Abstract
Hydrogeler kan mønster på mikro-skala under anvendelse mikrofluide eller micropatterning teknologier til at levere en in vivo-lignende tre-dimensionelle (3D) væv geometri. De resulterende 3D hydrogel-baserede cellulære konstruktioner er blevet indført som et alternativ til dyreforsøg for avancerede biologiske undersøgelser, farmakologiske assays og organtransplanterede applikationer. Selvom hydrogel-baserede partikler og fibre kan let fremstilles, er det vanskeligt at manipulere dem til vævsrekonstruktion. I denne video, beskriver vi en fabrikation metode til mikromønstrede alginat hydrogel ark, sammen med deres forsamling til at danne en makro-skala 3D cellekultur-system med en kontrolleret cellulær mikromiljø. Ved hjælp af en tåge form af calcium geleringsmiddel er tynde plader hydrogel let genereres med en tykkelse i området fra 100 - 200 um og med præcise micropatterns. Celler kan derefter dyrkes med geometriske vejledning af hydrogel ark ifritstående forhold. Endvidere kan hydrogel ark let manipuleres under anvendelse af en mikropipette med en ende-cut tip, og kan samles til flerlagsstrukturer ved at stable dem ved hjælp af en mønstret polydimethylsiloxan (PDMS) ramme. Disse modulære hydrogel ark, som kan fremstilles ved hjælp af en letkøbt proces, har potentielle anvendelser af in vitro-drug assays og biologiske undersøgelser, herunder funktionelle studier af mikro- og makrostruktur og væv genopbygning.
Introduction
Hydrogeler er særligt lovende biomaterialer, og forventes at være vigtige i grundlæggende biologi, farmakologiske analyser og medicin. 1 Biofabrication af hydrogel-baserede cellulære konstruktioner er blevet foreslået at reducere brugen af dyreforsøg, 2,3 erstatte transplanterbare væv, 4 og forbedre cellebaserede assays. 5,6 vandholdig (kulbrinter) viskoelastiske materialer (geler) tillader et stort antal celler, der skal indkapsles og vedligeholdes i et stillads struktur for at kontrollere 3D cellulære mikromiljø. I kombination med vejledning af mikrofluide eller micropatterning teknologier, kan geometrien af hydrogelen konstruktioner styres præcist på celleniveau skala. Til dato, en række forskellige former af hydrogeler, herunder partikler, 7 - 9 fibre, 10 - 12 og ark, 13 - 15 er blevet anvendt som bygningselementer i bottom-up hensigtshovedpine til fremstilling af makro-skala flercellede arkitekturer.
Både hydrogel-baserede partikler og fibre har været let og hurtigt fremstillet til anvendelser som mikro-skala cellulære miljøer, med fluide kontrol ved hjælp af mikrofluidenheder. Men som de grundlæggende enheder af manipuleret væv, ville det være kompliceret at omarrangere dem, og at udvide deres volumen som makro-skala konstruktioner. 16 Det er mere vanskeligt at opnå makro-skaleret konstruktioner end at producere mikrometerstore grundmoduler. Arklignende enheder af hydrogel-baserede konstruktioner kan anvendes til at øge mængden af stilladser via en enkel samling proces. Som følge heraf, stablede lag af hydrogel ark giver ikke kun en volumetrisk stigning, men også en geometrisk forlængelse i et 3D-rum.
Vi har tidligere rapporteret en fremgangsmåde til fremstilling mikromønstrede hydrogel ark, 13 - 15 sammen med deres samling til multi-layob- cellulære arkitekturer. Teknikken muliggør komplekse micropatterning og modulære design af cellulære konstruktioner via en stablingsprocessen af flerlagsstrukturer. Gennem fremstilling af stablede modulære hydrogel ark, der mikromønstrede, kan et 3D cellekultursystem med en kontrolleret makroskala cellulære mikromiljø realiseres. Denne videoprotokollatet beskriver en simpel endnu kraftfulde fremstillingsmetode, der kan anvendes til at konstruere modulære hydrogel ark, baseret på human lever carcinomacellelinie (HepG2). Vi demonstrerer heri simpel manipulation af disse mønstrede modulære hydrogel ark og deres samling til en flerlagsstruktur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Forberedelse af mikromønstrede forme og Hydrogeler
- At frembringe den ønskede mikro-skala mønstre ved hjælp af SU-8 fotoresist på overfladen af en siliciumskive via en standard to-trins teknik fotolitografi 15,17 til støbning PDMS forme. Det viste eksempel anvender en lever lille lap-lignende netmønster (figur 1).
