Abstract
Idrogel possono essere modellati in micro-scala utilizzando tecnologie microfluidica o micropatterning di fornire un vivo like geometria tridimensionale dei tessuti (3D) in. I risultanti costrutti cellulari in 3D basato idrogel-sono stati introdotti come alternativa agli esperimenti sugli animali per studi biologici avanzati, saggi farmacologici e applicazioni trapianto di organi. Sebbene particelle, fibre a base di idrogel-possono essere facilmente realizzati, è difficile da manipolare loro per la ricostruzione del tessuto. In questo video, si descrive un metodo di fabbricazione dei fogli di idrogel alginato micropatterned, insieme al loro assemblaggio per formare un sistema di coltura cellulare 3D macro scala con un microambiente cellulare controllata. Utilizzando una forma di nebbia dell'agente gelificante calcio, fogli sottili idrogel si generino facilmente con uno spessore dell'ordine di 100 - 200 micron, e con microdisegni precise. Le cellule possono essere coltivate con la guida geometrica dei fogli in idrogelcondizioni freestanding. Inoltre, i fogli idrogel possono essere facilmente manipolati utilizzando una micropipetta con una punta fine-cut, e possono essere assemblati in strutture multistrato mediante sovrapposizione utilizzando un polidimetilsilossano modellata (PDMS) frame. Questi fogli idrogel modulari, che possono essere fabbricati con un processo facile, hanno potenziali applicazioni di test in vitro droga e di studi biologici, compresi studi funzionali di micro e macrostruttura e ricostruzione dei tessuti.
Introduction
Gli idrogel sono particolarmente promettenti biomateriali, e dovrebbero essere importante nella biologia di base, test farmacologici e la medicina. 1 Biofabrication di costrutti cellulari a base di idrogel-è stato suggerito di ridurre il ricorso alla sperimentazione animale, 2,3 sostituire tessuti trapiantabili, 4 e migliorare saggi cellulari. 5,6-contenenti acqua (idrocarburi) materiali viscoelastici (gel) permettono un gran numero di cellule da incapsulare e mantenuto in una struttura scaffold per controllare il microambiente cellulare 3D. In combinazione con la guida di tecnologie microfluidica o micropatterning, la geometria dei costrutti idrogel può essere controllata con precisione in scala cellulare. Fino ad oggi, una varietà di forme di idrogel, tra particelle, 7 - 9 fibre, 10 - 12 e fogli 13 - 15 sono stati utilizzati come unità edilizie in bottom-up approdolori alla fabbricazione di macro scala architetture multi-cellulari.
Entrambe le particelle e fibre a base di idrogel-sono stati prontamente e rapidamente realizzati per applicazioni come ambienti cellulari micro-scala, con controlli fluidici che utilizzano dispositivi microfluidici. Tuttavia, come le unità di base dei tessuti ingegnerizzati, sarebbe complicato di riordinarli e per allargare il loro volume come costrutti macro-scala. 16 E 'più difficile da raggiungere costrutti macro-scala per la produzione di moduli base micron dimensioni. Unità lastriforme di costrutti idrogel a base-possono essere utilizzati per aumentare il volume di scaffold tramite un semplice processo di assemblaggio. Consequentially, strati sovrapposti di fogli idrogel forniscono non solo un aumento volumetrico ma anche un'estensione geometrico in uno spazio 3D.
Abbiamo precedentemente riportato un metodo per fabbricare fogli idrogel micropatterned, 13 - 15 insieme al loro assemblaggio in multi-layarchitetture cellulari strati sovrapposti. La tecnica consente micropatterning complessa e modularità di costrutti cellulari tramite un processo di sovrapposizione di strutture multistrato. Attraverso la realizzazione di fogli impilati idrogel modulari, che sono micropatterned, un sistema di coltura cellulare 3D con un microambiente cellulare macroscala controllato può essere realizzato. Questo protocollo video descrive un metodo di fabbricazione semplice ma potente che può essere utilizzato per costruire fogli idrogel modulari, in base alla linea cellulare di carcinoma epatico umano (HepG2). Dimostriamo qui semplice manipolazione di questi fogli di idrogel modulari fantasia, ed il loro assemblaggio in una struttura a più livelli.
