenen (pilen) och gemensamma halspulsådern (pilspets) är vrängda fast under polyimid manschetter som förberedelse för vaskulär anastomos. (C) allograft vaskulära anastomoser är klara. Pilen visar anastomos mellan donatorn lungartär och mottagaren externa jugularvenen. Pilhuvudet visar anastomosen mellan givarnedåtgående aorta och mottagaren gemensamma halsartären. Asterisken identifierar tymus och den reflekterade bröstväggen visualiseras overlying bräss. (d) En högre förstoring visar mikrovaskulära-manschetten anastomoser. (e) Komplett allograft infälld. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. en bloc bröstväggen, tymus, och hjärt allograftöverlevnad Kaplan-Meier överlevnadskurvor för en bloc bröstväggen, tymus och hjärtallotransplantat i syngena C57BL / 6-möss (n = 3;. Medelöverlevnadstiden var större än 109 dagar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Det finns en mängd fenomen som faktor i immunologiska utredningen av allotransplantation, som innefattar, men är inte begränsade till mekanismer för akut och kronisk avstötning, direkt och indirekt antigenpresentation, mottagare allergi eller induktion av blandade chimerism. Har ¹⁹ Djurmodeller blir guldmyntfoten för att studera transplantationsimmunologi och musmodeller är populärt genomförs på grund av deras låga kostnad, tillgänglighet av transgena och gen knockoutmöss, kommersiellt tillgängliga monoklonala antikroppar, släkting minskade veterinära och bostads krav och hur lätt replikering. Hittills har flera hjärttransplanterade modeller utformats för att studera fast organtransplantation. ^19,22-27 Likaså en uppsjö av musmodeller har utvecklats för att studera vaskulariserad kompositallotransplantation. ²⁸ emellertid studier av kombinerade fasta organ och vaskulariserad kompositallotransplantation är begränsad,och tekniker har ännu inte fastställts i möss. Den blockvis bröstkorgen, bräss, och hjärttransplantation musmodell som presenteras här är ett pålitligt och reproducerbart verktyg för att studera effekterna och immunologiska mekanismer för kombinerad fast organ och vaskulariserad kompositallotransplantation.

För att ytterligare främja transplantationsområdet, måste löftet att förlänga allograftöverlevnad och minimering av immunosuppression genom nya behandlingsmetoder eftersträvas. Ett sådant tillvägagångssätt är genom induktion av blandade chimerism (partiell ympning av donator hematopoietiska celler i mottagaren), vilket kan leda till immunosuppression fria donatorspecifik tolerans, även om det i vissa fall chimerism inte upprätthålls. ^29,30 Benmärgs transfusion / transplantation parat med fast organ ³¹ eller vaskulariserad komposit allotransplanation ^32,33 kräver omfattande prekonditionering utgör en stor utmaning. Vaskulariserad benmärg, enär en del av en kärlkomposit allograft konstruktion, kan kringgå detta problem. Vaskulariserat benmärgstransplantation möjliggör oavbruten överföring av donatorbenmärgsceller inom den konserverade givarmikro, och anses vara överlägsen cellulär benmärgstransplantation ensam i induktion av tolerans och minskning av immunsuppression krav. ^34-36 dessutom införlivandet av bräss vävnad med kärlbenmärgstransplantation har visat sig öka T-cell chimerism av donator ursprung i slutändan spelar en stödjande roll i induktion och underhåll av chimerism. ^2,9 De ovan nämnda strategier för att förlänga allograftöverlevnad och minimera immunsuppression var grunden för att konceptualisera en kombinerad fast organ, bräss, och vaskulariserad komposit allograft musmodell.