- Der afvejes PDMS og et hærdningsmiddel løsning med et forhold på 1: 5 (dvs. 12,5 g PDMS og 2,5 g hærder).
- Bland 15 g af opløsningen grundigt, afgasses boblerne i et vakuumkammer, og derefter sprede den blandede opløsning på en mikromønstrede overflade af siliciumskiven jævnt i en folie støbning skålen.
- Placer silicium wafer på en 65 ° C opvarmet plade i 90 minutter på en flad overflade for at helbrede de PDMS.
- Fjern de hærdede PDMS fra støbning skålen og siliciumskiven.
- Skær kanterne af PDMS og placere den på en 100-mm-diameter petriskål medden mikromønstrede opad.
- Vask mikromønstrede hærdede PDMS på petriskålen under anvendelse af 70% ethanol og destilleret vand til primær sterilisering. Derefter tør dem fuldstændigt i 10 minutter i en ovn ved 65 ° C.
- Opløses og blandes O / N 3 g af et pulveriseret ionisk overfladeaktivt middel i 100 ml destilleret vand, hvilket skaber en 3% (vægt / volumen) coatingopløsning.
- Placer mikromønstrede PDMS forme et plasma renere og rense dem for 1 min (85 W, 0,73 mbar) at skabe en hydrofil overflade, for at lette tilsætningen af vandige væsker. Derefter coate overfladen af PDMS med 100 ml opløsning af overfladeaktivt middel i mindst 3 timer (ORO / N) ved hjælp af et laboratorium rocker.
- Vask opløsningen af overfladeaktivt middel fra PDMS forme og tørre dem fuldstændigt i en ovn ved 65 ° C i 10 minutter. Derefter steriliseres hver mikromønstrede form ved udsættelse for ultraviolet (UV) stråling løbet af 30 minutter.
2. Forbered Cellesuspensionen i en hydrogel Prækursormaterialer
- Tilforberede hydrogel precursor, opløses 0,1 g natriumalginat pulver i 10 ml phosphatbufret saltvand (PBS), hvilket skaber en 1% (vægt / volumen) alginat precursor. At opløse pulveret fuldstændigt, inkuberes og bland dem O / N.
- Opløsningen filtreres gennem et 0,22 um filter forbundet til en 1 ml sprøjte.
- Kultur HepG2 celler i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin på en konventionel vævskulturskål indtil 70% - 80% konfluens i en 5% CO 2 befugtet inkubator ved 37 ° C .
- Vask cellerne én gang med PBS, og derefter Trypsinisér dem ved at tilsætte 1 ml 0,05% trypsin-EDTA i 4 minutter i en 5% CO 2 befugtet inkubator ved 37 ° C. Centrifuger cellerne høstet fra dyrkningsskålen ved 250 xg i 3 min og resuspender anvendelse af 1 ml PBS efter fjernelse af supernatanten.
- Tæl antallet af enlige distribuerede celler i PBS ved hjælp af en automatiseret celletæller.
- Efter centrifugering ved 250 x g i 3 min og PBS fjernelse, tilsættes 1 ml af 1% (w / v) natriumalginatopløsning til den resterende cellepellet og bland dem forsigtigt ved hjælp af pipettering. Den endelige udsåningstæthed af cellerne bør være 5 x 10 6 - 10 7 celler / ml. Inkubér celle / hydrogel suspension i en 5% CO 2 befugtet inkubator ved 37 ° C.