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Protocol
1. Preparazione del micropatterned Stampi e idrogel
- Produrre i modelli micro scala desiderati utilizzando SU-8 photoresist sulla superficie di un wafer di silicio mediante due fasi tecnica fotolitografia 15,17 standard per colata stampi PDMS. L'esempio illustrato utilizza un modello di rete fegato lobulo-like (Figura 1).
- Pesare PDMS e una soluzione di catalizzatore con un rapporto di 1: 5 (cioè, 12.5 g di PDMS e 2,5 g di induritore).
- Mescolare il 15 g della soluzione di fondo, degassare le bolle in una camera a vuoto, e poi diffondere la soluzione mista su una superficie micropatterned della fetta di silicio in modo uniforme in un piatto foil colata.
- Posizionare il wafer di silicio su una piastra riscaldata 65 ° C per 90 min su una superficie piana per curare le PDMS.
- Rimuovere le PDMS curate dal piatto di colata e il wafer di silicio.
- Tagliare i bordi delle PDMS e posizionarlo su una capsula di Petri da 100 mm di diametro conil lato micropatterned up.
- Lavare le PDMS curate micropatterned sulla capsula di Petri con il 70% di etanolo e acqua distillata per la sterilizzazione primario. Poi, asciugarle completamente per 10 minuti in forno a 65 ° C.
- Sciogliere e miscelare O / N 3 g di un tensioattivo non ionico in polvere in 100 ml di acqua distillata, creando un 3% (w / v) di rivestimento.
- Posizionare i PDMS micropatterned stampi in un pulitore plasma e pulirli per 1 min (85 W, 0,73 mbar) per creare una superficie idrofila, per facilitare l'aggiunta di liquidi acquosi. Poi, rivestire la superficie delle PDMS con la soluzione di 100 ml di tensioattivo per almeno 3 ore (ORO / N) utilizzando un bilanciere di laboratorio.
- Lavare la soluzione di tensioattivo dagli stampi PDMS e asciugare completamente in forno a 65 ° C per 10 min. Poi, sterilizzare ogni stampo micropatterned da esposizione a raggi ultravioletti (UV) oltre 30 min.
2. Preparare la sospensione cellulare in un idrogel Precursore
- Apreparare idrogel precursore, sciogliere 0,1 g di alginato di sodio in polvere a 10 ml di tampone fosfato salino (PBS), creando un 1% (w / v) precursore alginato. Per sciogliere completamente la polvere, incubare e mescolarle O / N.
- Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,22 micron collegato ad una siringa da 1 ml.
- Cultura le cellule HepG2 in modificata mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino e 1% di penicillina-streptomicina su un piatto di coltura di tessuto convenzionale fino 70% - 80% di confluenza in 5% CO 2 incubatore umidificato a 37 ° C .
- Lavare le cellule una volta con PBS, e quindi trypsinize aggiungendo 1 ml di 0,05% tripsina-EDTA per 4 minuti in un incubatore umidificato CO 2 5% a 37 ° C. Centrifugare le cellule raccolte dalla piastra di coltura a 250 xg per 3 min e risospendere con 1 ml di PBS dopo la rimozione del supernatante.
- Contare il numero di cellule singole distribuite in PBS usando una cella automatizzatacontatore.
- Dopo centrifugazione a 250 xg per 3 min e la rimozione PBS, aggiungere 1 ml di 1% (w / v) di una soluzione di alginato di sodio al restante pellet e mescolare delicatamente con pipettamento. La densità di semina finale delle cellule dovrebbe essere di 5 x 10 6 - 10 7 cellule / ml. Incubare la sospensione cellulare / idrogel in 5% CO 2 incubatore umidificato a 37 ° C.
3. Caricamento e Cross-linking di cellule / Hydrogel Suspension
- Sciogliere 1,47 g di cloruro di calcio disidratare in 100 ml di DDH 2 O per produrre un reagente di reticolazione (ad esempio, 100 mM CaCl 2 · 2H 2 O in DDH 2 O).
