Abstract
Hydrogele können auf der Mikrowaage unter Verwendung von Mikrofluid oder Mikrostrukturierungstechniken, um eine in vivo-ähnliche dreidimensionale (3D) Gewebegeometrie bereitzustellen strukturiert werden. Die erhaltenen 3D Hydrogelbasis zellulären Konstrukte wurden als Alternative zu Tierversuchen zur weitgehenden biologischen Studien, pharmakologischen Tests und Organtransplantationsanwendungen eingeführt. Obwohl auf Hydrogel-Basis und Fasern können leicht hergestellt werden, ist es schwierig, sie zum Wiederaufbau von Gewebe zu manipulieren. In diesem Video, beschreiben wir ein Herstellungsverfahren für mikro Alginat-Hydrogel Blättern, zusammen mit deren Montage ein Makro angelegte 3D-Zellkultursystem mit einem kontrollierten zellulären Mikroumgebung bilden. 200 um und mit präzisen Mikro - unter Verwendung einer Nebelform des Calcium-Geliermittel werden dünne Hydrogelfolien leicht mit einer Dicke im Bereich von 100 erzeugt. Zellen können dann mit der geometrischen Führung der Hydrogelfolien in gezüchtet werdenfreistehenden Bedingungen. Weiterhin kann die Hydrogelfolien leicht manipuliert werden mit einer Mikropipette mit einem End-Schnittspitze und kann durch Stapeln unter Verwendung einer gemusterten Polydimethylsiloxan (PDMS) Rahmen in mehrschichtigen Strukturen aufgebaut werden. Diese modularen Hydrogelfolien, die mit einem einfachen Verfahren hergestellt werden kann, gibt es Anwendungsmöglichkeiten der in vitro-Wirkstoffassays und biologische Untersuchungen, einschließlich funktionelle Studien von Mikro- und Makrostruktur und Geweberekonstruktion.
Introduction
Hydrogele sind besonders vielversprechender Biomaterialien und sollen in grundlegende Biologie, pharmakologischen Tests und der Medizin wichtig. 1 Biofabrication von Hydrogel-basierten zellularen Konstrukte wurde vorgeschlagen, um die Verwendung von Tierversuchen zu reduzieren, 2,3 ersetzen transplantierbaren Geweben, 4 und verbessern zellbasierte Assays. 5,6 Wasser enthaltende (hydro-) viskoelastische Materialien (Gele) ermöglichen eine große Anzahl von Zellen, die eingekapselt und in einer Gerüststruktur, die 3D-zelluläre Mikroumgebung steuern aufrechterhalten werden. In Verbindung mit der Führung des mikrofluidischen oder Mikrostrukturierungstechniken kann die Geometrie der Hydrogel-Konstrukte genau auf zellulärer Ebene gesteuert werden. Bis heute sind eine Vielzahl von Formen von Hydrogelen, einschließlich Teilchen, 7-9 Fasern, 10 - 12 und Blatt, von 13 bis 15 wurden als Bausteine in von unten nach oben ange verwendetSchmerzen auf die Herstellung von Makromaßstab mehrzelligen Architekturen.
Beide Hydrogel-basierte Partikel und Fasern sind für Anwendungen wie Mikromaßstab zellulären Umgebungen war leicht und schnell hergestellt, mit fluidischen Steuerungen mit mikrofluidischen Vorrichtungen. Da jedoch die Grundeinheiten von technischen Geweben, würde es schwierig sein, um sie neu anzuordnen und um es zu vergrößern ihr Volumen als Makromaßstab Konstrukte. 16 Es ist schwieriger makro skaliert Konstrukte zu erreichen, als mikrometergroße Grundmodule zu produzieren. Blattartigen Einheiten Hydrogelbasis Konstrukte können verwendet werden, um das Volumen der Gerüste durch einen einfachen Montageprozess zu erhöhen. Folgerichtig gestapelten Schichten Hydrogelfolien bieten nicht nur eine Volumenvergrößerung, sondern auch eine geometrische Ausdehnung in einem 3D-Raum.