3. Læsning og Tværbinding af celle / Hydrogel Suspension
- Opløs 1,47 g calciumchlorid dehydrere i 100 ml Hedeselskabet 2 O til frembringelse af et tværbindingsreagens (dvs. 100 mM CaCl2 · 2H 2 O i Hedeselskabet 2 O).
- Skyl det indre af en luftfugter med ultralydstransduceren hjælp 70% ethanol, og fyld den med 200 ml tværbindingsreagens. Befugteren er 110 mm bred, 300 mm lang og 170 mm dyb (dvs. 110 mm x 300 mm x 170 mm (B x H x D)).
- Placer mikromønstrede PDMSforme i et plasma renere og rense dem i 1 minut ved 85 W for at skabe en hydrofil overflade.
- Støt indlæse 7.2 ul af godt blandet celle / hydrogel suspension på kanten af micropattern i formen. Det viste eksempel anvender en lever lille lap-lignende netmønster (figur 1). Volumenet af suspensionen afhænger af topografisk mønster.
- For at opnå gelering af cellen / hydrogel affjedring, tænde for befugteren og kontrollere, at befugteren producerer en tåge af den tværbindingsreagens. Spray tværbindingsreagens på hydrogel precursor i 5 minutter, som dækker den topografiske overflade af PDMS forme inden for en afstand af 5 cm.
Bemærk: Afstande længere og kortere end 5 cm kan medføre ufuldstændig og ujævn gelering hhv. Sikre, at befugteren har en sprøjtehastighed på 250 ml / time, der producerer 20 ml tåge af den tværbindende reagens i 5 min. - Efter den krydsbinding proces, skal du slukke befugteren og fyld PDMS moninger med PBS.
4. Håndtering af Single Modular Hydrogel Sheets
- Frigør hver hærdet hydrogel ark fra mikromønstrede forme via pipettering PBS forsigtigt omkring hydrogelark under anvendelse af en 200 pi pipettespids.
- Pick up hver flydende hydrogel ark ved hjælp af en ende-cut 1.000 pi pipette spids ende. Hver leveren lille lap-lignende maske hydrogel ark har dimensioner på 8 mm x 8,7 mm, og 100 - 200 um tyk.
- Overfør et enkelt lag af hydrogel pladen i 1 ml DMEM i en 12-brønds plade, og dyrke cellerne in vitro i en flydende måde under anvendelse af hydrogelen konstruktion som en enhed komponent i 12-brønds plade over en uge i et 5 % CO2 befugtet inkubator ved 37 ° C. Udveksle dyrkningsmediet hver anden dag.
5. Montering af flere lag Hydrogel Plader
- Gentag trin 1.1 til 1,5 til frembringelse af en PDMS ramme med dimensioner på 18 mm x 18 mm x 4 mm (B xH x D), og som indeholder strukturer 170-um-høj søjle ved den nedre overflade. Brug 42 g af blandingen af PDMS og hærder, med samme forhold som i trin 1.2. Placer en specialiseret polycarbonat mug på silicium wafer for PDMS ramme til at skabe et interiør ramme med dimensioner på 8 mm x 9 mm x 2 mm (B x H x D).
- Sterilisere PDMS rammen og 180-um-pore nylonfilter papirer nedsænket i destilleret vand og pincetter i en autoklav i 15 minutter ved 121 ° C.
- Placer steriliseret PDMS rammen på en fjerdedel af et stykke nylon filtrerpapir (med en diameter på 5 cm) i en 60-mm diameter petriskål.
- Overfør en modulær hydrogel ark i det indre af PDMS rammen ved hjælp ophør-cut 1.000 pi pipettespids. De hydrogel plader brugt til samling skal dyrkes i mindst en dag efter de blev fabrikeret.
- Juster kanten af hver modulær hydrogel arket med PDMS rammen ved hjælp af en tom 200 pi pipettespids.