- Risciacquare l'interno di un umidificatore con trasduttore ultrasonico utilizzando 70% di etanolo, e riempirlo con 200 ml di reagente di reticolazione. L'umidificatore è largo 110 mm, 300 mm di lunghezza e 170 mm di profondità (ovvero 110 mm x 300 mm x 170 mm (L x A x P)).
- Posizionare il PDMS micropatternedstampi in un pulitore plasma e pulirli per 1 min a 85 W per creare una superficie idrofila.
- Caricare progressivamente 7,2 ml di sospensione cellulare / idrogel ben miscelato sul bordo del micropattern nello stampo. L'esempio illustrato utilizza un modello di rete fegato lobulo-like (Figura 1). Il volume della sospensione dipende dal modello topografico.
- Per raggiungere gelificazione della sospensione cellulare / idrogel, accendere l'umidificatore e verificare che l'umidificatore produce una nebbia del reagente di reticolazione. Spruzzare il reagente di reticolazione sul precursore idrogel per 5 min, coprendo la superficie topografica degli stampi PDMS in un intervallo di 5 cm.
Nota: Le distanze più lunghe e più breve di 5 cm possono causare la gelificazione incompleta e irregolare, rispettivamente. Assicurarsi che l'umidificatore ha un tasso di spruzzatura di 250 ml / h, producendo 20 ml di nebbia del reagente di reticolazione in 5 min. - A seguito del processo di cross-linking, spegnere l'umidificatore e riempire il mo PDMSlds con PBS.
4. Trattamento delle fogli singoli modulare idrogel
- Staccare ogni foglio idrogel indurito dagli stampi micropatterned via pipettando PBS delicatamente intorno al foglio di idrogel con un puntale 200 l.
- Pick up ogni foglio idrogel mobile usando un 1.000 ml fine punta della pipetta end-cut. Ogni maglia foglio idrogel lobulo-come il fegato ha dimensioni di 8 millimetri x 8,7 millimetri, ed essere 100 - 200 micron di spessore.
- Trasferire un singolo strato di foglio idrogel in 1 ml di DMEM in un 12-pozzetti, e coltivare le cellule in vitro in modo flottante usando l'idrogel costrutto come componente unità della 12-pozzetti più di una settimana in un 5 % di CO 2 umidificata incubatore a 37 ° C. Sostituire il terreno di coltura ogni altro giorno.
5. Fogli idrogel Assemblea di Sovrapposizione
- Ripetere i passaggi 1,1-1,5 per produrre un telaio PDMS con dimensioni di 18 millimetri x 18 mm x 4 mm (L xH x D), e che contiene strutture 170 micron-alto pilastro sulla superficie inferiore. Utilizzare 42 g della miscela di PDMS e agente reticolante, con lo stesso rapporto come al punto 1.2. Mettere uno stampo di policarbonato specializzata sul wafer di silicio per il telaio PDMS per creare un telaio interno con dimensioni di 8 millimetri x 9 mm x 2 mm (L x A x P).
- Sterilizzare telaio PDMS e 180 micron-pori carte da filtro nylon sommerso in acqua distillata e pinzette in autoclave per 15 minuti a 121 ° C.
- Posizionare il telaio PDMS sterilizzato su un quarto di un pezzo di carta da filtro in nylon (con un diametro di 5 cm) in una capsula di Petri del diametro di 60 mm.
- Trasferire un foglio idrogel modulare nell'interno del telaio PDMS utilizzando un 1.000 microlitri punta della pipetta fine taglio. I fogli idrogel utilizzati per l'assemblaggio devono essere coltivati per almeno un giorno dopo che sono state fabbricate.
- Allineare il bordo di ciascun foglio idrogel modulare con il telaio PDMS utilizzando un puntale 200 microlitri vuoto.
- Ripetere i punti 5.4 e 5.5 utilizzando fogli di idrogel modulari in modo da formare una pila di 4 - 6 strati.