Wir haben bereits berichtet, ein Verfahren zur Herstellung mikro Hydrogelfolien, 13 - 15 zusammen mit ihrer Anordnung in mehreren LegeEred Zellarchitekturen. Die Technik ermöglicht komplexe Mikrostrukturierung und der modulare Aufbau von Zellkonstrukten über einen Stapelvorgang von mehrschichtigen Strukturen. Durch die Herstellung von gestapelten modularen Hydrogelfolien, die mikrostrukturiert sind, kann ein 3D-Zellkultursystem mit einer gesteuerten Makromaßstab zelluläre Mikroumgebung realisiert werden. Dieses Video-Protokoll beschreibt ein einfaches, aber leistungsfähiges Herstellungsverfahren, das verwendet werden kann, um modulare Hydrogelfolien konstruieren, auf der Grundlage der menschlichen Leberzelllinie (HepG2). Wir zeigen hier einfache Manipulation dieser gemusterten modularen Hydrogelfolien und deren Anordnung in eine Mehrschichtstruktur.
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Protocol
1. Herstellung der mikrostrukturierten Formen und Hydrogele
- Die gewünschten Mikrostufenmuster mit Su-8 auf der Oberfläche eines Silizium-Wafers über eine Standard zweistufige photolithographischen Technik 15,17 zum Gießen PDMS Schimmelpilze. Das gezeigte Beispiel verwendet eine Leberläppchens artigen Maschenmuster (1).
- Abwiegen PDMS und einer Härterlösung mit einem Verhältnis von 1: 5 (das heißt, 12,5 g PDMS und 2,5 g Härter).
- Mischen Sie die 15 g der Lösung gründlich, entgast die Blasen in einer Vakuumkammer, und dann verbreiten die gemischte Lösung auf einen mikrostrukturierten Oberfläche der Silizium-Wafer gleichmäßig innerhalb einer Foliengießen Gericht.
- Setzen Sie den Silizium-Wafer auf eine 65 ° C erhitzt Platte für 90 min auf eine ebene Fläche, um die PDMS zu heilen.
- Entfernen Sie die ausgehärtete PDMS aus der Gussschale und dem Silizium-Wafer.
- Schneiden Sie die Kanten der PDMS und legen Sie sie auf eine Petrischale von 100 mm Durchmesser mitdie mikro Seite nach oben.
- Auf der Petrischale unter Verwendung von 70% Ethanol und destilliertes Wasser für die primäre Sterilisations Waschen der Mikromuster gehärtet PDMS. Dann trocknet sie vollständig für 10 min in einem Ofen bei 65 ° C.
- Auflösen und mischen O / N 3 g eines pulverförmigen nichtionischen Tensid in 100 ml destilliertem Wasser gelöst, wodurch eine 3% (w / v) Beschichtungslösung.
- Platzieren der mikro PDMS Formen in einer Plasmareiniger und reinigen sie für 1 min (85 W, 0,73 mbar), um eine hydrophile Oberfläche zu schaffen, um die Zugabe von wässrigen Flüssigkeiten zu erleichtern. Dann Beschichten der Oberfläche der PDMS mit 100 ml Tensidlösung für mindestens 3 hr (ORO / N) unter Verwendung eines Labor Wippe.
- Waschen Sie die Tensidlösung aus PDMS Formen und trocknet sie vollständig in einem Ofen bei 65 ° C für 10 min. Dann sterilisiert jede mikrostrukturierte Form durch Belichtung mit ultravioletter Strahlung (UV) über 30 min.
2. Bereiten Sie die Zellsuspension in einem Hydrogel-Vorläufer
- ZuHydrogel-Vorläufer herzustellen, werden in 10 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) Man löst 0,1 g Natrium-Alginat Pulver, wodurch eine 1% (w / v) Alginat Vorläufers. Um das Pulver vollständig aufzulösen, Inkubation und mischen sie O / N.
- Die Lösung wird durch ein 0,22 um-Filter in eine 1 ml Spritze verbunden.