- Gentag trin 5.4 og 5.5 under anvendelse af modulære hydrogel ark til dannelse af en stabel af 4 - 6 lag.
- Fjern kulturmediet ved at strømme ud gennem det strukturer søjlen nederst PDMS rammen. Derefter tilsættes 2 pi alginat-opløsning (2% vægt / volumen) ved et hjørne af den flerlagede konstruktion.
- Sprøjte en tåge af tværbindingsreagens for 30 sek på den flerlagede konstruktion at fastgøre kanterne af hvert lag med en anden. Bruge 2 ml tåge af den tværbindende reagens (med en sprøjtehastighed på 250 ml / time).
- Skyl flerlagede konstruktion forsigtigt med 400 pi DMEM og fjern PDMS ramme med en pincet.
- Tag det flerlagede konstruktion fra filteret papir ved forsigtigt aftørring med en celle løfteren efter tilsætning af 4 ml DMEM.
- Overfør flere lag konstruktion til en 6-brønds plade indeholdende 3 ml DMEM under anvendelse af filtrerpapir, og dyrke cellerne in vitro i en flydende måde med hydrogelen konstruereen multi-skala cellulære stillads i 6-brønds plade over en uge i en 5% CO 2 befugtet inkubator ved 37 ° C. Udveksle dyrkningsmediet hver anden dag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har beskrevet fremstilling og manipulation af fritstående cellulære hydrogel ark. Som vist i figur 1, vi fabrikeret mikromønstrede PDMS forme, og celle-hydrogel blev påsat den hydrofile overflade af disse forme og tværbundet ved anvendelse af en luftfugter at generere en aerosoliseret tåge af geleringsmiddel. Efter frigivelse fra formene, HepG2-celler blev dyrket i fritstående hydrogel ark med forskellige mønstre (figur 2). Således de tynde plader hydrogel billede et 3D kultur miljø. Endvidere kan modulære hydrogel plader samles ved at lægge pladerne under anvendelse af en mikropipette med en ende-cut spids, og ved hjælp af en PDMS ramme, som gør det muligt 3D makroskala cellekultur (figur 3).
Figur 1. Flow Chart Viser fremstilling af en hydrogel ark og Multi-layer Hydrogel Ark. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Fritstående 3D Cell Kultur i forskellige Hydrogel Ark. Den fabrikation metode sprøjtning tværbindingsreagens aktiveret præcis mønster af alginat hydrogel på mikro-skalaen. Desuden kunne de fremstillede hydrogel ark høstes fra formen og manipuleres let i fritstående betingelser. HepG2-celler blev mønstret og dyrket i et fladt ark hydrogel (A), hydrogel plader med sekskantede søjler (B), mesh (C), lever lille lap-lignende maske (D), et array af huller (E), og multiple microcomb-lignende mikrofibre (F). Skalaen barer er som følger:. 500 um (A, D, F), 100 um (B, C), og 2 mm (E) Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Montering af mikromønstrede Hydrogel Plader til Makro-skala Cellular konstruktioner. Forskellige typer af hydrogel ark kunne samles via lag-på-lag stabling med tilpasningen, herunder samling af fem hydrogel ark indeholdende HepG2-celler farvet med grøn fluorescens og NIH3T3 celler farvet med rød fluorescens (A). En samling af mikromønstrede hydrogel ark med udvidet pipeline struktur (B) billede højere cellelevedygtighed than at ikke-mønstrede hydrogel ark (C) efter 7 dage. Levedygtigheden blev vurderet ved farvning HepG2-celler med calcein-AM (levende celler vist som grøn) og ethidiumhomodimer-1 (døde celler vist som rød). Scale barer:. 500 um (A) og 200 um (B, C) Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol giver en enkel metode til at opdigte modulære hydrogel ark, og samle dem til at danne 3D cellulære stilladser.