- Rimuovere il mezzo di coltura da fluisce fuori attraverso le strutture pilastro nella parte inferiore del telaio PDMS. Poi aggiungere 2 ml di soluzione di alginato (2% w / v) ad un angolo del costrutto multistrato.
- Spray una nebbia del reagente reticolazione per 30 sec sul costrutto multistrato per fissare i bordi di ogni strato con quelli di un altro. Utilizzare 2 ml di nebbia del reagente di reticolazione (ad una velocità di 250 ml di spruzzatura / hr).
- Sciacquare il costrutto multistrato delicatamente con 400 microlitri DMEM e rimuovere il telaio PDMS con una pinzetta.
- Rimuovere il costrutto multistrato dalla carta da filtro strofinando delicatamente con una cella sollevatore dopo l'aggiunta di 4 ml di DMEM.
- Trasferire il multistrato costruire ad una piastra da 6 pozzetti contenente 3 ml di DMEM con carta da filtro, e coltivare le cellule in vitro in modo flottante, con l'idrogel come costruttoun'impalcatura cellulare multi-scala nella piastra da 6 pozzetti più di una settimana in un 5% CO 2 incubatore umidificato a 37 ° C. Sostituire il terreno di coltura ogni altro giorno.
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Representative Results
Abbiamo descritto la fabbricazione e la manipolazione di fogli di idrogel freestanding cellulari. Come mostrato in figura 1, abbiamo inventato PDMS micropatterned stampi, e idrogel contenenti cellule è stato caricato sulla superficie idrofila di questi stampi e reticolato utilizzando un umidificatore per generare una nebbia aerosol di agente gelificante. Dopo il rilascio dagli stampi, cellule HepG2 sono state coltivate in autoportante fogli idrogel con vari modelli (Figura 2). Pertanto, i fogli idrogel sottili fornito un ambiente coltura 3D. Inoltre, i fogli idrogel modulari possono essere assemblati stratificando i fogli con una micropipetta con una punta fine taglio, e utilizzando un telaio PDMS, che consente 3D coltura cellulare macro-scala (figura 3).
Figura 1. Flusso Chart Mostrando la fabbricazione di un foglio di idrogel e fogli di idrogel multistrato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. coltura cellulare autoportante 3D in vari fogli idrogel. Il metodo di fabbricazione di spruzzare reticolazione reagente enabled patterning preciso di idrogel alginato al micro-scala. Inoltre, i fogli idrogel fabbricate potrebbero essere raccolte da stampo e manipolati facilmente in condizioni autoportanti. Cellule HepG2 sono stati modellati e coltivate in un foglio di idrogel piatta (A), fogli di idrogel con pilastri esagonali (B), di maglia (C), fegato maglia lobulo-like (D), una serie di fori (E), e multiple microfibre microcomb-like (F). Le barre di scala sono i seguenti:. 500 micron (A, D, F), 100 micron (B, C), e 2 mm (E) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Montaggio di micropatterned fogli idrogel per la Macro-scala cellulare costrutti. Vari tipi di foglio idrogel potrebbe essere montata tramite layer-by-sovrapposizione dei livelli di allineamento, tra cui l'assemblaggio di cinque fogli di idrogel che contengono cellule HepG2 macchiato di fluorescenza verde e le cellule NIH3T3 colorate con fluorescenza rossa (A). Un insieme di fogli di idrogel micropatterned con struttura a pipeline espanso (B), a condizione superiore cella vitalità than quella di fogli di idrogel non fantasia (C) dopo 7 giorni. La vitalità è stata valutata mediante colorazione cellule HepG2 con calceina-AM (cellule vive indicato come verde) e etidio omodimero-1 (cellule morte indicati in rosso). Bar Scala:. 500 micron (A) e 200 micron (B, C) Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo protocollo fornisce un semplice metodo per fabbricare fogli idrogel modulari, e loro assemblaggio per formare scaffold cellulari 3D.