Heterotopiskt klump bröstkorgen, bräss, och hjärttransplantation är en sammanslagning av flera hansriska djurmodeller. Heterotop livmoderhalscancer hjärttransplantation med ett icke-sutur manschetten i möss har väl etablerats och bedömts vara mindre tekniskt krävande än en heterotop buken mikrovaskulära hjärttransplantation. ¹⁹ I själva verket har manschetten tekniken genomförts i flera andra djur transplantationsmodeller. ^37-44 heterotopisk sternala transplantation hos råttor infördes 1999 av Santiago et al. som en alternativ metod för att studera vaskulariserad benmärgstransplantation. ¹ De kunde visa långsiktig perifer chimerism, tolerans och överlevnad efter avslutad immunosuppression på postoperativ dag 30. ¹ Bozkurt et al. därefter utvecklat en råttmodell 2013 att införliva bräss och den fulla omfattningen av den osteomyocutaneous delen av bröstkorgen. Det bör emellertid noteras, att denna modell skiljer sig från vår modell i flera aspekter. Detta omfattar: (1) deras modell är saknar fastorgan, (2) att färdigställas hos råttor med traditionella mikrokirurgisk teknik, (3) ligering av de interna bröstkorg fartyg under givar skörd (4) genomförande av en ensidig, enda pediculus via en gemensam halspulsådern och yttre halsvenen, och (5 ) transplantation av allograftet i inguinal regionen. ² Ändå var deras modell kan visa att bräss av givar ursprung spelar en viktig roll inte bara för chimerism förstärkning men också för chimerism underhåll jämfört med enbart vaskulariserat benmärgstransplantation. ² Efterföljande svinmodeller samtidig transplantation av tymus och hjärta har visat en överlägsen effekt på hjärt allograftöverlevnad. ^10,11 fördelarna med varje djurmodeller, men brist på mekanistiska studier in vivo som hänför sig till kombinerad solida organ, tymus och vaskulariserad sammansatt allotransplantation uppmanas vår grupp att utforma denna modell.

Erfarenheterna exekv era denna nya modell uppvisade vissa lektioner kräver vårt team att väcka ändringar i syfte att uppnå en bättre djuröverlevnad. Denna modell har försökt med en operatör, vilket i slutändan förlängde operativa och anestesi tid till över 3-4 timmar och även långvarig kall ischemi tid. Djur skulle inte vakna när man avslutar förfarandet. Genomförandet av en två-lagarbete klippa totala operativa och anestesi tid till 90 minuter. Detta återspeglas i 60 min anestesi tid hos mottagaren musen, och 0-10 min allograft kall ischemi tid. Under allograft reperfusion, är musen mottaglig för blödning, vilket kan begränsa dess överlevnadsförmåga i omedelbar peri-operativ. Vi förespråkar noggrann inspektion av allograft ex vivo för potentiella källor till blödning, samt skonsam frisättning av bulldog mikrovaskulära klämman under allograft reperfusion. Genom att placera allograft i en reflekterad läge är det lättare att identifiera specifika områden avblödning. Dessutom främjar detta transplantat infällda läge mest ergonomiska låg fartyg minimerar risken för fartygets snor. Slutligen, med den första 48 timmar på återhämtning, mottagarens musen högra övre extremiteterna rörelseomfång kan hindras när det gäller att klättra buren för att få mat och vatten. Därför rekommenderar vi placering av gelatin näringskällor längs buren för att underlätta näringsintag. Typiskt genom postoperativ dag 3, är komplett utbud av rörelse tillbaka inom rätt övre extremiteterna.

Även om det finns begränsningar för den här modellen, som inkluderar behovet av teknisk skicklighet i mikro, tillgång till två samtidiga mikroskop, och kravet på ett två-lagarbete, har det ändå visat sig vara en framgångsrik strategi för att utföra mekanistiska immunologiska studier relaterade till kombinerad fast organ och vaskulariserad kompositallotransplantation. Dess bredare tillämpning kan vidare bidra till att utveckla nya Immunosuppressive protokoll, studerar mekanik av akut och kronisk avstötning, och implementering av potentiella strategier för att inducera och upprätthålla chimerism, och förlänga allograftöverlevnad.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Euro-Collins Solution			The solution is not commercially purchased but rather prepared in the laboratory. To make a 500 ml solution add the ingredient listed below to a 330 ml of double distilled water. Mix well, and then fill in the rest of the 170 ml of double distilled water into the solution to a final volume of 500 ml. Ingredients: 1.02 g KH2PO4, 3.66 g K2HPO4, 0.56 g KCl, 0.42 g NaHCO3, and 17.52 g of glucose.
Suture	Ethilon	MWI 72667	6-0 Ethilon https://www.mwivet.com (MWI - Veterinary Supplies)
Polyimide Cuff Vein (21G)	Vention Medical	141-0043	http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Polyimide Cuff Artery (24G)	Vention Medical	141-0027	http://www.ventionmedical.com/products-and-services/polyimide-tubing/
Soft plastic tip catheter	Terumo	SR*OX2419CA	24G x 3/4"
Microsurgical dilator	S&T	D-5a.1	Dilator, 11 cm, FH, 0.1 mm AT10d