For at konstruere klare mønstrede alginat strukturer i en kort tid, bør vi identificere en krydsbinding proces, der kan skabe tilstrækkeligt stive strukturer til at opretholde de komplekse micropatterns fra formen, samt opretholde levedygtighed og stofskifte celle. Vi har udviklet en tværbinding, herunder en sol-gel-overgang, at sprøjte et tværbindingsreagens under anvendelse af en luftfugter i form af en tåge. Uden denne tværbindingsproces, kunne de mikro-skala mønstre ikke genereres i form af et tyndt hydrogel konstruktion med den begrænsede diffusive dybde (100 - 200 um), som har høj permeabilitet diffunderende metabolitter og næringsstoffer. Endvidere sammenlignes med eksisterende diffusions-baserede metoder, som kræver 30 - 60 min, 18 - 20 den tværbindende TImig var relativt kort (3 - 5 min).
Desuden var det også en udfordring at manipulere den tynde hydrogel plader, som var mekanisk stabil kun i et flydende medium. Som vist i figur 1, blev den tynde hydrogelstrukturen enkelt og stabilt håndteres og manipuleres ved hjælp af en ende-cut konventionelle tip til transferal mellem forskellige dyrkningsbetingelser. Brug generation og manipulation teknikker, kunne vi leverer ikke kun et enkelt lag ark i et flydende måde for potentielle anvendelser i narkotika-analyser, men også stablet flerlagsstrukturer, med potentielle anvendelser som stillads til væv-lignende konstruktioner.
Flerlagede cellulære arkitekturer kan genereres ved at stable de modulære single-layer hydrogel ark (figur 3A). Hver modulær hydrogelark kan indeholde forskellige celletyper og kan blive udsat for forskellige dyrkningsbetingelser. Disse multi-lags konstruktioner kan derpå sam selektivtblødte. Imidlertid kan simpelthen stabling hydrogel ark føre til cellenekrose inde den samlede struktur, når den samlede dybde overstiger den begrænsede diffusive dybde (figur 3C). For at løse dette problem, vil det være nødvendigt at tilpasse MicroMesh mønstre, såsom lever lille lap-lignende masker, når de flerlagede hydrogel plader er samlet. Vi kræver derfor en PDMS ramme med det samme interiør mønster som grænsen til hydrogel ark for at justere de stablede hydrogel ark. Således kunne aligned hole-array-micropatterns i den samlede mesh hydrogel plader anvendes til at danne ekspanderede rørledningsstrukturer, lette mere effektiv transport af næringsstoffer til forbedret cellelevedygtighed (figur 3B).
En begrænsning ved denne teknik er fraværet af celle-matrix interaktioner i alginat hydrogel. Alginat kan ikke give celleadhæsion ligander for in vivo-lignende celle-matrix-interaktioner; 21 men det gør offER mekaniske og geometriske virkninger som en 3D-celle-indkapslende stillads med celle-celle-interaktioner. For primære celler og stamceller, kunne alginat anvendes efter modificering med RGD-holdige peptider, 21 eller i kombination med collagen eller gelatine. 14,18 En anden begrænsning er, at når de celle-indlejret hydrogel plader er fremstillet med lav celletæthed nedenfor 5 x 10 6 celler / ml, kunne konstruktion af flerlagsstruktur forårsage svage vedhæftede mellem hydrogel ark, fordi kun kanten af strukturen er fastsat ved anvendelse af yderligere alginat. Imidlertid kan lagene stables kompakt som en enkelt stillads via afvanding struktur under PDMS rammen. Desuden kunne højere densitet af celler i hydrogel ark proliferere på overfladen såvel som i laget efter en dags kultur, som ville hjælpe vedhæftede mellem lag som vist i figur 3A.