- Kultur die HepG2-Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin auf einer herkömmlichen Gewebekulturschale bis 70% ergänzt - 80% Konfluenz in einer 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C .
- Die Zellen einmal mit PBS zu waschen, und dann trypsinize sie durch Zugabe von 1 ml 0,05% Trypsin-EDTA für 4 min in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C. Zentrifugation der Zellen von der Kulturschale für 3 min und resuspendieren mit 1 ml PBS nach der Entfernung des Überstands bei 250 × g geerntet.
- Zählen die Anzahl von einzelnen verteilten Zellen in PBS unter Verwendung eines automatisierten ZellZähler.
- Nach der Zentrifugation bei 250 × g für 3 min und PBS Entfernung, 1 ml der 1% (w / v) Natriumalginatlösung zu der verbleibende Zellpellet und mischen sie sanft mit Pipettieren. 10 7 Zellen / ml - die endgültige Saatdichte der Zellen sollte 5 x 10 6 ist. Inkubieren der Zell / Hydrogel-Suspension in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C.
3. Laden und Vernetzung von Cell / Hydrogel Federung
- Aufzulösen 1,47 g Calciumchlorid zu dehydratisieren in 100 ml ddH 2 O zu einer vernetzenden Reagens (dh 100 mM CaCl 2 · 2H 2 O in ddH 2 O).
- Spülen Sie das Innere eines Luftbefeuchter mit Ultraschall-Wandler mit 70% Ethanol, und füllen Sie es mit 200 ml Vernetzungsreagenz. Der Befeuchter ist 110 mm breit, 300 mm lang und 170 mm tief (dh 110 mm x 300 mm x 170 mm (B x H x T)).
- Legen Sie die mikrostrukturierten PDMSFormen in einem Plasmafilter und reinigen sie für 1 min bei 85 W, um eine hydrophile Oberfläche zu schaffen.
- 7,2 ul des gut vermischten Zell / Hydrogel-Suspension kontinuierlich geladen am Rand des Mikromusters auf der Form. Das gezeigte Beispiel verwendet eine Leberläppchens artigen Maschenmuster (1). Das Volumen der Suspension ist abhängig von der topographischen Muster.
- Um die Gelierung der Zelle / Hydrogel-Suspension zu erreichen, schalten Sie den Luftbefeuchter und überprüfen, dass der Luftbefeuchter erzeugt einen Nebel des Vernetzungsreagens. Spray das Vernetzungsreagenz auf das Hydrogel-Vorläufer für 5 min, für den topographischen Oberfläche des PDMS Formen in einem Bereich von 5 cm.
Hinweis: Entfernungen länger und kürzer als 5 cm konnte unvollständige und ungleichmäßige Gelierung zu bewirken sind. Sicherzustellen, dass der Befeuchter mit einer Sprührate von 250 ml / h, wodurch 20 ml Nebel des Vernetzungsreagens in 5 min. - Nach der Vernetzungsprozess, schalten Sie den Luftbefeuchter und füllen Sie die PDMS-molds mit PBS.
4. Handhabung des Einzel Modular Hydrogel Blätter
- Nehmen Sie jede gehärtete Hydrogelfolie von den mikrostrukturierten Formen über Pipettieren PBS sanft um das Hydrogel Blatt unter Verwendung eines 200 ul Pipettenspitze.
- Pick up jede schwimm Hydrogelfolie mit einer End-zu schneiden 1.000 ul Pipettenspitze Ende. Jedes Leberläppchens förmige Netz Hydrogelfolie hat Abmessungen von 8 mm x 8,7 mm und ist 100 bis 200 & mgr; m dick.
- Übertragen Sie eine einzelne Schicht des Hydrogels Blatt in 1 ml DMEM in einer 12-Well-Platte, und die Kultur der Zellen in vitro in einer schwimmenden Weise mit der Hydrogel-Konstrukt als eine Einheit Komponente im 12-Well-Platte über eine Woche in einem 5 % CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C. Tauschen Sie jeden zweiten Tag des Kulturmediums.