Per costruire strutture alginato modellata chiare in breve tempo, dobbiamo identificare un processo di reticolazione che può creare strutture sufficientemente rigido per mantenere le microdisegni complessi dallo stampo, così come mantenere la vitalità delle cellule e il metabolismo. Abbiamo sviluppato un processo di cross-linking, compresa una transizione sol-gel, per spruzzare un reagente di reticolazione utilizzando un umidificatore nella forma di una nebbia. Senza questo processo di reticolazione, i modelli di micro-scala non potrebbe essere generato nella forma di un idrogel sottile costruire con la limitata profondità diffusiva (100 - 200 micron), che ha alta permeabilità diffusiva metaboliti e nutrienti. Inoltre, rispetto ai metodi basati diffusione esistenti, che richiedono 30 - 60 min, 18 - 20 il ti di reticolazionemi è stato relativamente breve (3-5 minuti).
Inoltre, è stato anche difficile da manipolare i fogli idrogel sottili, che erano meccanicamente stabile solo in un mezzo liquido. Come mostrato in figura 1, la struttura idrogel sottile era semplicemente e stabilmente gestito e manipolato con una punta convenzionale end-taglio transferal tra diverse condizioni di coltura. Utilizzando tecniche di generazione e manipolazione, potremmo fornire non solo un foglio monostrato in modo galleggiante per potenziali applicazioni nei test di droga ma strutture multistrato anche sovrapposti, con potenziali applicazioni come scaffolds per costrutti di tessuto-like.
Architetture cellulari multistrato possono essere generati da impilare i fogli idrogel monostrato modulari (Figura 3A). Ogni foglio idrogel modulare può contenere diversi tipi di cellule, e può essere esposto a diverse condizioni di coltura. Questi costrutti multistrato possono poi essere Assem selettivamentedissanguato. Tuttavia, semplicemente impilamento fogli idrogel possono portare a necrosi delle cellule all'interno della struttura assemblata quando la profondità totale supera la limitata profondità diffusiva (Figura 3C). Per superare questo problema, sarebbe necessario allineare modelli microrete, come fegato maglie lobulo simile, quando i fogli idrogel multistrato vengono assemblati. Abbiamo quindi bisogno di un telaio PDMS con lo stesso modello interno come il bordo del foglio idrogel per allineare i fogli di idrogel impilati. Così, allineati microdisegni hole-matrice nei fogli idrogel maglie assemblati potrebbero essere utilizzati per formare strutture espanse gasdotti, facilitando il trasporto dei nutrienti più efficiente per migliorare la vitalità cellulare (Figura 3B).
Una limitazione di questa tecnica è l'assenza di interazioni cellula-matrice nella idrogel alginato. Alginato non può fornire ligandi di adesione cellulare per vivo -come interazioni cellula-matrice a, 21 tuttavia, fa fuorier effetti meccanici e geometrici come impalcatura cellulare incapsulare 3D con interazioni cellula-cellula. Per le cellule primarie e staminali, alginato potrebbe essere utilizzato seguente modifica con peptidi contenenti RGD-21, o in combinazione con il collagene o gelatina. 14,18 Un'altra limitazione è che, una volta che i fogli idrogel cellule-embedded sono fabbricati con bassa densità cellulare sotto 5 x 10 6 cellule / ml, la costruzione della struttura multistrato potrebbero causare allegati deboli tra i fogli di idrogel perché solo il bordo della struttura è fissata per mezzo di alginato aggiuntivo. Tuttavia, i livelli possono essere impilati in modo compatto come un'unica struttura impalcatura via di drenaggio sotto il telaio PDMS. Inoltre, una maggiore densità di cellule nei fogli idrogel potrebbe proliferare sulla superficie e all'interno dello strato dopo coltura un giorno, che contribuirebbe allegati tra strati come illustrato nella Figura 3A.