Hydrogelen ark fabrication og manipulation her beskrevne teknik kan tilpasses til de in vitro dyrkningssystemer og vævslignende cellulære modeller for at tilvejebringe en in vivo-lignende mikromiljø til applikationer, herunder cellulære assays og tekniske kunstige organer. Denne teknik kunne anvendes på cellebaserede narkotika assays og biologiske undersøgelser, der kræver geometrisk forskellige 3D cellulære mikro- og macroenvironments der inkorporerer forskellige celler eller hydrogel typer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 000000000001064291 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Powdered nonionic surfactant |
| Alginic acid sodium salt, low viscosity | Alfa Aesar | B25266 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Ultrasonic humidifier | MediHeim | MH-2800 | Modified equipment, Maximum sprayed rate: 250 ml/hr |
| Nylon net filter hydrofilic, 180 μm | EMD Millipore | NY8H04700 | |
| Polycarbonate mold | Customized mold for fabrication of a PDMS frame pattern |
References
- Hoffman, A. S.
- Lan, S., Starly, B. Alginate based 3D hydrogels as an in vitro co-culture model platform for the toxicity screening of new chemical entities. Toxicol. Appl. Pharm. 256 (1), 62-72 (2011).
- Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. 3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels. Biomaterials. 32 (31), 7905-7912 (2011).
- Lim, F., Sun, A. M. Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas. Science. 210 (4472), 908-910 (1980).
- Koh, W. G., Itle, L. J., Pishko, M. V. Molding of hydrogel microstructures to create multiphenotype cell microarrays. Anal. Chem. 75 (21), 5783-5789 (2003).
- Xu, Y., et al. A Microfluidic Hydrogel Capable of Cell Preservation without Perfusion Culture under Cell-Based Assay Conditions. Adv Mater. 22 (28), 3017-3021 (2010).
- Um, E., Lee, D. S., Pyo, H. S., Park, J. K. Continuous generation of hydrogel beads and encapsulation of biological materials using a microfluidic droplet-merging channel. Microfluid. Nanofluid. 5 (4), 541-549 (2008).
- Lee, D. H., Lee, W., E, U. m, Park, J. K. Microbridge structures for uniform interval control of flowing droplets in microfluidic networks. Biomicrofluidics. 5 (3), 034117 (2011).
- Lee, D. H., Bae , C. Y., Han, J. I., Park, J. K. In situ analysis of heterogeneity in the lipid content of single green microalgae in alginate hydrogel microcapsules. Anal. Chem. 85 (18), 8749-8756 (2013).
- Yamada, M., Sugaya, S., Naganuma, Y., Seki, M. Microfluidic synthesis of chemically and physically anisotropic hydrogel microfibers for guided cell growth and networking. Soft Matter. 8 (11), 3122-3130 (2012).
- Yamada, M., et al. Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions. Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).
- Onoe, H., et al. Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions. Nat. Mater. 12 (6), 584-590 (2013).
- Lee, W., Son, J., Yoo, S. S., Park, J. K. Facile and Biocompatible Fabrication of Chemically Sol−Gel Transitional Hydrogel Free-Standing Microarchitectures. 12 (1), 14-18 (2011).
- Lee, W., et al. Cellular hydrogel biopaper for patterned 3D cell culture and modular tissue reconstruction. Adv. Healthcare Mater. 1 (5), 635-639 (2012).
- Bae, C. Y., Min, M. K., Kim, H., Park, J. K. Geometric effect of the hydrogel grid structure on in vitro formation of homogeneous MIN6 cell clusters. Lab Chip. 14 (13), 2183-2190 (2014).
- Bruzewicz, D. A., McGuigan, A. P., Whitesides, G. M. Fabrication of a modular tissue construct in a microfluidic chip. Lab Chip. 8 (5), 663-671 (2008).
- Choi, S., Park, J. K. Two-step photolithography to fabricate multilevel microchannels. Biomicrofluidics. 4 (4), 046503 (2010).
- Lee, B. R., et al. In situ formation and collagen-alginate composite encapsulation of pancreatic islet spheroids. Biomaterials. 33 (3), 837-845 (2012).
- Cabodi, M., Choi, N. W., Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Bonassar, L. J., Stroock, A. D.
- Choi, N. W., Cabodi, M., Held, B., Gleghorn, J. P., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. Microfluidic scaffolds for tissue engineering. Nat. Mater. 6 (11), 908-915 (2007).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