5. Montage von mehrschichtigen Hydrogel Blätter
- Die Schritte 1.1 bis 1.5, ein PDMS-Rahmen mit Abmessungen von 18 mm x 18 mm x 4 mm zu erzeugen (W xH x T), und die 170 & mgr; m hohen Säulenstrukturen an der unteren Fläche enthält. Verwenden von 42 g der Mischung von PDMS und Härter, mit dem gleichen Verhältnis, wie in Schritt 1.2. Legen Sie eine spezielle Polycarbonatform auf dem Siliziumwafer für die PDMS-Rahmen, um eine Innenrahmen mit Abmessungen von 8 mm x 9 mm x 2 mm zu erstellen (B x H x T).
- Sterilisieren der PDMS Rahmen und 180 & mgr; m Porennylonfilterpapiere in destilliertem Wasser und einer Pinzette in einem Autoklaven unter Wasser für 15 min bei 121 ° C.
- Legen Sie die sterilisiert PDMS Rahmen auf ein Viertel der ein Stück Nylon-Filterpapier (mit einem Durchmesser von 5 cm) in einem 60-mm-Petrischale.
- Übertragen einer modularen Hydrogelfolie in das Innere des PDMS-Rahmen unter Verwendung einer End-zu schneiden 1.000 & mgr; l-Pipettenspitze. Die Hydrogelfolien zur Montage verwendet werden, sollten für mindestens einen Tag, nachdem sie hergestellt wurden, kultiviert werden.
- Richten Sie die Kante jeder modularen Hydrogelfolie mit dem PDMS-Rahmen mit einem leeren 200 ul Pipettenspitze.
- Wiederholen Sie die Schritte 5.4 und 5.5 unter Verwendung modularer Hydrogelfolien um einen Stapel von 4 bilden - 6 Schichten.
- Entfernen des Kulturmediums durch Fließen ihn durch die Säulenstrukturen am Boden des PDMS-Rahmen. Es werden nun 2 ul Alginatlösung (2% w / v) an einer Ecke des Mehrschichtkonstrukts.
- Sprühen eines Nebels des Vernetzungsreagenz für 30 s auf dem Mehrschichtkonstrukt, um die Kanten der einzelnen Schichten mit denen einer anderen zu befestigen. Ein 2-ml Nebel des Vernetzungsreagenz (mit einer Sprührate von 250 ml / h).
- Spülen Sie die mehrschichtige Aufbau vorsichtig mit 400 ul DMEM und entfernen Sie die PDMS-Rahmen mit einer Pinzette.
- Nehmen Sie das mehrschichtige Aufbau aus dem Filterpapier durch vorsichtiges Abwischen mit einem Zellheber nach der Zugabe von 4 ml DMEM.
- Übertragen Sie die mehrschichtige Aufbau zu einer 6-Well-Platte, die 3 ml DMEM mit Filterpapier, und Kultur die Zellen in vitro in einer schwimmenden Weise mit dem Hydrogel-Konstrukt, wieeine Multiskalenzellgerüst in 6-Well-Platte über eine Woche in einem 5% CO 2 befeuchteten Inkubator bei 37 ° C. Tauschen Sie jeden zweiten Tag des Kulturmediums.
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Representative Results
Wir haben die Herstellung und Manipulation von freistehenden Mobil Hydrogel Blättern beschrieben. Wie in Figur 1 gezeigt, hergestellt wir mikro PDMS Schimmelpilze und zellhaltige Hydrogel wurde auf die hydrophile Oberfläche dieser Formen und geladen vernetzt mit einem Luftbefeuchter, um eine aerosolierte Nebel von Geliermittel zu erzeugen. Nach der Freigabe aus den Formen wurden HepG2-Zellen in freistehender Hydrogelfolien mit verschiedenen Mustern (Abbildung 2) kultiviert. So sind die dünne Hydrogel Blättern ein 3D-Kulturumgebung. Ferner kann modular Hydrogelfolien durch Schichtung der Blätter mit einer Mikropipette mit einem End-Spitze schneiden, und mit einem PDMS-Rahmen, der 3D großmaßige Zellkultur (Figur 3) zusammengesetzt werden können.