La fabrica foglio di idrogelzione e manipolazione tecnica qui descritta può essere adattato per i sistemi di coltura in vitro e modelli cellulari di tessuto simile per fornire un vivo -come microambiente in per le applicazioni, comprese analisi cellulari e ingegneria organi artificiali. Questa tecnica potrebbe essere applicata a dosaggi di farmaci a base di cellule e studi biologici che richiedono geometricamente diverso micro cellulare 3D e macroenvironments che incorporano varie cellule o tipi di idrogel.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 000000000001064291 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Powdered nonionic surfactant |
| Alginic acid sodium salt, low viscosity | Alfa Aesar | B25266 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C7902 | |
| Ultrasonic humidifier | MediHeim | MH-2800 | Modified equipment, Maximum sprayed rate: 250 ml/hr |
| Nylon net filter hydrofilic, 180 μm | EMD Millipore | NY8H04700 | |
| Polycarbonate mold | Customized mold for fabrication of a PDMS frame pattern |
References
- Hoffman, A. S.
- Lan, S., Starly, B. Alginate based 3D hydrogels as an in vitro co-culture model platform for the toxicity screening of new chemical entities. Toxicol. Appl. Pharm. 256 (1), 62-72 (2011).
- Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. 3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels. Biomaterials. 32 (31), 7905-7912 (2011).
- Lim, F., Sun, A. M. Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas. Science. 210 (4472), 908-910 (1980).
- Koh, W. G., Itle, L. J., Pishko, M. V. Molding of hydrogel microstructures to create multiphenotype cell microarrays. Anal. Chem. 75 (21), 5783-5789 (2003).
- Xu, Y., et al. A Microfluidic Hydrogel Capable of Cell Preservation without Perfusion Culture under Cell-Based Assay Conditions. Adv Mater. 22 (28), 3017-3021 (2010).
- Um, E., Lee, D. S., Pyo, H. S., Park, J. K. Continuous generation of hydrogel beads and encapsulation of biological materials using a microfluidic droplet-merging channel. Microfluid. Nanofluid. 5 (4), 541-549 (2008).
- Lee, D. H., Lee, W., E, U. m, Park, J. K. Microbridge structures for uniform interval control of flowing droplets in microfluidic networks. Biomicrofluidics. 5 (3), 034117 (2011).
- Lee, D. H., Bae , C. Y., Han, J. I., Park, J. K. In situ analysis of heterogeneity in the lipid content of single green microalgae in alginate hydrogel microcapsules. Anal. Chem. 85 (18), 8749-8756 (2013).
- Yamada, M., Sugaya, S., Naganuma, Y., Seki, M. Microfluidic synthesis of chemically and physically anisotropic hydrogel microfibers for guided cell growth and networking. Soft Matter. 8 (11), 3122-3130 (2012).
- Yamada, M., et al. Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions. Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).
- Onoe, H., et al. Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions. Nat. Mater. 12 (6), 584-590 (2013).
- Lee, W., Son, J., Yoo, S. S., Park, J. K. Facile and Biocompatible Fabrication of Chemically Sol−Gel Transitional Hydrogel Free-Standing Microarchitectures. 12 (1), 14-18 (2011).
- Lee, W., et al. Cellular hydrogel biopaper for patterned 3D cell culture and modular tissue reconstruction. Adv. Healthcare Mater. 1 (5), 635-639 (2012).
- Bae, C. Y., Min, M. K., Kim, H., Park, J. K. Geometric effect of the hydrogel grid structure on in vitro formation of homogeneous MIN6 cell clusters. Lab Chip. 14 (13), 2183-2190 (2014).
- Bruzewicz, D. A., McGuigan, A. P., Whitesides, G. M. Fabrication of a modular tissue construct in a microfluidic chip. Lab Chip. 8 (5), 663-671 (2008).
- Choi, S., Park, J. K. Two-step photolithography to fabricate multilevel microchannels. Biomicrofluidics. 4 (4), 046503 (2010).
- Lee, B. R., et al. In situ formation and collagen-alginate composite encapsulation of pancreatic islet spheroids. Biomaterials. 33 (3), 837-845 (2012).
- Cabodi, M., Choi, N. W., Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Bonassar, L. J., Stroock, A. D.
- Choi, N. W., Cabodi, M., Held, B., Gleghorn, J. P., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. Microfluidic scaffolds for tissue engineering. Nat. Mater. 6 (11), 908-915 (2007).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