Abbildung 1. Fluss Chart, die das Herstellungs eines Hydrogelfolie und Multi-Layer-Hydrogel-Sheets. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Selbsttragende 3D-Zellkultur in verschiedene Hydrogel-Sheets. Das Herstellungsverfahren des Sprühens Vernetzungsreagens aktiviert präzise Strukturierung von Alginat-Hydrogel auf der Mikroskala. Außerdem könnten die hergestellt Hydrogelfolien aus der Form entnommen und leicht in freistehender Bedingungen manipuliert werden. HepG2-Zellen wurden gemustert und in einer flachen Hydrogelfolie (A) kultiviert Hydrogelfolien mit hexagonaler Säulen (B), mesh (C), Leberläppchens förmige Netz (D), einer Anordnung von Löchern (E) und multiple microcomb artige Mikrofasern (F). Die Maßstabsbalken sind wie folgt:. 500 & mgr; m (A, D, F), 100 & mgr; m (B, C) und 2 mm (E) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Montage von mikrostrukturierten Hydrogel Blätter für Macro-scale Cellular Konstrukte. Verschiedene Arten von Hydrogelfolie könnte über Schicht-für-Schicht-Stapel mit Ausrichtung montiert werden, einschließlich der Montage von fünf Hydrogel Blätter mit HepG2-Zellen mit grüner Fluoreszenz und NIH3T3-Zellen, angefärbt mit roter Fluoreszenz (A) angefärbt. Eine Anordnung von mikrostrukturierten Hydrogel Blätter mit erweiterten Pipeline-Struktur (B) vorgesehenen höheren Zelllebensfähigkeit than, dass der Nicht-gemusterten Hydrogelfolien (C) nach 7 Tagen. Die Lebensfähigkeit wurde durch Färbung HepG2-Zellen mit Calcein-AM (lebende Zellen als grün dargestellt) und Ethidiumhomodimer-1 (rot dargestellt toten Zellen) beurteilt. Maßstabsbalken:. 500 & mgr; m (A) und 200 & mgr; m (B, C) Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll liefert ein einfaches Verfahren zur Herstellung von modularen Hydrogelfolien und der Zusammensetzung und der 3D-Zellgerüste bilden.
Um eindeutige gemustert Alginat Strukturen in kurzer Zeit zu bauen, sollten wir eine Vernetzung Prozess, der ausreichend steif Strukturen erstellen können, die komplexen Mikrostrukturen aus der Form zu halten, sowie Aufrechterhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen und den Stoffwechsel zu identifizieren. Wir haben ein Vernetzungsverfahren entwickelt, einschließlich eines Sol-Gel-Übergang, um ein Vernetzungsmittel mit einem Luftbefeuchter in der Form eines Nebels zu sprühen. Ohne diesen Vernetzungsverfahren können die Mikromaßstab Muster nicht in Form einer dünnen Hydrogel erzeugt Konstrukt mit der begrenzten Tiefe diffusive werden (100 - 200 um), die eine hohe Diffusionspermeabilität Metaboliten und Nährstoffen. Weiterhin, verglichen mit bestehenden diffusionsbasierten Verfahren, die erfordern 30 - 60 min, 18 - 20 das Vernetzungs timir war relativ kurz (3-5 min).
Darüber hinaus war es auch schwierig, die dünnen Hydrogelfolien, die nur in einem flüssigen Medium mechanisch stabil waren manipulieren. Wie in Abbildung 1 gezeigt, wurde die dünne Hydrogel-Struktur einfach und stabil gehandhabt und manipuliert mit einem Ende geschnitten herkömmlichen Tipp für transferal zwischen verschiedenen Kulturbedingungen. Verwendung Erzeugung und Manipulationstechniken, konnten wir nicht nur eine einschichtige Folie schwimmend für mögliche Anwendungen in der Wirkstoffassays, sondern auch mit gestapelter Mehrschichtstruktur zu schaffen, mit potentiellen Anwendungen als Gerüste für gewebeartige Konstrukte.
Mehrschichtigen Zellarchitekturen können durch Stapeln der modularen Single-Layer-Hydrogel-Blatt (3A) erzeugt werden. Jede modulare Hydrogelfolie können unterschiedliche Zelltypen enthalten und kann an unterschiedliche Kulturbedingungen ausgesetzt werden. Diese Mehrschicht-Konstrukte können dann selektiv Assem werdenblutete. Jedoch kann einfach stapeln Hydrogel Blätter Zellnekrose innerhalb der zusammengesetzten Struktur führen, wenn die Gesamttiefe der beschränkten diffusiv Tiefe (3C) überschreitet. Um dieses Problem zu überwinden, wäre es notwendig, den Mikromaschen Muster, wie Leberläppchens artige Maschen auszurichten, wenn die Mehrschicht Hydrogelfolien zusammengesetzt werden. Wir benötigen daher einen PDMS-Frame mit demselben Muster wie die Innengrenze der Hydrogelfolie, die gestapelten Hydrogel Blätter auszurichten. Somit könnte ausgerichtet mit Lochanordnung im montierten Mikromaschen Hydrogelfolien verwendet werden, um erweiterte Pipeline-Strukturen zu bilden, die Erleichterung effizienter Nährstofftransport zur verbesserten Lebensfähigkeit der Zellen (3B).
Eine Einschränkung dieses Verfahrens ist das Fehlen von Zell-Matrix-Wechselwirkungen in der Alginat-Hydrogels. Alginat kann keine Zelladhäsion Liganden für die in vivo-ähnliche Zell-Matrix-Wechselwirkungen; 21 Allerdings ist es auser mechanischen und geometrischen Effekte als 3D-Zell-Verkapselung Gerüst mit Zell-Zell-Interaktionen. Für Primärzellen und Stammzellen könnten Alginat folgenden Modifikation mit RGD-enthaltende Peptide, 21 oder in Kombination mit Collagen oder Gelatine verwendet werden. 14,18 weitere Einschränkung ist, dass, sobald die Zell eingebetteten Hydrogel Blätter mit geringer Zelldichte unter gefertigt 5 x 10 6 Zellen / ml konnte Konstruktion mehrschichtige Struktur schwach Befestigungen zwischen den Hydrogelfolien verursachen, da nur die Kante der Struktur ist durch Verwendung von zusätzlichen Alginat fixiert. Jedoch können die Schichten kompakt als Einzelgerüst über Drainagestruktur unter dem PDMS Rahmen gestapelt werden. Darüber hinaus könnte eine höhere Dichte von Zellen in der Hydrogel-Blätter auf der Oberfläche als auch innerhalb der Schicht nach einem Tag Kultur, die Befestigungen zwischen Schichten beitragen würde, wie in 3A gezeigt, zu proliferieren.
Die Hydrogelfolie fabricahier beschriebenen tion und Manipulationstechnik kann auf die in vitro-Kultursystemen und gewebeähnlichen Zellmodelle angepasst, um eine in vivo-artigen Mikroumgebung für Anwendungen, einschließlich Zellassays und Engineering künstlichen Organen bereitzustellen. Diese Technik könnte zur zellbasierten Medikamententests und biologische Studien, die geometrisch unterschiedliche 3D-Zell Mikro- und macroenvironments, dass verschiedene Zellen oder Hydrogel-Typen zu übernehmen erfordert angewendet werden.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 000000000001064291 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Powdered nonionic surfactant |
| Alginic acid sodium salt, low viscosity | Alfa Aesar | B25266 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Ultrasonic humidifier | MediHeim | MH-2800 | Modified equipment, Maximum sprayed rate: 250 ml/hr |
| Nylon net filter hydrofilic, 180 μm | EMD Millipore | NY8H04700 | |
| Polycarbonate mold | Customized mold for fabrication of a PDMS frame pattern |
References
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